2022, Vol. 43
2. 清华大学深圳国际研究生院, 深圳 518055;
3. 西安清科智联环境科学研究院有限公司, 西安 710000;
4. 西安石油大学化学化工学院, 西安 710000
, ZUO Jian-e1,2
, LI Jin-bo1 , ZHANG Yan-yan1 , AI Xiang3 , GONG Da-hui3 , ZHANG Ji-wen3 , SUN Ding-ming4
2. Tsinghua Shenzhen International Graduate School, Shenzhen 518055, China;
3. Qingke Zhilian Environmental Science Research Institute Co., Ltd., Xi'an 710000, China;
4. School of Chemistry and Chemical Engineering, Xi'an Shiyou University, Xi'an 710000, China
微塑料是一类广泛存在于自然环境中的新兴污染物, 通常是指直径 < 5 mm的塑料颗粒、纤维和薄膜等[1~4].近些年微塑料对水系的污染问题已经演变成全球性问题, 不少研究者在多种水生动物体内检测出微塑料. Wang等[5]在北江和珠江三角洲的肉食性鱼类体内平均检测出每条鱼3.5个和3.0个微塑料, 杂食性鱼类体内分别检测出每条鱼6.8个和6.2个微塑料; Mohsen等[6]调查了中国渤海和黄海养殖海参摄入微塑料的情况, 海参个体中最多检测出19个微塑料颗粒; 鄱阳湖典型区铜锈环棱螺体内的微塑料丰度最高为(2.48±0.90)个·g-1, 赣江入湖口铜锈环棱螺体内微塑料丰度高于其他入湖口[7].
微塑料对水生动物的影响和危害已引起全世界的广泛关注.鱼类是最常见的水生动物, 以鱼类作为研究对象具有现实意义.有研究发现微塑料进入鱼体内后, 会影响其生长、代谢和各类器官功能[8~13].赵佳等[14]的研究发现微塑料会在斑马鱼幼鱼肠道中累积, 微塑料的粒径越小, 越容易在肠道累积.Jabeen等[15]研究了纤维状、颗粒状和碎片状微塑料对金鱼的影响, 结果表明暴露试验后金鱼出现了严重的肝脏和肠道损伤.不仅如此, 微塑料对鱼类肠道微生物具有较大影响, 导致鱼类肠道菌群紊乱, 增加某些炎症和疾病发生的风险[16~19].此外, 微塑料在水生动物体内富集, 会通过食物链传递转移给人类, 对人类健康造成潜在威胁[20~24].
微塑料进入鱼体内包括水源暴露和食源暴露两种途径.水源暴露是指微塑料经过鱼鳃进入鱼体, 进而对其呼吸系统造成影响; 食源暴露是指鱼类吞食表面附着了微塑料的食物, 微塑料直接进入其胃肠道[25~28].目前国内外关于微塑料对鱼类的影响研究较少且多集中于水源暴露.此外, 为便于检测微塑料进入鱼体内的位置和数量, 大多数研究以荧光微球作为水源暴露的污染源, 但荧光微球类的微塑料很少存在于自然环境中, 其研究结果可能与实际环境中微塑料对鱼类的影响有所不同; 而食源暴露可以通过喂食量计算出鱼类的微塑料摄入量, 在一定程度上可以解决这一难题[25].
鲫鱼是我国最常见的淡水鱼之一, 广泛存在于河流湖泊等水体中, 与人类关系密切.本文以鲫鱼为研究对象, 以工业制成的聚丙烯粉末作为暴露源, 通过30 d的微塑料食源暴露试验, 分析微塑料对鲫鱼生长、肝脏损伤和肠道微生物组成的影响, 深入了解并探究较长时期微塑料对鱼类的综合影响.
1 材料与方法 1.1 试验鱼的购买和养殖体重身形大致相同[身长: (4.77±1.21)cm; 体重: (7.91±0.35)g]的健康鲫鱼购于西安当地水族馆, 暴露试验开始前预先在实验室养殖14 d, 每天喂食适量的成品饲料1次.采用玻璃鱼缸养殖鲫鱼, 24 h不间断曝气, 保持水中溶解氧(DO)>8.0 mg·L-1.环境温度为(25±1)℃, 光照周期为14 h(光)∶10 h(暗).
