2022, Vol. 43
塑料制品近年来已被广泛应用于工业、农业、医药和市政等多个领域[1].最新数据显示, 截至2019年全球塑料产量已达4亿t; 且如果按当前生产和废物管理模式继续下去, 到2050年大约1.2亿t塑料废物将进入填埋场或自然环境中[2].大多数塑料碎片会随时间破碎成较小颗粒, 通常将尺寸小于5 mm的塑料颗粒定义为微塑料[3].Thompson等[4]首次证实显微镜下观察到的微塑料碎片和纤维在海洋环境中广泛存在, 该研究引发了学术界对微塑料这一新兴污染物的关注[5].环境微塑料污染正成为整个地球表层生态系统最严重的威胁之一.
近年来, 沉积物中的微塑料污染研究越来越受到学者们的重视.有研究表明, 沉积物中的微塑料丰度往往高于水体, 虽然塑料的密度通常比水轻, 但是由于风力、水动力条件、生物富集和微塑料自身的形状等因素的影响, 水体中的微塑料会沉降并积蓄在沉积物中[6].如广州市珠江沿岸水体中微塑料丰度为379~7 924 n·m-3, 而沉积物中丰度高于水体为80~9 598 n·kg-1, 其中聚乙烯(PE)和聚丙烯(PP)是最常见的微塑料类型[7].Wang等[8]的研究发现北江沿岸地区表面沉积物中的微塑料丰度为178~544 n·kg-1, 且通过SEM图像表明微塑料经历了不同程度的机械侵蚀和化学风化. Zhang等[9]研究了三峡大坝支流湘西河回水区中微塑料含量, 发现河流沉积物中的丰度为80~864 n·m-3, 其中积累的微塑料类型除了与地表水中相似的聚乙烯和聚丙烯外, 还发现了聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和颜料.有研究发现, 沉积物中的微塑料兼顾两方面特征, 一是其本身可作为颗粒污染物, 二是由于微塑料表面构造与材料热力学属性等可以吸附其他污染物或微生物[10]; 沉积物中的微塑料一部分输入海洋, 另一部分会永久或半永久性残留在污染区域并逐年累积, 尤其在一些封闭的内陆河湖和水库中, 当沉积物中赋存微塑料后, 因在沉积物中微塑料不能被紫外线光解, 只能依靠生物降解, 存留的时间相对更长[5], 这会显著增加当地环境压力[11].
已有研究表明, 沉积物中的物质循环和能量流动是由微生物驱动, 其与群落组成和代谢功能密切相关[12].目前有限的研究显示, 微塑料积累会显著影响沉积物中酶活性和微生物群落结构[13~15], 并可能会进一步影响环境中碳、氮和磷等元素的循环过程[13, 15], 但有关不同类型和丰度微塑料对微生物多样性影响的研究还鲜见报道.因此, 本研究在前期研究基础上, 通过外源添加2种类型(PE、PVC)和3种丰度(占沉积物干重质量分数为2%、5%、10%)微塑料颗粒模拟沉积物中的微塑料污染, 探究不同类型和丰度微塑料对沉积物微生物群落组成和多样性的影响, 揭示微塑料污染的潜在微生物生态效应, 以期为沉积物中微塑料污染的生态风险评估提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 供试材料供试沉积物于2021年4月采自岱海流域三道河附近, 用彼得逊不锈钢采泥器采集表层沉积物(2~5 cm), 将沉积物样品装入铝箔封口袋中密封后运回实验室, 剔除样品中砾石、植物残体和贝壳等杂质后, 测定供试沉积物的基本理化性质和微塑料丰度, 其中微塑料提取采用密度分离法, 将沉积物样品在70℃下干燥24 h至恒重, 添加30% H2O2消解有机物, 利用NaCl溶液(1.2 g·L-1)进行浮选, 上清液沉降24 h后用玻璃纤维过滤器(滤膜尺寸为47 mm; 孔径为0.45 μm)进行真空抽滤, 将滤纸在40℃下干燥24 h后进行提取.采用立体显微镜(M65FC)和激光共聚焦显微镜(OLS4000)鉴定微塑料, 用Nano Measure 1.2软件统计微塑料丰度(单位是n·kg-1).微塑料的粒径以最长的一边的长度计, 若粒径小于500 μm或难以确定, 则采用傅里叶红外光谱仪(RXI)对微塑料颗粒进行成分识别, 具体情况见表 1.本研究供试沉积物中微塑料丰度相对较小, 本底值对后续实验的影响较小.
