2022, Vol. 43
2. 广东省环境污染控制与修复技术重点实验室, 广州 510275
2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Environmental Pollution Control and Remediation Technology, Guangzhou 510275, China
三氯生(tricloson, TCS)作为一种典型的PPCPs, 已经被广泛使用于医药和个人护理产品等领域. 目前, 我国城市污水处理厂进出水中普遍存在PPCPs及其中间产物的残留问题.有研究表明, 大多数污水处理厂中, 进水的ρ(TCS)约为152~21 900 ng·L-1, 而在二级出水和污泥中分别为4~2 700 ng·L-1和90~27 978 ng·g-1[1~6]. 有研究表明, 残留的TCS及其中间产物对活性污泥中的硝化和反硝化过程会产生显著的不利影响[7~11]. 有研究发现TCS的痕量中间产物2, 4-dichlorophenol的高毒性和环境持久性对活性污泥系统的负荷影响巨大[12~15]. 通常, TCS影响活性污泥系统主要通过改变其中的细菌多样性和群落结构[16~20]. 目前的研究中, 已发现氨氧化细菌(AOB)和一些异养微生物可能与TCS生物降解有关, 而对于硝化细菌和反硝化细菌的研究较少[21, 22]. 基因层面上, TCS的存在使得氨氧化细菌的功能基因amoA的表达降低[23], 但其对于编码调节羟胺生成亚硝酸盐和亚硝酸盐的基因hao和nxrA的影响则鲜见报道.
为了系统地探究TCS在长期运行下对氮循环、微生物群落和功能基因的影响, 本研究采用SBR反应器, 对比分析了添加TCS和不添加TCS对活性污泥微生物的长期影响. 使用UHPLC-Q-TOF-MS/MS检测TCS及其代谢中间产物, 并推导出代谢路径. 此外, 通过16S rRNA基因高通量测序探明TCS对微生物群落组成与结构的影响. 最后, 应用qPCR评估TCS对硝化和反硝化基因丰度的影响, 并通过网络拓扑分析识别功能菌与优势物种之间的相关性.
1 材料与方法 1.1 化学试剂与材料TCS(C12H7O2Cl3, CAS No. 3380-34-5, 纯度>98.0%)购自Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). 甲醇(纯度>99.9%)和乙腈(纯度>99.9%)购自Merck (Darmstadt, Germany). Fast DNA SPIN kit for soil DNA提取试剂盒购自MP Biomedicals(California, USA). 反应器运行用的合成废水组分: NH4Cl 133.73 mg·L-1、KH2PO4 22.68 mg·L-1、CaCl2 5 mg·L-1、MgSO4 5 mg·L-1、CH3COONa 652 mg·L-1、glucose 1 000 mg·L-1和1 mL微量元素. 微量元素的成分: CaCl2 750 mg·L-1、MgSO4·7H2O 3 000 mg·L-1、FeCl3·6H2O 250 mg·L-1、MnCl2·4H2O 50 mg·L-1、CoCl2·6H2O 50 mg·L-1、ZnCl2 50 mg·L-1、CuCl2·2H2O 10 mg·L-1、NiSO4·7H2O 250 mg·L-1和H24Mo7N6O24 20 mg·L-1. BCA蛋白质测定试剂盒和高效RIPA裂解物购自Solarbio(Beijing, China).
1.2 反应器装置及运行本实验使用的活性污泥取自猎德污水处理厂(中国广州), 在两个有效体积为4.0 L的SBR反应器中运行. 其中1个反应器添加TCS, 第0~170 d添加100 g·L-1, 第170~185 d添加150 g·L-1, 记作RT, 另一个反应器不添加TCS用作空白对照, 记为RC. 两个SBR在厌氧/缺氧模式下运行, 循环时间为24 h, 即进水搅拌(2 h)、好氧曝气(10 h)、缺氧搅拌(2 h)、沉淀(4 h)、排水(2 h)和闲置(4 h), 进水交换率为60%. 每个反应器的初始生物量浓度约为0.4 g·L-1, pH由0.5 mol·L-1 NaOH和0.5 mol·L-1 HCl调节到7.0~7.5.