1.2 主要试剂磷虾粉和食品级拉丝粉购于西安当地水族馆.生理盐水(NaCl, 0.9%)、多聚甲醛固定液(PFA, 4%)、乙醇(C2H5OH, 75%)和二甲苯(C8H10, ≥ 9.0%)购于阿拉丁试剂有限公司; 聚乙烯微塑料粉末(polyethylene microplastics, PE-MPs)和丁香酚(C10H12O2, ≥ 99.0%)购于北京瑞耀科技有限公司; 苏木精-伊红(HE)染色试剂盒购于北京双智科技有限公司.
1.3 试验方法 1.3.1 试验设计设置空白组为对照组, 喂食不含微塑料的普通鱼食; 设置低浓度组、中浓度组和高浓度组为试验组, 分别喂食含有低浓度、中浓度和高浓度的微塑料鱼食.每个试验组3个鱼缸, 每个鱼缸10尾鲫鱼.鱼缸大小为长×宽×高=60 cm×60 cm×50 cm.采用曝气24 h脱氯后的水每隔1 d换水一次, 每个鱼缸的换水量不超过总水量的1/3, 吸取鱼缸底部残留粪便以保证鱼缸水质清洁.每日09:00和17:00各喂食1次, 每次每缸喂食0.67 g.其他养殖环境和条件与1.1节相同.
1.3.2 鱼食的制作将一定量的磷虾粉、食品级拉丝粉、PE-MPs和超纯水分别加入到500 mL烧杯中, 搅拌均匀后采用小型不锈钢饲料机(梓晴, 中国)将混合物制作成颗粒鱼食, 室温下放置过夜使其自然风干(超纯水不计入摄入量).不同鱼食的物料配比以及每组鲫鱼的微塑料摄入量如表 1所示. Ašmonaite等[29]以10 mg MPs作为每天每条鱼的摄入量研究微塑料对虹鳟鱼肠道运输的影响.为研究不同微塑料浓度对鲫鱼的影响, 本试验根据已有研究并设置低浓度组、中浓度组和高浓度组这3个微塑料暴露浓度, 分别(以PE-MPs计)为6.38、12.18和22.33 mg·(鱼·d)-1.
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表 1 鱼食的物料配比及微塑料摄入量 Table 1 Material ratio of fish food and intake of microplastics |
1.4 检测方法和数据处理 1.4.1 PE-MPs的表征
采用激光粒度仪(LS13320, Beckman, 美国)测定PE-MPs的粒径分布, 粒径检测范围为0~2 000 μm; 采用扫描电镜SEM(GEMINISEM 500, 蔡司, 德国)观察PE-MPs的表面形貌.
1.4.2 身长和体重测量试验开始前随机选取20尾鲫鱼测量其身长和体重; 试验结束后从每个试验组中随机选取9尾鲫鱼(即从每个平行鱼缸中随机选取3尾鲫鱼)再次测量其身长和体重, 测量后将鲫鱼放回原鱼缸.
1.4.3 肝脏组织学分析从每个试验组中随机选取9尾鲫鱼(即从每个平行鱼缸中随机选取3尾鲫鱼), 丁香酚麻醉完全后用75%的乙醇擦拭鲫鱼表面进行消毒, 在无菌环境下解剖并完整地取出其肝脏, 用生理盐水冲洗肝脏表面后立即放入4%的多聚甲醛中固定过夜后, 委托西安21世纪生物科技有限公司进行肝脏组织学的检测.大致经过冲洗、梯度浓度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片和HE染色等步骤, 最终得到HE染色肝脏切片, 并在体视显微镜(TS-200B, SDPTOP, 中国)下观察切片[15, 30].
