2022, Vol. 43
2. 工业聚集区污染控制与生态修复教育部重点实验室, 广州 510006;
3. 佛山市化尔铵生物科技有限公司, 佛山 528300;
4. 华南理工大学化学与化工学院, 广州 510641
, QIN Jia-fu1,2 , WANG Xiao-jun1,2,3
, CHEN Hao-chuan1,2 , ZHU Zi-jian1,2 , CHEN Zhen-guo2,3,4
2. Key Laboratory of Pollution Control and Ecosystem Restoration in Industry Cluster, Ministry of Education, Guangzhou 510006, China;
3. Hua An Biotech Co., Ltd., Foshan 528300, China;
4. School of Chemistry and Chemical Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China
厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX)相较于传统硝化反硝化工艺, 具有不消耗有机碳源、污泥产率低和能源消耗低等特点[1~3], 作为一种应用前景广阔的生物脱氮技术, 吸引了大量国内外学者的关注.然而在低总氮浓度条件下厌氧氨氧化脱氮效率低的问题限制了其在污水处理中的应用[4, 5].吕恺等[6]的研究采用一段式亚硝化厌氧氨氧化SMBBR处理浓度为100 mg·L-1的氨氮废水, 总氮去除率(NRE)为(51.58±6.80)%.Akaboci等[7]的研究采用PNA-SBR反应器处理75 mg·L-1的氨氮废水, 结果表明, 在进水总氮负荷(NLR)为(0.61±0.25)kg·(m3·d)-1的条件下, 仅获得(52.5±12.5)%的总氮去除率.此外在低氨氮浓度条件下游离氨(FA)和游离亚硝酸(FNA)浓度较低, 对亚硝酸盐氧化菌(NOB)的抑制减弱甚至消失[8, 9], 厌氧氨氧化菌(AnAOB)活性受到抑制, 难以维持高效稳定脱氮.因此, 提高AnAOB活性和系统稳定性有助于促进ANAMMOX工艺在低氨氮浓度条件下的实际应用.
Fe2+是含氮废水最常见的金属离子, 也是微生物生长的必要营养元素[10, 11].在ANAMMOX过程中, 适宜浓度的Fe2+能够促进AnAOB对铁的积累和亚铁血红素c的合成, 从而提高AnAOB活性和脱氮能力[12~14].张黎等[15]的研究发现, 当c(Fe2+)为0.085 mmol·L-1时, 样品中亚铁血红素c达0.143 μmol·mg-1, 是同期对照反应器的2.04倍.Zhang等[16]的试验结果表明, 低浓度的Fe2+(1~5 mg·L-1)可以有效促进AnAOB活性, 而高浓度Fe2+(10~30 mg·L-1)则会不同程度地抑制ANAMMOX过程.相比于单级ANAMMOX系统, 两级ANAMMOX系统处理低氨氮废水可以实现进一步脱氮从而获得更高的总体脱氮效率[17, 18].然而, 关于Fe2+是否能促进低总氮浓度条件下的厌氧氨氧化脱氮效率鲜有报道, 此研究对于推进厌氧氨氧化工艺的应用具有较大的科学价值和应用指导意义.
本研究考察了不同浓度Fe2+条件对串联两级ANAMMOX生物膜反应器在低总氮浓度下的脱氮性能, 并探究不同浓度Fe2+对系统EPS、亚铁血红素c含量、AnAOB活性和微生物群落结构变化等影响情况, 以期为利用Fe2+促进厌氧氨氧化菌活性以实现厌氧氨氧化生物膜系统在低总氮浓度下的高效稳定脱氮提供理论指导.
