2022, Vol. 43
2. 天津城建大学环境与市政工程学院, 天津市水质科学与技术重点实验室, 天津 300384
, LIU Yue-min2
, WANG Chang-rong1 , LIU Ya-ping1,2 , PANG Jie1,2 , HUANG Yong-chun1 , LIU Zhong-qi1 , ZHANG Chang-bo1
2. Tianjin Key Laboratory of Aquatic Science and Technology, School of Environmental and Municipal Engineering, Tianjin Chengjian University, Tianjin 300384, China
随着工农业生产活动的迅速发展、农药的不当使用和矿产资源的大量开发利用等, 农田重金属污染问题日趋严重.据全国土壤污染状况调查公报显示, Cd污染超标点位高达7.0%, 为所有无机污染物之首[1], 农田Cd污染形势不容乐观[2, 3].Cd的水溶性较高且蓄积性强, 容易被水稻等农作物的根系吸收后积累在籽粒中, 并通过食物链进入人体, 在肝、肾等器官中不断蓄积.同时, Cd的毒性强且作用持久, 能够诱发体内氧化应激[4], 导致活性氧积累和氧化损伤, 影响生物体的生长发育, 而食用“镉大米”造成的长期低剂量Cd暴露具有致癌、致畸和致突变的三致作用, 严重威胁粮食安全生产和人体健康[5~7].
目前, 稻田Cd污染治理的研究, 主要集中于低积累水稻品种选育、土壤改良剂和碱性肥料施用、水分管理以及生物修复等方面[5, 8, 9].其中, 微生物修复技术利用不同种类的功能菌株[10, 11], 能够通过与植物互作提高其抗逆性[12], 缓解环境中的Cd污染胁迫造成的氧化应激等反应[13], 降低重金属毒性损伤[14], 在抑制水稻Cd吸收转运的同时促进植株生长[9, 15], 并且将降Cd促生菌应用于水稻拌种和插秧前的苗期也有效果, 具有操作简单、成本低廉和生态友好等优势.伯克氏菌Burkholderia sp.是一种广泛分布于土壤、水和植物根周围等环境中的革兰氏阴性细菌[12], 有较高的Cd耐受性, 可以促进植物生长[16].因此, 水稻降Cd促生菌对于污染农田的治理和粮食安全生产具有较好的应用前景.
然而, 降Cd促生菌的作用机制研究还大多集中于对水稻Cd吸收累积情况的影响, 在菌株作用下实时监测水稻对Cd离子吸收速率的瞬时变化的研究还较少.非损伤微测技术可以在不破坏植株生理结构的情况下, 通过微电极和微传感器获取离子信号, 实时测定水稻根系Cd等离子的转运方向和流速[17, 18].Wang等[19]的研究通过测量水稻中的Cd2+流速, 证明了高积累品种xiushui 11对Cd的转运速度更快.而外源添加降Cd剂能够通过抑制植株根系伸长区的Cd2+流速, 显著降低其Cd积累量[20, 21].由此可见, 水稻根系Cd离子流速是影响其Cd吸收积累的重要因素, 实时检测Cd胁迫下根施降Cd促生菌后不同时间水稻根系Cd2+流速和Cd积累量的变化, 以及水稻生长和氧化应激等指标差异, 能够深入揭示降Cd菌株影响水稻根Cd吸收和Cd毒性的作用机制, 同时也避免了传统的Cd积累检测方法试验周期长和程序复杂等弊端.
笔者前期研究筛选鉴定的菌株Burkholderia sp. Y4(菌株Y4), 能够有效定殖在水稻根表和根际土壤中, 通过生长代谢和菌体吸附等途径钝化Cd, 降低水稻籽粒Cd积累量并提高其矿质元素含量[22].在此基础上, 本研究拟深入分析施加菌株Y4对水稻幼苗生长和Cd毒性损伤以及Cd吸收积累的影响, 通过检测菌株Y4对Cd胁迫下水稻种子萌发和幼根幼芽生长、幼苗地上部和根系氧化应激损伤情况、以及实时监测水稻根系Cd2+流速和长时间Cd胁迫后水稻不同部位Cd积累量, 探究菌株Y4抑制水稻根Cd吸收和缓解水稻幼苗Cd毒性的作用机制, 以期为伯克氏菌Y4作为水稻降Cd微生物菌剂的应用提供理论支持.