1.3 化学分析TCS的浓度用配备Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18(4.6×100 mm, 4 μm)色谱柱和VWD检测器的高效液相色谱仪(Agilent, 1260 InfinityⅡ, USA)测定, 检测用的流动相为90%的甲醇和10%的超纯水, 1.0 mL·min-1的流速等梯度洗脱.使用配备Zorbax Eclipse XDB C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm)的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪UHPLC-Q-TOF-MS/MS(Synapt G2 Si Waters, USA)测定TCS的代谢产物. 使用的流动相为甲醇(含0.1%甲酸)和超纯水(含0.1%甲酸)的混合物.
氨氮测定采用纳氏比色法、亚硝酸盐氮测定采用盐酸α-萘胺比色法、硝酸盐氮和总氮测定采用紫外分光光度法[24]. BCA测试方法用于蛋白质的提取和测定, 1 g蛋白质相当于1.29 g生物量[25].
1.4 计算方法本实验中氮元素可以通过生物硝化、反硝化和生物量同化来转化[式(1)], 硝化作用将NH4+-N转化为NOx--N的量(ΔNnitrified)用[式(2)]计算, 反硝化作用将NOx--N转化为气态氮的量(ΔNdenitrified)的浓度用[式(3)]计算. 单位生物量的硝化和反硝化速率分别用[式(4)]和[式(5)]计算.
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式中, (NH4+-N)inf为进水的NH4+-N浓度(mg·L-1), (NH4+-N)eff为出水的NH4+-N浓度(mg·L-1), (NOx--N)eff为出水的NO2--N和NO3--N浓度(mg·L-1), ΔNassimilated为微生物同化的氮浓度(mg·L-1), ΔNnitrified为微生物反硝化作用消耗的氮浓度(mg·L-1), ΔNdenitrified为微生物反硝化作用消耗的氮浓度(mg·L-1), X为不同运行时间的生物量浓度(g·L-1), kΔNn为单位生物量的硝化速率[mg·(g·d)-1], kΔNd为单位生物量的反硝化速率[mg·(g·d)-1].
1.5 DNA提取和测序活性污泥样品用缓冲溶液在4℃、4 000 r·min-1的离心机中冲洗两次, 每次离心持续12 min, 然后使用FastDNA SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals, USA)提取活性污泥样品的DNA. 使用引物扩增16S rRNA基因的V3和V4区域, 引物的正向序列为: 5′-GTGYCAGCCGGTAA-3′, 反向序列为: 5′-GGACTACHVGGWTCTAAT-3′. 使用i-Cycler (BioRad Hercules, CA)进行PCR扩增反应, PCR步骤: 先在95℃下持续5 min, 然后在95℃下进行25次30 s的变性循环, 然后降温至50℃维持30 s, 后在72℃下反应40 s, 最终在72℃下扩增7 min. 在浓度为1.8%的琼脂糖凝胶电泳上观察扩增产物, 合格的PCR产物通过诺禾致源生物信息技术有限公司(中国北京)的Ion S5 TMXL测序平台进行建库和16S rRNA基因的测序.
1.6 微生物多样性分析通过剪接和过滤原始测序序列获得有效的基因序列, 有效序列通过微生物生态学定量分析软件(QIIME2)(版本2020.11.1)分析[18], 然后对操作分类单元(OTU, ≥ 97%相似性)进行聚类和物种注释. 采用Ace、Chao1、Shannon和Simpson指数反映基于OTU的微生物群落丰富度和多样性. 聚类分析(CA)和主成分分析(PCA)将RC和RT之间相似的样本聚类在一起. 所有的微生物群落分析均在R语言(版本4.0.3)使用对应的软件包完成.
微生物网络分析有效地揭示了RC和RT中潜在的细菌相互作用, 具体参数: 显著性检验P < 0.01, Spearman相关性系数P>0.8或P < 0.8, RC和RT之间OTU的相关性系数矩阵先在R语言中计算(版本4.0.3), 然后在Gephi(版本0.9.3)中完成互作网络的可视化.
1.7 qPCR为了比较氮转化功能基因在RC和RT中的分布, 用qPCR方法量化16S rRNA、amoA、hao、nxrA、napA、narG、nirK、nirS、norB和nosZ基因的绝对丰度. qPCR通过使用iCycler热循环仪(Bio-Rad, Philadelphia, PA)进行. 反应物包括：Maxima SYBR green qPCR master mix(Thermo)、10 pmol正向和反向引物、20 ng DNA和超纯无菌水, 反应体系为20 μL, 每个样品一式三份. 目标基因的qPCR反应在95℃时保持1 min, 然后再维持10 s, 继而在58℃时保持20 s, 72℃时为1 min, 最后在72℃时反应50 s, 引物序列如表 1所示.