1 材料与方法 1.1 试验装置与运行条件本试验装置如图 1所示.两个ANAMMOX生物膜反应器(R1和R2)尺寸设计完全一样, 均由有机玻璃制成, 长和宽均为30 cm, 高为70 cm, 持水高度为60 cm, 有效容积为54 L.反应器采用温控加热棒将温度控制在(31±2)℃, R1反应器和Fe2+进水瓶外部用黑色塑料包裹以避光.两个反应器内都装有纤维材质填料.本试验过程R1出水和R2进水串联运行, 利用高度差使水流通过, 氮素和Fe2+进水均通过蠕动泵进行调控.本试验共分为两个阶段进行.第一个阶段(第1~132 d, 包括启动和负荷提升)通过缩短水力停留时间(HRT)的方式逐步提升NLR, 探索反应器脱氮性能大小.第二个阶段(第133~202 d)为Fe2+影响试验阶段, 此阶段保持NLR不变, 分别在进水ρ(Fe2+)为5、10和15 mg·L-1的条件下考察Fe2+对两级ANAMMOX生物膜系统脱氮性能的影响, 每个浓度连续运行至少3周.
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图 1 两级厌氧氨氧化生物膜反应器装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of two-stage ANAMMOX biofilm reactor |
本试验用水采用人工配水, NH4+-N(65 mg·L-1)和NO2--N(85 mg·L-1)分别用NH4Cl和NaNO2进行配置, 采用NaHCO3作为碱度, 浓度为400 mg·L-1.其他组分包括：KH2PO4 68 mg·L-1、MgSO4·7H2O 150 mg·L-1和CaCl2 68 mg·L-1.微量元素按EDTA 5 g·L-1和FeSO4·7H2O 5 g·L-1配置, 投加量为1 mL·L-1.不同浓度Fe2+用FeSO4·7H2O提供, 浓度按需配置.
接种污泥取自实验室培养成熟的厌氧氨氧化污泥, 混合液悬浮挥发性固体浓度[ρ(MLVSS)]为4 240 mg·L-1.
1.3 亚铁浓度对AnAOB活性影响批次试验从运行稳定的ANAMMOX反应器取一定量污泥加入200 mL血清瓶中, 试验前先用蒸馏水清洗3遍以去除杂质, 分别向5个血清瓶中各加入50 mL均质污泥和150 mL蒸馏水, 然后以纯度99.9%以上的N2曝气30 min以排除氧气影响, 加入ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)均分别为21.55 mg·L-1和28.45 mg·L-1, ρ(Fe2+)分别按照0、5、10、15和20 mg·L-1添加.为保证系统密闭性, 瓶口用橡胶塞密封, 瓶身用黑布包裹.血清瓶底部配有磁力搅拌装置, 转速为140 r·min-1.在常温条件下每个Fe2+浓度下做3组平行脱氮试验, 用注射器间隔取样分析NH4+-N、NO2--N和NO3--N浓度变化, 试验结束后取50 mL混合液测定MLVSS并计算比厌氧氨氧化活性(SAA).
1.4 胞外聚合物(EPS)的提取与测定方法EPS的提取与测定参照文献[19]来进行.反应运行到132、159、180和202 d时, 分别在R1和R2反应器中取出污泥样品5 mL, 在8 000 r·min-1条件下离心15 min, 弃去上清液, 加入10 mL的PBS缓冲液, 然后在超声波(40 kHz, 120 W)条件下超声3 min, 再将混合物置于80℃水浴加热30 min, 最后在8 000 r·min-1条件下快速离心15 min, 取出上清液通过0.45 μm微孔滤膜过滤后即可完成EPS的提取.对上述提取的EPS进行蛋白质(PN)和多糖(PS)含量的测定.PN采用修正的Folin-Lowry法测定, PS采用蒽酮比色法测定.
1.5 亚铁血红素c的测定亚铁血红素c的提取与测定参照文献[20]来进行.反应运行到132、159、180和202 d时, 分别在R1和R2反应器中取出污泥样品5 mL, 将污泥悬浮于10 mL PBS缓冲液, 然后在冰浴中超声污泥混合液5 min, 最后在12 000 r·min-1, 4℃下离心15 min, 过滤溶液后, 用Pyridine-NaOH分光光度法在紫外分光光度计上测定.