1 材料与方法 1.1 供试材料供试水稻分别为低Cd积累品种湘籼24(X24)和高Cd积累品种T优705(T705), 购于湖南农丰种子公司.供试菌种为经筛选、分离和鉴定后的Burkholderia sp. Y4(菌株Y4)[22], 本实验室保存.接种菌株Y4于100 mL灭菌LB培养基中, 150 r·min-1摇床中30℃培养至稳定期, 在25℃条件下于8 000 r·min-1离心10 min, 收集菌体去掉上清液, 按原体积加入灭菌水重悬, 得到菌株Y4处理液, 菌体密度约为1×107 CFU·mL-1, 备用.
1.2 试验及测定方法 1.2.1 萌发试验挑选健康饱满水稻种子在5% H2O2水溶液中表面消毒30 min, 然后用去离子水冲洗3次, 在28℃恒温培养箱中避光催芽, 挑选露白头且长势一致的种子置于一次性塑料培养皿中, 每皿20粒.试验分为3组：CK组(去离子水)、Cd组(25 μmol·L-1 CdCl2)和Cd+Y4组(25 μmol·L-1 CdCl2+1/10菌株Y4处理液), 其中, Cd+Y4组的水稻种子在加Cd胁迫前在1/10菌株Y4处理液中浸种30 min后移入培养皿, 培养皿置入培养箱中继续培养, 每组处理3皿重复.分别在加入处理液3 d和7 d后统计种子的有效发芽数(水稻根长大于种子长, 且芽长大于种子长的一半时为有效发芽), 并计算发芽势和发芽率.
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分别于处理7 d和10 d后收取部分样品, 测量其幼根和幼芽长度, 并将水稻样品拆分为根和芽, 分别装入牛皮纸袋中, 于70℃的烘箱中烘干至质量恒定, 冷却后, 分别称量根和芽的干重.
1.2.2 幼苗试验挑选健康饱满水稻种子, 表面消毒后的种子均匀铺洒在大平皿中, 黑暗条件下, 28℃恒温培养48 h, 露白后将种子浸泡于1/10菌株Y4处理液中30 min后, 采用蛭石培养的方法, 将处理后的种子播种于蛭石盘中, 每孔穴播种2~3株.于人工气候室培育7 d后, 加入1/10的Hoagland's营养液继续培养, 每3 d更新一次营养液.待水稻幼苗长至两叶一心时, 处理组Cd+Y4每孔穴中再追加1 mL 1/10菌株Y4处理液.待水稻幼苗长至三叶一心时, 将处理组Cd和Cd+Y4水稻幼苗移至含0.5 mg·L-1CdCl2的1/10 Hoagland's营养液的托盘中, 继续培养7 d.人工气候室条件：16 h/8 h昼夜交替, 光照强度：105 μmol·(m2·s)-1; 温度：25℃; 相对湿度：60%[23].每个处理设3次重复.
挑选长势一致的水稻幼苗, 用自来水冲洗干净, 浸泡于5 mmol·L-1的CaCl2溶液中30 min以去除根系表面吸附的离子, 然后用蒸馏水将水稻幼苗清洗干净, 并分为地上部和根系部分.一部分按照北京索莱宝科技有限公司检测试剂盒方法, 利用紫外分光光度计(上海菁华, 759 MC)检测其中MDA含量以及SOD和CAT活性; 另一部分样品置于70℃烘箱中烘干至恒重, 研磨成粉末, 分别称取0.25 g地上部和根系粉末于聚四氟乙烯消解管中, 加入7 mL浓硝酸, 室温下静置过夜.于电热消解仪(Digi Block ED54)上进行消解, 110℃加热2.5 h后冷却至室温, 加入1 mL H2O2摇匀, 110℃继续加热1.5 h, 最后于170℃下赶酸至近干, 用去离子水稀释并转移至25 mL容量瓶内过滤定容, 用原子吸收光谱仪(AnalytikJena, AAS ZEEnit700)测定样品Cd含量.