1.4.4 肠道微生物组成检测从每组中随机选取15尾鲫鱼(即从每个平行鱼缸中随机选取5尾鲫鱼), 解剖步骤与1.4.3节相同, 完整取出其肠道.用生理盐水冲洗出鲫鱼肠道内容物, 并将相同鱼缸中冲洗出的鲫鱼肠道内容物混合放置于10 mL离心管中, 作为一个平行.设置离心机的转速为8 000 r·min-1, 时间15 min, 离心后在无菌环境下取出沉淀物置于2 mL无菌离心管中, 液氮速冻后立即送至西安21世纪生物科技有限公司进行鲫鱼肠道高通量的委托测试.大致过程如下: 使用FastDNA® SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals, 美国)试剂盒提取肠道内容物微生物的总DNA; 通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性, 并通过Nanodrop 2000(10x Genomics, 美国)和Qubit3.0分光光度计(Thermo Fisher Scientific, 美国)检测基因组DNA的浓度和纯度; 用引物341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)扩增16S rRNA基因Ⅴ3-Ⅴ4区, 最后采用Illumina NovaSeq 6000测序仪(Illumina, 美国)上机测序[31].
1.4.5 数据处理及分析本试验采用SPSS 19.0进行数据处理及单因素方差分析(One-Way ANOVA), 使用Origin 2020进行图表绘制.
2 结果与分析 2.1 PE-MPs的表征采用激光粒度仪和扫描电镜对PE-MPs进行表征.PE-MPs的粒径分布如图 1(a)所示, PE-MPs粉末主要位于0~300 μm的粒径区间内. d10和d90是衡量粉末粒径分布的主要指标, 表示小于该粒径的颗粒体积分别占到总体积的10%和90%.由图 1(a)可知, PE-MPs粉末中约有10%的微塑料粒径 < 6.85 μm, 90%的微塑料粒径 < 56.08 μm.PE-MPs粉末的形状为略带棱角的球形或椭球形, 大小分布相对均匀[图 1(b)].
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(a) PE-MPs的粒径分布，(b) PE-MPs的表面形貌 图 1 PE-MPs的表征 Fig. 1 Characterization of PE-MPs |
本试验前后分别测量鲫鱼的身长和体重, 观察鲫鱼的生长变化.如图 2(a)所示, 各试验组中鲫鱼的身长均没有显著差异.由图 2(b)可知, 试验前鲫鱼的平均体重为4.74 g, 试验后对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组中鲫鱼的平均体重均有所增长, 分别为5.92、6.20、4.97和5.59 g.与对照组相比, 低浓度组的鲫鱼体重增加4.73%, 中浓度组和高浓度组中的鲫鱼体重分别降低16.05%和5.57%, 但与对照组均无显著差异.
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图 2 喂食含有不同浓度微塑料鱼食的鲫鱼生长情况 Fig. 2 Growth change of crucians fed with fish food containing different concentrations of microplastics |
肝脏是动物体重要的排毒器官[15].图 3进行了对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组的鲫鱼肝脏组织学分析, 便于了解其肝脏损伤和健康状况, 其中黑色、绿色、黄色、蓝色和红色三角分别表示胰腺、肝细胞、有核红细胞、白细胞和黑色素巨噬细胞中心.从中可知, 对照组鲫鱼的肝脏组织结构正常, 肝细胞胞核较大, 可见粉红色胞浆, 各类细胞排列整齐紧密, 腺泡结构正常; 低浓度组鲫鱼的肝脏组织结构基本正常, 胰腺可见大量嗜酸性酶原颗粒; 中浓度组的鲫鱼肝脏组织结构轻度异常, 细胞排列较为整齐, 黑色素巨噬细胞中心数量减少(红色三角); 高浓度组鲫鱼肝脏组织结构重度异常, 细胞排列疏松, 间隙增大(绿色三角), 可见大量空泡(橘色三角), 黑色素巨噬细胞中心数量急剧减少(红色三角).