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表 1 qPCR分析中对应的硝化反硝化功能基因引物序列 Table 1 Primer sequences of nitrification and denitrification genes in qPCR analysis |
2 结果与分析 2.1 SBR反应器脱氮性能的对比
由图 1可知, 与未添加TCS的RC相比, 添加TCS后, RT长期运行期间的生物量和脱氮性能整体呈下降趋势. RT的生物量在0~10 d内先增加, 达到(460±8.40)mg·L-1, 在10~65 d内逐渐减少至(350±7.80) mg·L-1, 最终稳定于(430±3.20)mg·L-1的生物量. 长期投加100 g·L-1的TCS, RT的出水TCS浓度随着运行时间的增加逐渐降低, RT的生物降解TCS的性能逐渐增强. 如图 2所示, 在RC和RT中, COD的单位生物量去除率表现出较高的波动性. NH4+-N的去除性能也受到TCS的影响, RC单位生物量的硝化速率[kΔNn, mg·(g·d)-1]都高于RT, 后者NH4+-N去除率在第35 d降至最低(58.77%), 此后逐渐恢复, 其在第75 d达到与RC同等的水平(100%). 由于氨氮的利用率降低, RT的硝化与反硝化性能也相应被削弱, 其出水NO3--N浓度从运行起始就低于RC, 第55 d时RT与RC的NO3--N出水浓度的差值最大(4.59 mg·L-1), 后面逐渐减小. RT中单位生物量的亚硝态氮和硝态氮的产量也低于RC. 由于TCS的引入, RT在初期0~75 d内的反硝化性能显著低于RC, 而在75 d后逐渐恢复, 由于微生物的反硝化过程需要碳源的参与, 因此RT中COD去除率的波动也会引起反硝化性能的变化.
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图 1 TCS处理的SBR与对照SBR的生物量和进出水指标 Fig. 1 Biomass, influent, and effluent indices of SBR treated by TCS and control SBR without TCS |
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图 2 TCS处理的SBR和对照SBR的COD去除与脱氮性能的对比 Fig. 2 Comparison of COD removal and denitrification performance between SBR treated by TCS and control SBR without TCS |
通过离子淌度-Q-TOF超高分辨液相色谱质谱联用仪(UHPLC-Q-TOF-MS/MS)分析鉴定RT中TCS的代谢产物, 进一步阐明TCS在活性污泥中的转化. TCS的生物降解共检测到12种可能的中间产物, 即PA1: 5-Chloro-2-(4-chloro-phenoxy)-phenol, PA2: 4-(4-Hydroxy-phenoxy)-benzene-1, 3-diol, PB1: 2-Chloro-5-(4-chloro-2-hydroxy-phenoxy)-[1, 4]benzoquinone, PB2: 2-(4-Chloro-2-hydroxy-phenoxy)-[1, 4]benzoquinone, PB3: 2-(4-Chloro-2, 5-dihydroxy-phenoxy)-[1, 4]benzoquinone, PB4: 2-Chloro-5-(4-chloro-2, 5-dihydroxy-phenoxy)-[1, 4]benzoquinone, PB5: 5, 5′-oxybis(2-chlorocyclohexa-2, 5-diene-1, 4-dione), PC1: 2, 4-Dichloro-5-(4-chloro-2-hydroxy-phenoxy)-phenol, PC2: 3-(2-hydroxy-phenoxy)-phenol, PC3: 1-(2-methoxy-4-chloro-phenoxy)2, 4-dichloro-benzene, PD1: 2, 4-dichloro-5-(2-methoxy-4-chloro-5-hydroxy-phenoxy)benzene, PD2: 2, 4-Dichloro-3, 5, 6-trihydroxy-hexanal. 其中PC-3#和PD-2#是新发现的中间体, 基于所检测到的中间产物信息, 推测出了4条TCS的转化途径(图 3).