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表 1 供试沉积物基本理化性质及微塑料丰度 Table 1 Basic properties of tested sediment and abundance of microplastics |
为真实模拟沉积物中微塑料污染, 供试微塑料选用聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)和聚乙烯(polyethylene, PE)均购自于上海冠部机电科技有限公司, 2种微塑料颗粒均为无规则球状结构, 纯度为99.9%, 粒径为550 μm.实验开始前先对微塑料颗粒进行预处理, 将其浸泡在辛烷和戊烷中, 并放置于干燥箱中烘干, 然后在紫外线洁净台消毒1 h以减少微生物污染, 最后4℃保存备用.
1.2 实验方法模拟实验在恒温箱中进行, 根据已有沉积物中微塑料含量调查研究[16], 分别设置2种微塑料类型(PVC、PE)和3种丰度(沉积物干重质量的2%、5%、10%), 并设置不添加微塑料的对照组(CON), 共计7种处理方式(表 2), 每个处理方式重复3次.每种处理下取1 kg供试沉积物于1 L烧杯中培养, 按比例将不同微塑料添加到沉积物中, 并用不锈钢勺分多次搅拌、混合均匀.保持(27±3)℃和60%的沉积物含水率于恒温箱内培养, 模拟日光照射, 每12 h交替光照和黑暗环境, 实验过程中每日添加超纯水保持培养水位, 使液面刚好没过沉积物1 cm.从添加微塑料后24 h开始计时, 第30 d从每个培养容器中取3个重复沉积物样品进行分析, 每个样品重量约为5 g, 用于沉积物DNA提取和测序分析.
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表 2 微塑料污染模拟实验设置 Table 2 Microplastic pollution simulation experimental setup |
1.3 沉积物微生物群落的高通量测序
选用FastDNA Spin Kit(MP Biomedicals)试剂盒提取沉积物样品DNA.通过正向引物338 F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和反向引物806 R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对细菌16S的V3~V4区进行PCR扩增.PCR产物用Axygen DNA凝胶提取试剂盒进行纯化, 用Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒进行定量.用Illumina MiSeq平台对纯化的扩增子进行高通量测序.
1.4 数据统计与分析运用QIIME(quantitative insights into microbial ecology)程序对原始DNA序列进行质量优化, 按照97%相似度将优化序列聚类为用于物种分类的操作分类单位(operational taxonomic units, OTUs), 根据细菌16S rRNA Green genes为参考数据库(Release 13.8, http://greengenes.secondgenome.com/)获取OTU表.使用QIIME2程序计算细菌群落的丰富度指数(Chao1)、多样性指数(Shannon、Simpson)和覆盖度(Coverage指数).统计每个OTUs的相对丰度信息, 并用Origin 9.0软件制作不同水平的微生物群落结构.根据OTU表, 采用PICRUSt2对获取的16S rRNA基因序列在KEGG数据库(kyoto encyclopedia of genes and genomes, 京都基因和基因组百科全书, http://www.genome.jp/kegg/)中进行细菌群落的代谢通路预测[17].
使用SPSS 22.0进行不同处理之间的多重比较, 采用单因素方差分析(one way anova)中的Turkey统计检验法, 以0.05水平统计差异的显著性.采用R语言3.4.1进行主成分分析(PCA), 通过ANOSIM分析比较不同处理间微生物群落的差异.
2 结果与讨论 2.1 微塑料对沉积物细菌群落多样性的影响沉积物中加入不同类型和丰度微塑料对细菌群落丰富度、多样性和覆盖度的影响见表 3.由表 3可知, 沉积物样品中有43 495~52 262个细菌有效序列, 依据97%序列相似性对所有序列进行聚类后发现, 所有处理共有2 167个OTUs. 7种处理中, Coverage指数均>0.97, 说明样本中的细菌序列基本被检出, 即测序结果能反映样本的真实性.各处理中有效OTUs数量存在显著差异(P < 0.05), 不加微塑料的对照组(CON)最高为48 522±27, 添加微塑料的6种处理OTUs数量分别为48 080±26、46 747±57、45 710±54、46 836±78、48 251±39和45 881±47, 均低于CON处理, 说明添加微塑料会降低微生物丰度, 且微塑料类型和丰度是影响微生物生长的重要因素.不同处理Simpson和Shannon指数未见显著差异, Ace和Chao1指数除PVC2处理与CON相比不存在显著差异外, 其余各种处理均低于CON, 说明添加微塑料对菌群多样性影响不明显, 但能显著降低菌群的丰富度.