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黑色三角表示胰腺, 绿色三角表示肝细胞, 黄色三角表示有核红细胞, 蓝色三角表示白细胞, 红色三角表示黑色素巨噬细胞中心, 橘色三角表示空泡; (a)和(b)表示不同放大倍数的肝脏切片, (a1)~(a4)和(b1)~(b4)依次表示对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组 图 3 喂食含有不同浓度微塑料鱼食的鲫鱼肝脏组织学分析 Fig. 3 Liver histology of crucians fed with fish food containing different concentrations of microplastics |
图 4给出了喂食不同浓度微塑料的试验组中鲫鱼肠道微生物的变化情况.选择相对丰度较高且具有代表性的4种门水平细菌进行分析, 结果表明变形菌门、梭杆菌门、厚壁菌门和拟杆菌门是对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组的优势菌种.由图 4(a)可知, 对照组鲫鱼肠道中梭杆菌门的相对丰度最高, 为46.14%; 变形菌门是低浓度组鲫鱼肠道中的最主要菌种, 占比为66.69%, 且与对照组相比具有显著差异(P < 0.05); 中浓度组鲫鱼肠道中厚壁菌门的相对丰度明显高于其他组(P < 0.05); 拟杆菌门在不同试验组鲫鱼肠道中的相对丰度呈现出一定的下降趋势.由图 4(b)可知, 在属水平上, 对照组和中浓度组鲫鱼肠道中占比最大的是鲸杆菌属; 与对照组相比, 中浓度组鲫鱼肠道中葡萄球菌属的相对丰度显著增加(P < 0.05); 劳尔氏菌属在不同试验组中的占比均明显高于对照组, 但拟杆菌属的相对丰度略有下降.
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*P < 0.05表示具有显著差异 图 4 鲫鱼肠道微生物组成的变化 Fig. 4 Change in the microbiome composition in crucian gut |
α多样性指数可以通过Observed species、Chao1、Shannon和Simpson指数进行比较分析.Observed species和Chao1指数用于估计样本中的物种总数, 数值越大表示物种丰富度越高; 类似地, Shannon指数越大, Simpson指数越小说明物种多样性越高.由图 5可知, 以上4个指数的分析结果表明高浓度组鲫鱼肠道中的微生物多样性最高, 而对照组、低浓度组和中浓度组的菌种丰富度之间没有明显差异.图 6是不同试验组的主成分分析(PCoA)结果, 从中可知对照组与中浓度组鲫鱼肠道的菌种种类最为相似, 低浓度组和高浓度组与对照组的差异较大.
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图 5 鲫鱼肠道微生物的α多样性分析 Fig. 5 Analysis of α diversity in the gut microbiome of crucians |
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图 6 主成分分析PCoA Fig. 6 Principal coordinate analysis (PCoA) |
目前微塑料对鱼类的生长影响研究较少, 鱼类的生长主要可用身长和体重进行评估.Yin等[32]的研究将聚苯乙烯(polystyrene, PS)荧光微塑料加入鱼缸中, 结果发现相比于对照组, 14 d和21 d的暴露试验后黑鲪鱼的生长速率显著降低; Zhang等[19]研究了2、10和200 μm的PS微塑料对青鳉鱼的生长影响, 结果发现青鳉鱼的身长没有明显变化, 但体重有较明显的增加.此外, 还有一些研究发现微塑料对鱼类的生长没有显著影响[17, 33].本研究中微塑料的食源暴露试验对鲫鱼的身长改变并不显著, 但鲫鱼的体重具有较明显变化.与对照组相比, 低浓度组中的鲫鱼体重有所增加, 但中浓度和高浓度组中鲫鱼的生长速率有所下降, 体重明显减小.这说明在短期暴露中, 低浓度的微塑料鱼食对鲫鱼的生长具有一定促进作用, 随着鱼食中微塑料含量的增加, 鲫鱼的体重均有所下降, 微塑料会抑制鲫鱼的生长.
肝脏作为生物体的重要排毒器官, 可用于评估微塑料对鱼类的毒性影响[9, 15, 34].Rochman等[9]研究了微塑料和污染物对青鳉鱼的复合影响, 结果表明试验组中青鳉鱼出现了严重的肝脏损伤现象.在本研究中, 微塑料食源暴露试验30 d后, 与对照组相比, 低浓度组的鲫鱼肝组织基本正常, 中浓度组和高浓度组的鲫鱼肝脏中黑色素巨噬细胞中心急剧减少.黑色素巨噬细胞中心对生物体内各种物质的再循环和降解具有重要作用, 其数量减少意味着出现了一定的肝脏损伤[35].不仅如此, 高浓度组的鲫鱼肝脏出现了较大空泡, 肝脏损伤最为严重.