1.2.3 离子流速试验本试验设置处理组和对照组, 表面消毒后的种子均匀铺洒在育苗盘中, 黑暗条件下28℃恒温培养, 露白后将处理组转移至30倍稀释的菌液中继续培养.每个处理设5次重复.
参照韩立娜等[18]的方法, 分别在3 d和10 d苗龄时选择生长良好、长势一致的水稻幼苗, 用去离子水将根系表面冲洗干净, 然后将其浸泡在0.9 mmol·L-1的处理液(含0.9 mmol·L-1 CdCl2、0.1 mmol·L-1 KCl、0.1 mmol·L-1 CaCl2和0.3 mmol·L-1 MES, pH值为5.8)中, 胁迫10 min后, 将根系转移至同浓度测试液中, 利用非损伤微测系统(SIET system BIO-001A; Younger USA Sci. & Tech. Corp.)对根系的Cd2+流速进行实时监测, 测试点位为距根尖端300 μm的伸长区, 每次测定时间为10 min.导出数据使用旭月(北京)科技有限公司提供的软件转换成Cd2+流速.
1.3 数据处理利用Microsoft Excel进行相关数据的计算、统计及处理.利用SPSS软件进行统计分析, 新复极差法(Ducan's)进行多重比较和差异显著性检验.利用Origin 2019作图.
2 结果与分析 2.1 Burkholderia sp. Y4对Cd胁迫下水稻种子萌发的影响施加菌株Y4对Cd胁迫下水稻种子发芽势和发芽率的影响如图 1所示.与空白对照组相比, Cd胁迫下种子发芽势降低了17.7%, 而接种菌株Y4能够缓解Cd胁迫对种子萌发的抑制作用, 使种子发芽势提高了13.8%.Cd胁迫7 d后种子发芽率也有所降低, 但与空白对照组和菌株处理组无显著差异.然而, Cd处理7 d显著降低了水稻幼苗的根长和芽长(图 2), 其中Cd胁迫对根系生长的抑制作用更明显.与对照相比, Cd胁迫7 d和10 d后, 水稻幼苗根长分别降低56.8%和37.8%, 芽长分别降低12.5%和15.4%.而接种菌株Y4能够显著促进Cd胁迫下水稻幼根和幼芽的生长, 与Cd处理组相比, 接种菌株7 d和10 d后, 水稻幼苗根长分别增加83.3%和28.6%, 芽长分别增加12.2%和20.0%, 芽长基本恢复至无Cd胁迫水平.进一步对水稻幼根和幼芽的干重进行检测发现(图 3), 与空白对照相比, Cd胁迫下7 d和10 d苗龄的水稻幼根干重分别降低了51.4%和59.2%, 幼芽干重分别降低了7.8%和20.2%.而接种菌株Y4缓解了Cd胁迫造成的水稻幼根和幼芽生物量的降低, 与Cd胁迫相比, 水稻幼根干重分别增长了74.0%和113.2%, 幼芽的干重分别增长了25.5%和46.0%.由此可见, 施加菌株Y4不但能够缓解Cd对水稻种子萌发的抑制作用, 还能够促进Cd胁迫下水稻幼根和幼芽的生长.
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不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05), 下同 图 1 菌株Y4对Cd胁迫下水稻种子发芽势及发芽率的影响 Fig. 1 Effects of Burkholderia sp. Y4 on germination potential and germination rate of rice seeds under Cd stress |
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图 2 菌株Y4对Cd胁迫下水稻根长和芽长的影响 Fig. 2 Effects of Burkholderia sp. Y4 on root and shoot length of rice seeds under Cd stress |
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图 3 菌株Y4对Cd胁迫下水稻根干重和芽干重的影响 Fig. 3 Effects of Burkholderia sp. Y4 on root and shoot dry weight of rice under Cd stress |
施加菌株Y4不但能够促进Cd胁迫下水稻幼苗的生长, 还能缓解Cd造成的氧化应激(图 4).自由基作用于脂质发生过氧化反应, 氧化终产物MDA对细胞具有毒性, 其含量能够反映组织过氧化损伤程度.由图 4(a)可见, 与空白对照相比, Cd胁迫下水稻幼苗各部位MDA含量均显著增加, 地上部MDA含量与根系MDA含量分别从15.38 nmol·g-1和6.74 nmol·g-1增加到18.19 nmol·g-1和9.74 nmol·g-1, 增幅分别达18.3%和44.6%, 由此可见, Cd胁迫下的水稻幼苗氧化损伤水平升高.而施加菌株Y4能够缓解Cd胁迫造成的脂质过氧化损伤, 使幼苗地上部与根系MDA含量分别降至14.27和8.09 nmol·g-1, 与Cd处理组相比分别减少21.5%和16.9%, 也就是说, 菌株Y4降低了Cd造成的水稻幼苗氧化损伤水平.