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表 3 不同类型微塑料对沉积物中细菌群落α多样性的影响1) Table 3 Effects of different types of microplastics on the α diversity of bacterial community in the tested sediments |
微塑料对沉积物α多样性的影响可能是多种因素共同作用的结果, 如塑料的丰度[13]、种类[18]和尺寸[19]都可能造成评估结果的差异化.与本研究结果不同的是, Huang等[20]在LDPE对微生物群落和酶活性影响的研究中, 添加0.076 g·kg-1丰度LDPE的处理在培养后期通过16S rRNA高通量测序发现, 微塑料对土壤微生物群落多样性没有显著影响, 但对细菌群落丰富度具有显著促进作用, 这可能由于不同丰度微塑料对菌群结构的影响不同.Seeley等[21]的研究结果表明, 添加不同类型微塑料导致沉积物细菌群落多样性差异显著, 在所有α多样性指数中, 添加聚乳酸(polylactic acid, PLA)处理组的丰富度和多样性最高, 而添加聚乙烯(PE)处理组最低, 聚氯乙烯(PVC)处理和其他石油基聚合物处理之间也存在明显差异, 聚氨酯泡沫(polyurethane foam, PUF)处理和对照组的多样性水平极为相似, 这反映了微生物和微塑料之间的相互作用十分复杂, 除丰度影响外, 还可能取决于微塑料的类型以及沉积物的性质[22, 23].
不同处理下沉积物中细菌OTUs主成分分析结果显示(图 1), 各处理中3个重复分别聚在一起, 具有较高的重复性; ANOSIM检验结果中R=1, P=0.001, 证实了各处理的组间差异显著大于组内差异; 在所有处理中, CON和PVC2处理间相距较近而与其他处理相距较远, 说明CON和PVC2处理具有更相似的细菌群落结构.添加不同类型微塑料处理与对照组的Venn图如图 2所示.从中可知, CON和PVC处理共享OTUs数目为1 249个, CON和PE处理共享OTUs数目为1 327个, 这表明对比两种类型微塑料, 沉积物中添加PVC使细菌群落变化更明显.而PE和PVC都是由石油衍生的碳氢化合物合成, 都有碳—碳主链, 但它们组成结构和物理性质(即强度、密度和结晶度等)并不同, 使不同类型微塑料暴露下微生物群落存在差异[24].PE微塑料为发泡类材质, 较大表面积的发泡类微塑料可从环境中吸附蛋白质等营养物质, 进而促进微生物定殖[25]; PVC微塑料为普通树脂颗粒, 其中含有氯键, 且目前为满足市场需求, 通常使用化学添加剂对聚合物进行改性, 使微塑料在降解过程中释放化学成分, 较为典型的是邻苯二甲酸酯, 已有研究表明土壤中邻苯二甲酸酯含量的提高会引起土壤微生物多样性下降[26].
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图 1 不同微塑料处理下沉积物细菌主成分分析 Fig. 1 Principal component analysis of bacteria in sediments treated with different microplastics |
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(a)对照组和PE处理组之间共有OTUs数目; (b)对照组和PVC处理组之间共有OTUs数目 图 2 样本组内和样本组间细菌OTUs数目的Venn图 Fig. 2 Venn diagram of the number of bacterial OTUs within and between sample groups |
不同类型和丰度微塑料对沉积物细菌在门水平群落组成的影响不同(图 3), 不同处理优势菌门种类相同, 但向沉积物中添加微塑料后各物种相对丰度发生了变化, 这取决于添加微塑料的类型和丰度[14].图 3中显示了沉积物中丰度排名前10的细菌门, 占所有序列读数86.43%~97.75%, 其余细菌门被归类为“其他分类(others)”, 其中绿弯菌门(Chloroflexi, 19.77%~25.03%)、变形菌门(Proteobacteria, 12.43%~19.38%)是所有沉积物处理的优势菌, 其次是脱硫菌门(Desulfobacterota, 12.19%~23.17%)、厚壁菌门(Firmicutes, 9.42%~23.24%)、放线菌门(Actinobacteriota, 8.24%~16.28%)、拟杆菌门(Bacteroidota, 6.44%~14.75%)和酸杆菌门(Acidobacteriota, 2.07%~3.98%).与对照组相比, 放线菌门、拟杆菌门和酸杆菌门等相对丰度在添加微塑料后上升, 后壁菌门相对丰度降低, 且PVC10和PE10处理的绿弯菌门和变形菌门相对丰度最大, 在总量中的比例分别为24.50%~25.03%和17.22%~19.38%, 脱硫菌门相对丰度在PVC5处理中最高(23.17%).