1.6 分析与计算方法NH4+-N、NO2--N和NO3--N均采用国家标准方法测定[21]; pH值采用PHS-3C型pH计测定; 溶解氧(DO)和温度采用HQ-30d便携式溶氧仪; MLVSS采用重量法测定.单因素方差分析(ANOVA, 置信水平95%)基于SPSS 25.0软件完成.NLR、总氮去除负荷(NRR)和NRE参照文献[22]的公式计算得到.SAA参照文献[23]计算得到.
1.7 高通量测序采用高通量测序方法分析不同运行阶段条件下反应器生物膜样品中微生物群落结构和变化情况.测试方法如下：取适量污泥样品, 用Powersoil DNA试剂盒进行DNA提取.采用细菌通用引物对污泥样品进行16S rRNA扩增, 引物序列和扩增体系参照文献[24], 引物为16S rRNA V4高变区通用引物, PCR扩增片段大小为480 bp.最后通过Novasep-PE250测序平台对样品进行测序.整个测序过程委托上海派森诺生物科技有限公司完成.
2 结果与讨论 2.1 投加Fe2+前后两级ANAMMOX生物膜反应器运行效果对比两个试验阶段反应器氮素浓度、负荷和去除率的变化如图 2所示.在第一阶段, R1反应器的NLR由0.12 kg·(m3·d)-1提高到了0.62 kg·(m3·d)-1, R1的NRR由0.07 kg·(m3·d)-1提高到了0.32 kg·(m3·d)-1, R2的NRR由0.01 kg·(m3·d)-1提高到了0.11 kg·(m3·d)-1.随着NLR的提高, R1和R2出水NH4+-N、NO2--N和总氮(TN)浓度均表现出先降低后逐渐升高的趋势.其中R1出水ρ(TN)从64.40 mg·L-1下降到最低时的32.55 mg·L-1再逐渐升高到72.46 mg·L-1, R2出水ρ(TN)从31.67 mg·L-1下降到最低时的18.90 mg·L-1再逐渐升高到51.69 mg·L-1.此现象可能是由于反应器初期AnAOB处于适应阶段, 处理能力有限, R1和R2的出水氮素较高; 随着运行时长的增加AnAOB逐渐富集, 反应器稳定性和脱氮能力得以增强[25], 反应器出水氮素浓度逐渐降低.随着HRT缩短, 过快的流速使得进水底物与反应器内微生物的接触反应时间大大缩短, 导致该阶段后期出水氮素浓度明显升高[22].在第1~119 d, 随着NLR不断升高, 两级NRE由87.40%逐步降低到阶段末期的70.17%, 而R1和R2的NRR均逐渐升高.从图 2(a)和2(b)可知, 即使R1出水各氮素浓度随NLR升高而不断升高, R2的平均出水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)分别在5.52 mg·L-1和5.32 mg·L-1以下(最低时均接近0 mg·L-1).这说明在一定NLR范围内, R2反应器可以进一步脱除R1反应器出水剩余氮素, 这也验证了两级ANAMMOX生物膜反应器处理低浓度氨氮废水的可行性和稳定性.随着在第119~132 d将NLR提高到0.62 kg·(m3·d)-1, 反应器脱氮性能出现恶化, R1和R2的NRR均降低, 且R2平均出水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)明显升至12.06 mg·L-1和10.53 mg·L-1, NRE也进一步降至66.25%.