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图 4 施加菌株Y4对Cd胁迫下水稻幼苗氧化应激水平的影响 Fig. 4 Effects of Burkholderia sp. Y4 on oxidative stress level of rice seedlings under Cd stress |
由图 4(b)可见, Cd胁迫下水稻幼苗地上部和根系中SOD活性显著升高, 分别从77.98 U·g-1和34.03 U·g-1增加到215.89 U·g-1和54.24 U·g-1, 增幅分别达176.9%和59.4%.而根施菌株Y4抑制了Cd胁迫下幼苗地上部和根系SOD活性的变化, 施菌组幼苗地上部和根系SOD活性分别为119.56 U·g-1和38.58 U·g-1, 与Cd处理组相比分别降低了44.6%和28.9%.也就是说, 根施菌株Y4后根系SOD活性恢复至与空白对照组无显著差异水平, 而地上部SOD活性的变化幅度也由176.9%降至53.3%.
由图 4(c)可见, Cd胁迫显著提高了水稻幼苗地上部CAT活性, 而降低了根系CAT活性, 地上部CAT活性从456.52 U·g-1显著增加至797.78 U·g-1, 增幅达74.8%, 而根系CAT活性从144.64 U·g-1降低至108.48 U·g-1, 降幅达25.0%.施加菌株Y4抑制了Cd胁迫下幼苗地上部和根系CAT活性的变化, 根系CAT活性恢复至与空白对照组无显著差异水平(131.08 U·g-1), 而地上部CAT活性的变化幅度也由Cd胁迫下的74.8%降低至21.5%.由此可见, 菌株Y4缓解了Cd胁迫下氧化应激造成的水稻幼苗抗氧化酶活性变化.
2.3 Burkholderia sp. Y4对不同品种水稻Cd积累量的影响施加菌株Y4不但能够促进水稻生长并缓解Cd毒性损伤和氧化应激, 还能抑制不同基因型水稻幼苗对Cd的吸收积累(图 5).在0.5 mg·L-1Cd处理下, 低Cd积累品种X24的地上部和根系Cd含量均低于高Cd积累品种T705, 而施加菌株Y4能够显著降低不同Cd积累型品种水稻幼苗各部位的Cd含量, 使X24和T705的地上部Cd积累量分别减少57.3%和79.2%, 根系Cd积累量分别减少24.1%和62.7%.由此可见, 施用菌株Y4能抑制不同品种水稻幼苗根系对Cd的吸收, 且与低Cd积累品种X24相比, 菌株Y4对高Cd积累品种T705幼苗Cd吸收积累的抑制作用更强.
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图 5 施加菌株Y4对不同基因型水稻幼苗Cd含量的影响 Fig. 5 Effects of Burkholderia sp. Y4 on Cd concentration in rice seedlings with different genotypes |
水稻不同部位间Cd积累量的比值可以用转移系数TF表示：
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转移系数TF反映了Cd在水稻各部位间的迁移能力.在0.5 mg·L-1 Cd胁迫条件下, X24与T705的转移系数TF(地上部/根系)分别为20.6%和17.5%, 而施加菌株Y4后, X24与T705的转移系数TF(地上部/根系)分别降为11.6%和9.8%.由此可见, 施用菌株Y4不但能够降低水稻幼苗根系对Cd的吸收积累, 还能抑制Cd从根系向地上部的转运.