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图 3 微塑料处理下沉积物细菌群落基于门水平的分布 Fig. 3 Distribution of bacterial community in microplastic treated sediments based on phylum level |
微塑料可以通过改变沉积物的理化特性或营养条件等进而影响细菌群落结构.变形菌门通常生活在营养丰富且低密度的土壤或沉积物中[27], 由于微塑料的主要成分是碳(≥90%), 本研究中PVC10和PE10处理添加微塑料丰度较高, 可能影响了沉积物中碳储存和转换, 使变形菌门丰度较高, 这也说明微塑料可能通过改变沉积物营养条件进而改变微生物群落结构.已有研究发现放线菌的几个菌属能够降解合成聚合物[28], 如Wolińska等[28]的研究证明PE可以被链霉菌属降解(放线菌中最大的属), Lwanga等[29]的研究从蚯蚓肠道中分离到4种属于放线菌门的细菌能够显著减小PE微塑料的尺寸.在本研究中添加丰度10% PE处理的放线菌门相对丰度最高(16.28%), 可能是由于降解PE类的放线菌富集在微塑料上导致的, 但由于微塑料颗粒较小, 未能将其分离出沉积物并分析表面微生物群落, 故无法判断是否是微塑料表面富集了放线菌.添加微塑料使酸杆菌群丰度增加可能与沉积物pH改变有关, 有研究表明酸杆菌门与pH呈负相关, 侯军华[2]的研究发现投加聚乙烯微塑料影响土壤酸碱性, 证实了微塑料长期积累可使土壤酸化.
图 4为不同类型和丰度微塑料处理下属于绿弯菌门、变形菌门、脱硫菌门和放线菌门OTUs数目>1%的11种细菌科相对丰度的差异.结果显示, 与对照组相比, 伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaceae)和假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的相对丰度在PE、PVC2和PVC10处理呈显著上升趋势, 而在PVC5处理呈降低趋势.与之相反, PVC5处理中脱硫菌科(Desulfosareinaceae、Desulfocapsaceae)的相对丰度显著增加.此外, PE和较高丰度PVC(5%和10%)处理对鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceae)有明显的抑制作用, PE对Norank(Order Gaiellales)和黄单胞杆菌(Xanthomonadaceae)也有抑制作用.
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选择相对丰度>1%的细菌科; 1.Anaerolineae, 2.Caldilineaceae, 属于绿弯菌门(Chloroflexi); 3.Xanthomonadaceae, 4.Sphingomonadaceae, 5.Burkholderiaceae, 6.Pseudomonadaceae, 7.Rhodobacteraceae, 属于变形菌门(Proteobacteria); 8.Desulfocapsaceae, 9.Desulfosarcinaceae, 属于脱硫菌门(Desulfobacterota); 10.Norank(Order Gaiellales), 11.Ilumatobacteraceae, 属于放线菌门(Actinobacteriota) 图 4 微塑料对特定细菌科丰度的影响 Fig. 4 Effects of microplastics on the abundance of specific bacterial families |
在本研究中添加微塑料引起OTUs数目发生显著变化的细菌科, 如伯克霍尔德菌科、黄单胞杆菌科和假单胞菌科等均涉及氮循环[30].与本研究结果相似的是Ju等[31]的研究发现PE会增加伯克霍尔德氏菌科的相对丰度, 且证明这与固氮作用有关, 也有研究证明假单胞菌科菌具有较高的同步硝化和反硝化能力[32].这也表明微塑料会对沉积物中的氮循环产生影响, 其影响机制可能是由于添加微塑料增加沉积物孔隙度从而促进氧扩散, 提高硝化作用[33].最近的一项研究也证实土壤中添加1%聚乙烯薄膜(2 mm)显著提高了土壤孔隙度和土壤水分蒸发速率[34].在PVC5处理中脱硫菌科相对丰度显著高于其他处理, 而伯克霍尔德氏、假单胞菌科等受到抑制, 可能是因为硫化物能抑制沉积物中的硝化作用, 这与Seeley等[21]在沉积物投加聚氯乙烯微塑料后的结果一致.且已有研究证实在沉积物中添加聚氯乙烯微塑料16 d后, 硫酸盐还原菌在聚氯乙烯处理过程中产生的硫化物可通过抑制硝化作用继而抑制反硝化作用[21].本研究沉积物暴露于微塑料后, 鞘氨醇单胞菌科相对丰度显著降低, 鞘氨醇菌的特点是能够生物降解多种对环境有害的有机化合物, 如多环芳烃、二英和氯化苯酚等[35], 这表明微塑料的存在可能会对有机污染物的生物降解产生影响.