肠道微生物菌群的平衡对人类和动物的健康具有重要的指示作用, 肠道菌群的紊乱可能会增加炎症和疾病发生的风险[16, 18, 36, 37].本研究选择具有代表性的4种门水平细菌, 分别是变形菌门、梭杆菌门、厚壁菌门和拟杆菌门.有研究表明, 变形菌门包括沙门氏菌和霍乱弧菌等病原菌, 较高丰度的变形菌门会引起肠道微生物的紊乱并危害宿主健康[38, 39].低浓度组和高浓度组的鲫鱼肠道中变形菌门的相对丰度分别是对照组的2.93倍和4.47倍, 说明低浓度组和高浓度组中的鲫鱼肠道微生物出现较明显的紊乱现象, 可能会危害鲫鱼的健康并影响其正常生长.低浓度组、中浓度组和高浓度组的梭杆菌门丰度均有明显下降, 这可能预示着鲫鱼体内维生素的缺乏[40].通常认为厚壁菌门的增加和拟杆菌门的减少与肥胖症有关[39, 41].与对照组相比, 低浓度组中的鲫鱼体重具有明显增长, 与上述2种菌群的变化趋势相印证, 说明低浓度组的鲫鱼患肥胖症的概率增加.另外, 尽管中浓度组的鲫鱼肠道中厚壁菌门和拟杆菌门也有类似的变化趋势, 但在30 d的试验时间内其体重反而有所下降.值得注意的是高浓度组中微生物的群落变化没有低浓度组和中浓度组显著, 这可能是因为该组鱼食中的微塑料浓度较高, 易团聚, 鲫鱼通过粪便排出大部分微塑料颗粒, 因此影响程度不及低浓度和中浓度组.今后的研究中应增加平行组和暴露时间, 深入分析微塑料进入鲫鱼体内消化道中的残留情况, 以期更加全面地研究鱼类生长和肠道微生物菌群的关系.
在属水平上, 鲸杆菌属是淡水鱼肠道中的优势菌种, 可产生维生素B12等营养物质, 对鱼类的生长发育具有重要作用[42, 43].与对照组相比, 低浓度组、中浓度组和高浓度组鲫鱼肠道中鲸杆菌属的相对丰度明显下降, 说明微塑料暴露试验后, 鲫鱼的生长受到了不利影响.此外, 试验组鲫鱼肠道中的葡萄球菌属和劳尔氏菌属的相对丰度显著增加, 这2种菌属是典型的致病菌, 说明鲫鱼肠道出现了感染发炎等症状, 与上述结论相互佐证[39, 43~45].PCoA分析的结果显示, 对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组鲫鱼肠道中的微生物菌群有较明显的聚类特征, 并且高浓度组鲫鱼肠道中微生物菌群的种类最多.以上结果说明微塑料的食源暴露试验之后, 鲫鱼的肠道微生物组成发生显著变化, 微塑料的存在增加了鲫鱼的疾病发生风险, 对鲫鱼具有一定的负面影响.
4 结论(1) 与对照组相比, 微塑料暴露试验后各试验组中鲫鱼的身长没有明显变化, 但低浓度组的鲫鱼体重明显增加, 中浓度和高浓度组的鲫鱼体重有所下降.
(2) 中浓度组和高浓度组的鲫鱼均出现了不同程度的肝脏损伤, 高浓度组的肝脏损伤最为严重.
(3) 微塑料暴露试验组中鲫鱼肠道微生物的组成发生明显改变, 葡萄球菌属和劳尔氏菌属等致病菌出现在试验组的鲫鱼肠道中, 微塑料的存在可能增加了某些疾病发生的风险.
(4) 试验组的鲫鱼肠道微生物具有明显的聚类特征, 其中高浓度组鲫鱼的肠道微生物菌种最为丰富.
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