2.4 Burkholderia sp. Y4对水稻根系及其Cd离子流速的影响利用非损伤微测等技术, 深入研究施加菌株Y4对水稻幼苗根系Cd吸收的影响(图 6), 结果发现, 施加菌株Y4促进了Cd胁迫下水稻三叶一心期幼苗根系的生长, 同时使根系表面附着一层黄色薄膜[图 6(a)].进一步对根系伸长区Cd2+流速进行检测, 非损伤微测系统传感器尖端检测位置如图 6(b)所示.由图 6(c)可见, 水稻根系暴露于Cd环境后, 水稻幼苗根系伸长区的Cd2+内流, 显示为负值, 而不同基因型水稻Cd2+流速表现出显著性差异.仅Cd处理下, 不同苗龄的高Cd积累品种T705的Cd2+流速均显著高于低Cd积累品种X24, 3 d苗龄时T705的Cd2+流速是X24的1.7倍, 10 d苗龄时T705的Cd2+流速是X24的1.9倍.施加菌株Y4后, Cd胁迫下不同品种幼苗根系伸长区Cd2+流速均显著降低, 3 d苗龄时, X24的Cd2+流速显著下降35.0%, T705的Cd2+流速显著下降36.0%; 10 d苗龄时, X24的Cd2+流速显著下降24.9%, T705的Cd2+流速显著下降44.6%.由此可见, 施加菌株Y4能够抑制不同品种水稻幼苗根系对Cd的吸收, 且在10 d苗龄时, 对T705的Cd2+内流的抑制作用较X24的更强.
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图 6 菌株Y4对Cd胁迫下水稻幼苗根系和伸长区Cd2+流速的影响 Fig. 6 Effects of Burkholderia sp. Y4 on roots and Cd2+ flux rate in the elongation zone of rice seedlings under Cd stress |
Cd胁迫会影响水稻基因表达和酶的活性, 抑制其种子萌发和生长[24].有研究表明, 根际促生菌可以通过代谢产生吲哚乙酸、赤霉素和铁载体等物质[25]或通过解磷等作用[26]促进植物生长, 其中部分菌株还兼具抑制植物重金属吸收和降低重金属生物有效性的作用[27].降Cd微生物通过多种方式抑制根系Cd吸收, 包括利用微生物细胞壁表面的巯基、羧基和羟基等配位基团, 以离子或共价键吸附Cd[28, 29]; 利用代谢产物与Cd形成稳定的难溶化合物或胞外络合物, 并形成细胞表面凝结相, 选择性地结合Cd以促进其生物矿化或沉淀反应[30]; 消耗能量利用离子转运系统将吸收的Cd隔离到细胞特定部位固定[31]等.由此可见, 除菌体细胞对Cd的吸附作用外, 降Cd菌还能通过生长代谢等活动, 降低根际环境中有效态Cd的含量以抑制水稻根对Cd的吸收, 并通过根表定殖成为拦截水稻Cd吸收转运的一道屏障.因此, 利用降Cd促生菌缓解Cd污染对水稻产生的毒性作用并抑制其吸收积累, 具有良好的前景.本研究以前期筛选的降Cd促生菌Burkholderia sp. Y4为材料, 该菌株Y4能够有效定殖在水稻根表和根际土壤中, 并且具有活性的菌株与死菌相比具有更强的Cd钝化能力, 在水稻全生育期盆栽试验中, 施加菌株Y4能够降低籽粒Cd积累量并提高其矿质元素含量[22].以此为基础, 本研究进一步利用种子萌发和幼苗试验, 检测菌株Y4对Cd胁迫下水稻生长、氧化应激损伤、根Cd吸收速率及Cd转运积累的影响, 进而深入探究Burkholderia sp. Y4缓解水稻Cd毒性并抑制其Cd吸收积累的作用机制.