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PA、PB、PC和PD分别表示4条不同的TCS代谢路径, 其中PA-(1, 2)、PB-(1~5)、PC-(1~3)和PD-(1, 2)分别表示在UHPLC-Q-TOF-MS中检测到的化合物; S1和S2标记了本研究未检测到但已有研究中已报道过的化合物; “#”表示本研究检测到的但以前未发现过的中间产物; Dec表示脱氯反应, Deh表示脱氯和羟基化反应, Met表示甲基化反应, Hyd表示羟基化反应, Dhy表示脱氢反应 图 3 三氯生在活性污泥中降解路径 Fig. 3 Fate of triclosan transferred in activated sludge |
两个反应器中的微生物经过测序共得到1.0×106个有效基因序列, 每个样本的序列数量大于1.5×104, 表明测序深度足够. 表 2是RC和RT反应器中微生物的Shannon、Simpson、Ace和Chao1指数随时间变化的情况, Ace指数和Chao1指数的结果表明TCS处理过的RT的物种丰富度与RC没有明显的差距, 但RT的Shannon指数和Simpson指数明显低于RC, 表明RT的物种多样性显著低于RC.
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表 2 RC和RT反应器中微生物的α多样性指数 Table 2 Microbial α diversity indices in RC and RT reactors |
图 4展示了RC和RT中相对丰度最高的40个门水平和94个目水平的物种的相对丰度随时间的变化情况. 微生物门水平上[图 4(a)和4(b)], 大部分AOB、NOB和DNB属于Proteobacteria门, RT中Proteobacteria门的相对丰度比RC略低, Nitrospirae门的差异不大. RT中Chthoniobacterales、Fusobacteriales、Clostridiales和Desulfobacterales目与RC相比有明显的富集. Flavobacteriales、Myxococcales和Alteromonadales目已被证明能降解TCS, 并在RT中随运行时间的增加而富集, 但在RC中减少. Nitrosomonadales门在RC中富集, 但在RT中Nitrosomonadales门的相对丰度减少, 说明TCS的引入对AOB有抑制作用. 为了有效地鉴定RT和RC中的功能性菌(AOB、NOB、DNB和TDB), 图 4(e)给出了RT和RC中属水平功能菌的相对丰度比值的对数[lg (RT/RC)].
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色条表示Rc和Rp中不同物种的标准化相对丰度比值的范围 图 4 Rc和RT中相对丰度最高的40个门、94个目和功能性菌属构成的热图 Fig. 4 Heatmap of the relative abundances of the top 40 phyla, top 94 orders, and functional genera of Rc and RT |
图 5是RT和RC在11个时间点的所有样本的主成分分析(principal component analysis, PCA), 以揭示RT和RC的微生物群落结构随时间变化的差异. 在投加TCS的初期(0~10 d), RT和RC的样本在PCA坐标轴上的距离很近. 随着时间的延长, RT与RC的距离逐渐增大(第20 d, 图 5中蓝色椭圆), 第35 d时RT与RC之间的距离很远(图 5中黄色椭圆), 在55~65 d时, RT与RC之间的距离达到最远(图 5中红色椭圆). 此后, RT与RC之间的距离逐渐缩小, 90 d(图 5中绿色椭圆)后, RT与RC之间的距离很近甚至在坐标轴上重叠.
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不同颜色的椭圆表示相同时间点的Rr和Rc 图 5 RT与RC在不同时间点的所有样本的OTU作主成分分析 Fig. 5 Principal component analysis of all samples of RT and RC at different treatment times based on the OTU level |
16S rRNA基因、硝化基因(amoA、hao和nxrA)和反硝化基因(napA、narG、nirK、nirS、norB和nosZ)丰度随时间的变化如图 6所示. RC中16S rRNA基因的丰度为1.8×108~2.5×109 copies·g-1, 而在RT中对应为8.0×107~6.8×108 copies·g-1, 明显低于RC, 表明RT中细菌的数量由于TCS的影响减少了. RC中16S rRNA、amoA、hao、nxrA、napA、narG、nirK、nirS、norB和nosZ基因在第20 d的丰度与第1 d丰度比值的对数值[lg(20/1)]分别为0.29、0.04、-0.08、-0.01、0.05、0.01、0.02、-0.07、-0.01和0.01, 而在RT中分别为-0.35、-1.00、-0.42、-0.44、-0.05、-0.06、0.15、-0.02、0.21和0.22. 除了nirS和nirK基因外, RT其他基因的lg(20/1)都显著低于RC, 结果表明TCS的引入在前期会抑制脱氮功能菌的生长.