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(a)R1反应器进出水三氮浓度变化; (b)R2反应器出水三氮浓度变化; (c)R1和R2反应器NLR和NRR变化; (d)R1和R2反应器出水TN和NRE变化 图 2 两级ANAMMOX的运行效果 Fig. 2 Operational performance of two-stage ANAMMOX reactor |
有研究表明, Fe2+对厌氧氨氧化反应有显著影响[26~30], 本试验第二阶段考察了不同浓度Fe2+促进两级ANAMMOX生物膜反应器脱氮性能的可行性.表 1的单因素ANOVA方差分析结果进一步显示了不同浓度Fe2+对ANAMMOX脱氮性能的影响存在极显著性差异(P＜0.01).而由图 2可知, 投加Fe2+条件下反应器氮素浓度相比于未投加Fe2+时都有明显下降.结合图 2(c)和2(d)可以发现, 当ρ(Fe2+)为10 mg·L-1时, R1的出水TN、NRR和NRE均低于ρ(Fe2+)为5 mg·L-1时的相应数值; 但当ρ(Fe2+)为15 mg·L-1时, 系统脱氮性能反而开始变差, 这一变化趋势与Zhang等[16]的研究结果一致, 表明Fe2+较高时会对AnAOB活性产生抑制, 使反应器脱氮性能变差.由图 2(a)和2(b)还可发现, 进水ρ(Fe2+)为5和10 mg·L-1时, 第1 d的出水总氮会出现急剧升高的趋势, 但随后R1和R2出水各氮素浓度逐渐降低, 最终经过两级ANAMMOX处理后的R2出水NH4+-N和NO2--N均能降至5 mg·L-1以下, 且随着ρ(Fe2+)升至10 mg·L-1, R2出水NO3--N浓度也逐渐降低, 两级ANAMMOX膜生物反应器的出水TN浓度更低, NRE升至81.71%.此结果表明R1系统消耗剩余的低浓度Fe2+可以有效提高R2反应器中AnAOB活性从而提高系统脱氮性能, 两级ANAMMOX生物膜反应器的串联模式具备一定的Fe2+抗冲击能力.随着ρ(Fe2+)升高至15 mg·L-1, R2平均出水ρ(NO2--N)为2.61 mg·L-1, 但平均出水ρ(NH4+-N)升高至7.53 mg·L-1, 导致R2出水TN浓度升高, 脱氮性能下降.根据Strous等[31]的报道, n(NO2--N)∶n(NH4+-N)=1.32是厌氧氨氧化反应适宜的摩尔比, 而R2出水NH4+-N浓度偏高, NO2--N浓度较低可能是因为投加较高浓度Fe2+抑制AnAOB的活性, NH4+-N基质难以进一步被利用.
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表 1 不同浓度Fe2+对ANAMMOX脱氮性能影响的单因素ANOVA方差分析 Table 1 One-way ANOVA analysis results on the effect of different Fe2+ concentrations on nitrogen removal performance of ANAMMOX |
2.2 Fe2+对ANAMMOX脱氮性能的影响 2.2.1 反应器不同运行条件下EPS的变化
EPS是指一定条件下, 由微生物代谢产生并黏附在细胞壁外的一种高分子聚合物, 其主要成分有PS、PN和核酸[32].EPS不仅能够提供细胞生长的结构基质, 而且在抵抗环境压力等方面起着重要作用[33~35].此外, EPS中PN/PS的比值在污泥的颗粒化和稳定过程也起着至关重要的作用.PN/PS越高, 污泥稳定性越好[36].不同进水Fe2+浓度下反应器的生物膜PN和PS含量变化如图 3所示.
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图 3 两级反应器不同浓度Fe2+作用下PN和PS的变化 Fig. 3 Variation in PN and PS under different Fe2+ concentrations in a two-stage ANAMMOX reactor |
由图 3可知, 投加了Fe2+之后, 两级反应器的PN和PS含量都有所提高, 且随着Fe2+浓度的升高, PN/PS比值越来越高.在R1反应器中, ρ(Fe2+)为0 mg·L-1时, 生物膜ω(PN)和ω(PS)分别为115.68 mg·g-1和36.88 mg·g-1.当ρ(Fe2+)升高到5 mg·L-1时, 生物膜ω(PN)和ω(PS)分别升至196.64 mg·g-1和40.25 mg·g-1; 随着ρ(Fe2+)继续升高到10 mg·L-1和15 mg·L-1, PN和PS含量均有所下降但仍高于ρ(Fe2+)为0 mg·L-1时的PN和PS含量.结合图 2结果可推测, 由于低浓度Fe2+有利于污泥絮体的混凝和沉降, 生物膜会分泌大量PN和PS来抵御这种环境变化以提升污泥环境抗性[37], 从而促进脱氮, 但较高浓度的Fe2+对微生物的毒性抑制作用增强会导致反应器脱氮性能下降.相比于R1, R2反应器中的PN和PS含量提升得则比较缓和, 可能是因为R1出水Fe2+浓度较低, 污泥絮体的混凝和沉降作用不明显.