2.3 微塑料对细菌群落潜在功能的影响图 5为不同类型和丰度微塑料处理下细菌群落潜在功能(选择相对丰度>1%的预测功能基因)丰度的差异.在所有预测的微生物功能中, 总共检测到41个2级功能基因(Kos), 其中包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢和能量代谢等控制着微生物生存的基本代谢功能基因, 还有参与膜转运、复制、修复以及脂质代谢等高比例微生物功能基因(相对丰度>4%).通过对比不同处理中功能基因的相对丰度, 发现在添加较高剂量(5%、10%)PVC和3种PE处理中膜转运蛋白(membrane transport)、细胞运动(cell motility)和外源物质生物降解及代谢(xenobiotics biodegradation and metabolism)功能有显著改善.相反, 氨基酸代谢(amino acid metabolism)、碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)和能量代谢(energy metabolism)功能基因丰度相比对照组有所下降.
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图 5 对比不同微塑料处理组与对照组对细菌KEGG代谢通路的影响(level2) Fig. 5 Effects of different microplastic treatment groups and control groups on the bacterial KEGG metabolic pathway were compared(level2) |
通过KEGG代谢通路预测表明, 添加微塑料改善了细胞膜转运蛋白和运动等功能, 同时降低了一些必需的代谢途径.膜转运蛋白作为蛋白质系统发挥极其重要的作用, 可以调节细菌环境中发生的不良变化, 为环境风险评估提供信息[17].Fajardo等[36]的研究发现在高丰度重金属暴露下, 参与转运蛋白的功能基因得以富集.本研究沉积物中添加微塑料可能刺激了细菌的膜转运蛋白功能, 从而调节维持细胞内环境稳定的机制[14].此外, 本研究还发现微塑料处理组有更高的细胞运动性, 尤其是在PE处理中, 这可能利于加快细菌向营养物质运动和躲避有毒物质以适应多变的环境[37]; 除微塑料污染的影响外, 非生物因素和沉积物养分的变化也影响微生物群落的功能[38, 39].在本研究中发现添加微塑料后, 与微生物必需代谢(如氨基酸代谢、碳水化合物代谢和能量代谢)有关的功能基因丰度减少, 这可能与添加微塑料改变沉积物中水分和养分(如固氮作用)有关[40].同时, 也有研究发现微塑料基质的生物膜中氨基酸代谢途径以及辅助因子和维生素的代谢途径显著增强, 这也表明微塑料作为一种独特的微生物栖息地不仅能改变群落结构, 还能影响微生物功能, 潜在地影响生态系统中微生物群落的生态功能[41].
3 结论(1) 添加微塑料会显著降低细菌OTUs数目, 不同处理Simpson和Shannon指数未见显著差异, Ace和Chao1指数除PVC2处理与CON相比不存在显著差异外, 其余各种处理均低于CON, 说明添加微塑料对菌群多样性影响不明显, 但能显著降低菌群的丰富度.
(2) 添加微塑料类型和丰度影响微生物群落组成.在门水平, 不同处理优势菌种类相同, 但相对丰度发生了变化：放线菌门、拟杆菌门和酸杆菌门等相对丰度在添加微塑料后上升, 后壁菌门相对丰度降低.在科水平, 添加微塑料引起OTUs发生显著变化的细菌主要涉及氮循环, 例如伯克霍尔德菌科、黄杆菌科、假单胞菌科等, 说明微塑料会影响氮循环; 而沉积物暴露于微塑料后, 鞘氨醇单胞菌科相对丰度显著降低, 表明微塑料可能会影响有机污染物的生物降解.
(3) 添加微塑料会影响微生物群落潜在功能, 添加PE和较高丰度(5%和10%)PVC能显著改善细菌膜转运蛋白、细胞运动和外源物质生物降解和代谢功能, 而氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢功能基因丰度有所下降.
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