Cd胁迫能够诱发氧化应激, 产生的活性氧在体内积累导致氧化损伤[32], 影响植物生长发育.MDA是活性氧自由基作用于膜脂发生过氧化反应的终产物, 其含量反映了过氧化损伤程度, 是逆境下植株受毒害损伤程度的重要指标[33, 34].而活性氧自由基的产生也影响了体内的抗氧化体系[35], 包括SOD和CAT等抗氧化酶的活性[36, 37].本研究发现, Cd胁迫下水稻幼根和幼芽的长度和生物量都显著降低, 同时幼苗地上部与根系中Cd含量和MDA含量显著增加, 证明Cd胁迫造成水稻脂质过氧化损伤, 对幼苗产生毒害作用并抑制其正常生长.施加Burkholderia sp. Y4可以有效提高Cd胁迫下水稻种子的发芽势, 以及水稻根长、芽长和生物量, 有效缓解了Cd对水稻生长的抑制作用.深入研究发现, 施加菌株Y4显著降低了水稻幼苗地上部与根系中氧化损伤产物MDA的含量, 缓解了Cd胁迫造成的氧化应激和毒性损伤.同时, Cd胁迫下水稻抗氧化酶活性的变化也在菌株Y4的作用下得到缓解, 根系SOD和CAT的活性水平恢复至无Cd胁迫水平, 而地上部SOD和CAT的活性变化也大幅降低.由此可见, 菌株Y4不是通过提高抗氧化酶活性缓解Cd胁迫下水稻氧化应激, 而是抑制了氧化应激诱导的包括抗氧化酶调控在内的各种反应, 因此菌株Y4主要是通过抑制水稻对Cd的吸收, 从根本上降低Cd在植株内积累造成的毒性损伤和生长抑制.
水稻根系是Cd吸收的主要器官, 其Cd积累量与根际有效Cd浓度以及根系对Cd的吸收能力相关[38, 39], 不同基因型水稻根系对Cd的吸收积累能力不同.本研究利用不同Cd积累特性的水稻品种X24和T705, 开展菌株Y4对水稻Cd吸收转运作用的研究发现, 幼苗根系伸长区Cd2+流速在不同基因型水稻间存在差异, 在3 d和10 d苗龄时, 低Cd积累品种X24的Cd2+流速都显著低于高Cd积累品种T705.施加菌株Y4能够改变水稻根表膜结构, 并降低不同品种不同苗龄水稻根系Cd2+内流的瞬时速率, 证明菌株Y4对水稻根系Cd吸收的抑制作用不因其品种的差异而改变.该结果与不同处理组间水稻幼苗根系Cd含量差异相符, 由此可见, 菌株Y4通过降低伸长区Cd2+内流速率, 抑制了水稻根系对环境中Cd的吸收和积累.同时, 施加菌株Y4还降低了不同品种水稻中Cd从根系向幼苗地上部的转移系数, 抑制了Cd从根向地上部的转运, 进而降低了幼苗地上部Cd积累量, 并且菌株Y4对高积累品种T705的降Cd效果要高于X24.Cd主要通过“蹭车”的方式, 借助营养元素阳离子通道, 进入水稻根系[40, 41], 并向地上部转运[42, 43], 同时调控Cd在不同器官和细胞组分之间的分布[44].不同品种水稻Cd转运相关蛋白基因型的不同, 导致了其Cd耐性和吸收积累特性的差异, 以及不同降Cd剂在分子层面的作用机制差异[45].由此推测, 菌株Y4对水稻幼苗Cd从根向地上部转运的抑制作用, 以及对不同Cd积累特性水稻品种降Cd效果的差异, 很可能与Burkholderia sp. Y4对水稻Cd转运相关蛋白的调控作用有关, 相关分子机制还有待深入研究.
综上所述, Burkholderia sp. Y4能够有效缓解Cd胁迫对水稻生长的抑制作用, 提高种子萌发率, 促进幼根和幼芽的生长, 降低Cd胁迫下植株内氧化应激反应和毒性损伤.根施Burkholderia sp. Y4能够改变水稻根表膜结构, 降低幼苗根系伸长区的Cd2+内流速率, 从而抑制根际Cd向根内的转移, 同时还降低了根内Cd向幼苗地上部的转运率, 显著减少不同基因型水稻幼苗根系和地上部的Cd积累量.因此, Burkholderia sp. Y4作为水稻降Cd微生物菌剂具有一定的应用前景.
4 结论(1) 施加Burkholderia sp. Y4有效缓解了Cd胁迫下的毒性损伤和氧化应激反应, 促进了水稻幼苗的生长.
(2) 根施Burkholderia sp. Y4显著降低了水稻根系伸长区Cd2+流速和幼苗Cd转移系数, 抑制了幼苗根系和地上部中的Cd积累.
(3) 水稻品种T705的根系Cd2+流速和幼苗各部位Cd含量均显著高于品种X24, 施加Burkholderia sp. Y4对T705的降Cd效果更明显.
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