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色块表示16S rRNA、amoA、hao、nxrA、napAa、narG、nirK、nirS、norB和nosZ在不同的运行天数 (20、55、135和185 d)下基因的丰度与第1 d丰度比值的对数值变化 图 6 基于qPCR测定的16S rRNA基因和RT与RC中硝化反硝化功能基因的绝对丰度箱线图 Fig. 6 Absolute abundance box plots of 16S rRNA genes and functional genes of RT and RC for nitrification and denitrification measured by qPCR |
利用OTUs(≥ 97%相似性)的相对丰度矩阵, 计算了RT和RC在不同处理时间的物种之间的相关性系数, 采用统计学方法对细菌群落间的共生-共斥模式进行了检验, 并在拓扑网络中可视化, 网络图主要从门水平、属水平和功能菌的角度分析了RT和RC中物种之间的关联性. 如图 7所示, 设置作图参数为显著性检验P < 0.01, Spearman相关性系数P>0.8或P < -0.8时, 门水平上的优势物种是Proteobacteria和Bacteroidetes, 它们与其他物种有更广泛的紧密作用关系. 图 7(c)和7(g)结果显示, 氨氧化菌、硝化菌和反硝化菌之间的正相关网络连接紧密而复杂, 而它们的负相关网络连接较弱且稀疏, 同时网络图中反硝化菌之间的距离较远. RT和RC中的物种聚类为11个模块, 模块1~3的物种团结且连接紧密, 其他模块的物种较分散[图 7(d)]. RT和RC之间各自占优势的OTUs进行的网络拓扑分析表明, 未添加TCS的对照组中物种之间的联系比RT紧密, 设置参数下的网络关系显著多于RT[图 7(h)].
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(a)和(c)表示门水平, (b)和(d)表示属水平, (e)和(g)表示功能菌, (f)表示OTU聚类的模块(模块化系数=0.325), (h)中“RT>RC”表示在RT中相对丰度大于RC的OTU, “RC>RT”表示在RC中相对丰度大于RT的OTU, (a)、(b)、(e)、(f)和(h)的参数: 显著性检验P<0.01, Spearman相关性系数P>0.8, (c)、(d)和(g)的参数: 显著性检验P < 0.01, Spearman相关性系数P < -0.8; 节点数表示OTU的数量, 每个节点的大小与连线的数量成比例, 边的厚度表示相关性的大小, 括号内数值表示属于该物种的OTU数量 图 7 RC和RT中OTUs之间的网络分析 Fig. 7 Network analysis between OTUs of RC and RT |
TCS对脱氮过程的抑制现象表明其一开始会刺激与脱氮作用有关的酶的活性, 之后抑制它们的活性, 因此, 长期暴露于TCS中, 活性污泥的硝化过程会受到抑制[17, 36, 37]. 添加100 g·L-1 TCS后, 其对脱氮过程的抑制作用先增强后减弱, 并且NH4+-N在第35 d的去除率为58.77%, 是整个运行期间的最低值. 之后TCS的抑制作用减弱, 一开始被TCS抑制的硝化功能细菌的丰度渐渐增加, 然后通过长时间的驯化逐渐适应含TCS的环境[38].
3.2 TCS在活性污泥中的迁移转化由图 3可知, 降解路线A在质荷比(m/z)为217处检测到产物4-(4-Hydroxy-phenoxy)-benzene-1, 3-diol (PA-2), 表明TCS分子中苯环上的氯原子在羟基化后脱落, 形成二氯羟基化合物. 作为TCS降解的主要路线, 路线B也进行了·OH的置换, 从而产生了2-Chloro-5-(4-chloro-2-hydroxy-phenoxy)-[1, 4]benzoquinone(PB-1)、2-Chloro-5-(4-chloro-2, 5-dihydroxy-phenoxy)-[1, 4]benzoquinone (PB-2)、2-(4-Chloro-2-hydroxy-phenoxy)-[1, 4]benzoquinone (PB-3)、2-(4-Chloro-2, 5-dihydroxy-phenoxy)-[1, 4]benzoquinone (PB-4)和5, 5′-oxybis(2-chlorocyclohexa-2, 5-diene-1, 4-dione) (PB-5). S1和S2是活性碳纤维系统中TCS的重要中间产物[39]. 根据TCS降解产物的相关研究和理论途径, 对位TCS的双键是·OH攻击的最可能位点[40]. 通常, 电子转移是导致羟基化的主要途径[41], 然后形成碳中心自由基, 从而诱导苯环中形成羟基, 过硫酸盐体系中也发现了类似的结果[42]. 对于路线C, PC-3#是本研究新发现的化合物. 质谱图和保留时间表明, 2, 4-Dichloro-3, 5, 6-trihydroxy-hexanal (PC-2)被确定为路径C的最终产物, 质荷比m/z为215. 经推导得出, 由于自由基对醚键的攻击, PC-2中可能发生键断裂, 两个苯环之间氢的大量置换[43]. 通常, 羟基化会导致键断裂, 从而导致TCS断裂, 生成2, 4-dichlorophenol和4-chlorocatechol[44, 45]. 这两种中间产物的缺失表明2, 4-Dichloro-3, 5, 6-trihydroxy-hexanal(PC-2)的出现可能是由于进一步的·OH攻击导致.
TCS的最后一个转化途径是通过甲基化生成PD-1质荷比m/z为301. 之前的研究主要关注于水溶液体系中TCS的降解产物, 甲基化三氯生的产生需要充足的溶解氧[46, 47]. 微生物也可能选择通过甲基化三氯生生成茴香醚类, 而不是毒性更大的酚类. 此外, 作为PD-1通过羟基自由基进一步攻击的转化产物, 在先前的研究中从未检测到质荷比m/z为333的分子离子, 表明1-(2-methoxy-4-chloro-phenoxy)2, 4-dichloro-benzene(PD-2#)可能是TCS在活性污泥中降解路径D的最终产物.
3.3 TCS及其中间产物对微生物群落丰度和多样性的影响随着运行时间的推移, RC和RT之间的Shannon指数和Simpson指数没有明显差异, 表明TCS对微生物群落多样性没有显著的影响. 然而, 与RC相比, RT的Ace和Chao1指数表现出更低的值, 说明RT中的微生物群落的物种丰富度受到TCS的影响后降低.
RC和RT中微生物的相对丰度也随着运行时间而不断变化, 与RC中的功能性菌(AOB、NOB、DNB和TDB)的相对丰度相比, RT中持续富集的功能性菌很少. 对于硝化作用, 一方面, RT中的Nitrosomonas(AOB)在运行的前20 d高于RC, 35~65 d低于RC, 然后在第90 d之后逐渐增加到初始的丰度水平; Nitrosovibrio(AOB)也表现出滞后期(0~20 d), 在35~60 d内下降, 然后逐渐上升到初始的丰度; 另一方面, Nitrospira(NOB)表现出与Nitrosomonas相似的趋势. TCS抑制了AOB和NOB对NH4+-N的氧化作用, 由于RT中微生物对TCS的生物降解作用增强, 反应器内剩余TCS浓度逐渐降低, 硝化作用也逐渐恢复[17, 18], 图 1也显示第75 d时RT与RC的NH4+-N去除率都达到了100%. 对于反硝化作用, RT中Thauera、Hydrogenophaga、Zoogloea和Dechloromonas等反硝化菌属的相对丰度逐渐下降, 低于RC中对应的丰度. 55 d后, RT中这些DNB的相对丰度逐渐增加甚至高于RC. 对于TCS的生物降解作用, 一些反硝化菌属, 如Rhodococcus、Stenotrophomonas和Sphingomona, 不仅能进行反硝化作用, 而且还能降解TCS, RT中它们的相对丰度也在第55 d左右明显低于RC, 此后逐渐上升. Nitrosomonas(AOB)也被报道过可用于硝化作用和TCS的生物降解[48, 49]. 除了去除反应器内的NH4+-N、NO3--N和TCS, 异养反硝化细菌(DNB)和AOB的协同代谢可能在TCS生物降解效应中发挥关键作用[50].
由于RT中长期有一定量的TCS, 微生物会逐渐适应该环境[38, 51, 52]. 投加TCS后, RT中OTUs的组成与丰度逐渐与RC不同, RT与RC的微生物群落结构在第20 d时观察到较大的差异性, 并且该差异性逐渐扩大, 55~65 d时达到最大值, 之后两者间结构上的差异逐渐减小. 110~185 d内, RT与RC群落结构上的差异基本与初始的状态一致. 因此, TCS虽然对微生物群落的演化有影响, 微生物种群发生了明显的变化, 但随着微生物逐渐适应了含有TCS的环境, TCS对活性污泥微生物的影响微乎其微.
3.4 TCS对硝化与反硝化基因表达的影响氨氧化细菌(AOB)将氨转化为亚硝酸盐通常被认为是硝化过程中最关键的步骤[53, 54]. 基因amoA编码氨转化为羟胺的酶蛋白, 由于其对环境干扰的敏感性, 被认为是研究硝化抑制的目标基因[49, 55]. 在本研究中, 添加TCS后, 基因amoA的相对丰度在初始阶段显著降低, 从106丰度水平下降到105然后恢复到5.0×105 copies·g-1, 这种变化趋势与之前的研究一致[18], 这一趋势还伴随着氨氧化活性的降低. 然而, 与基因amoA和nxrA相比, 编码羟胺氧化为亚硝酸盐的基因hao的表达随时间并没有明显地变化. 亚硝酸盐氧化酶的编码基因nxrA被认为是亚硝酸盐氧化细菌的前哨基因, 它依赖由基因amoA调控氨产生的亚硝酸盐. 因此, 基因nxrA表达量的变化与amoA相似, 这与之前在活性污泥中发现相同趋势一致[56, 57].
基因napAa、nirK、norB和nosZ是与反硝化相关的4个主要功能基因. 在反硝化功能基因的表达方面, TCS的引入没有导致显著的表达量差异. 只发现基因narG在0~20 d内增加, 但55 d之后, 表达量开始下降, 随后又逐渐恢复, 该现象在污泥和生物膜反应器中也有类似的发现[42]. 添加TCS后, 反硝化基因表达量(即nirK、nirS、norB和nosZ)所占的比例大于硝化基因. 基因nirS的丰度变化对TCS不敏感, 在反应器运行过程中相对稳定, 它在活性污泥系统中的丰度比基因narG和nosZ更高[19]. 这一现象与硝化作用一致, 硝化作用很容易受到环境波动的影响, 反硝化菌也很容易适应环境, 通过异养呼吸分解大部分有机物甚至是TCS[51].
3.5 TCS对微生物群落互作模式的影响总的来说, 来自同一分类水平(门和属水平)的OTU倾向于正相关性[图 7(a)、7(b)、7(e)、7(f)和7(h)], 而来自不同分类群的OTU倾向于负相关性[图 7(c)、7(d)和7(g)]. 对RT和RC之间各自占优势的OTUs进行网络拓扑分析, 在RC中占据优势丰度的物种比在RT占据优势丰度的物种更倾向于与其他物种建立正相关的联系, 而且这种相关性更加紧密[图 7(h)]. 模块7、7和8与其他模块分离, 没有与任何其他模块相连[图 7(f)], 模块7仅包含两个OTU(OTU 867和OTU 1226), 且都是AOB. 从细菌功能来看, 21株反硝化OTU与其他细菌表现出相关性, 尤其是OTU 101、OTU 149和OTU 1120, 表现出较强的共生模式. 在分类学上距离较远的细菌之间最有可能的细菌相互作用模式是互惠共生和共栖. 例如, 氨氧化菌OTU 266、OTU 298和OTU 1428与亚硝酸盐氧化菌OTU 135共同出现在共生关系中[图 6(e)]. AOB可以为NOB提供亚硝酸盐, NOB吸附亚硝酸盐以防止其对AOB的抑制. 同样, AOB和NOB可以提供NO2--N和NO3--N给反硝化菌, 释放可溶性代谢产物给异养菌, 反硝化菌通过异养反硝化过程产生的CO2为AOB和NOB提供碳源, TDB通过将TCS降解为对细菌毒性低的有机小分子, 易于被其他异养细菌利用[58].
4 结论(1) TCS的引入抑制了活性污泥微生物的硝化速率(kΔNn)和反硝化速率(kΔNd), 该抑制作用会逐渐减弱, 脱氮性能进而恢复.
(2) TCS的生物降解产生12种中间产物并依此推导出4种代谢路径.
(3) 添加TCS后, 活性污泥微生物的物种丰富度明显降低, 群落结构从第20 d开始发生了显著变化, 适应110 d后, RC和RT在微生物群落结构上的差异消除.
(4) 添加TCS运行20 d, amoA、hao和nxrA基因的丰度就显著低于初始值, 硝化作用受到TCS的抑制; 运行185 d后, amoA、hao和nxrA的丰度仍低于初始水平, 而nirK、norB和nosZ基因的丰度较初始值有所增加, 反硝化作用增强.
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