2.2.2 亚铁血红素c含量的变化Fe2+参与亚铁血红素c的形成过程, 而亚铁血红素c在厌氧氨氧化代谢过程中作为联胺合成酶(HZS)和亚硝酸盐还原酶(NIR)等主要酶蛋白的辅因子, 在厌氧氨氧化脱氮过程发挥着重要作用[38~40].在每个阶段亚铁血红素c的含量(以VSS计, 下同)和AnAOB活性有直接关系[11, 20, 41].由图 4可见, 在R1反应器中, 当ρ(Fe2+)为0 mg·L-1时, mB(亚铁血红素c)为(3.99±0.35) μmol·g-1, 当ρ(Fe2+)提升到10 mg·L-1时, c(亚铁血红素c)达到(8.49±0.34) μmol·g-1, 是对照组[ρ(Fe2+)=0 mg·L-1]的2.1倍.随着ρ(Fe2+)进一步升高到15 mg·L-1, mB(亚铁血红素c)降低到(5.20±0.29) μmol·g-1, 此结果与反应器脱氮性能的变化一致.因此, 适宜浓度Fe2+的添加补充了厌氧氨氧化系统的微量元素Fe, 能够提高亚铁血红素c含量以及功能酶活性, 从而促进厌氧氨氧化脱氮, 而Fe2+过高时反而抑制酶活性, 抑制脱氮作用[13, 42, 43].在R2反应器中, 随着ρ(Fe2+)由0 mg·L-1逐渐提升到15 mg·L-1, mB(亚铁血红素c)由(1.00±0.24) μmol·g-1逐渐升高到(2.48±0.22) μmol·g-1, 这说明起始Fe2+浓度的升高能够提高R2反应器内Fe2+的浓度, 从而促进亚铁血红素c的合成.
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图 4 两级反应器不同浓度Fe2+作用下亚铁血红素c的变化 Fig. 4 Variation in heme c under different Fe2+ concentrations in a two-stage ANAMMOX reactor |
对于厌氧氨氧化生物膜系统, 当Fe2+浓度过高时, Fe2+会通过微生物吸附、跨膜转运和胞内积累等方式进入微生物, 当Fe2+浓度超过生物膜的吸附能力, 反应器微生物活性会受到抑制, 进而导致脱氮性能下降[16, 44].为进一步验证不同浓度Fe2+作用下对厌氧氨氧化过程的影响和响应差异, 采用了稳定运行的R1反应器生物膜样品进行了Fe2+单因素影响批次试验, 结果如表 2和图 5所示.由表 2的单因素ANOVA分析结果可以确定：起始ρ(Fe2+)为0、5、10、15和20 mg·L-1时对ANAMMOX菌活性的影响存在极显著性差异(P＜0.01).由图 5可知, 当起始投加ρ(Fe2+)为0 mg·L-1时, SAA为(31.03±3.38)mg·(g·d)-1, 当ρ(Fe2+)提高到5 mg·L-1和10 mg·L-1时, SAA分别升至(95.52±5.26) mg·(g·d)-1和(111.15±20.02) mg·(g·d)-1.这说明此低浓度Fe2+范围内对厌氧氨氧化污泥的活性有着明显的促进作用.其中ρ(Fe2+)为10 mg·L-1对污泥活性的促进效果相较于对照组的污泥活性提升了3.6倍, 略高于ρ(Fe2+)为5 mg·L-1时的3.1倍.当ρ(Fe2+)提升到15 mg·L-1时, Fe2+对系统整体脱氮性能的促进作用开始减弱, SAA降低到了(65.65±14.18) mg·(g·d)-1.而当ρ(Fe2+)进一步升至20 mg·L-1时表现出明显抑制作用, SAA降低到(11.83±2.51) mg·(g·d)-1, 仅为对照组的38%.此结果与前述两级ANAMMOX生物膜反应器在不同浓度Fe2+投加条件对脱氮性能的影响情况相吻合.
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表 2 不同Fe2+对ANAMMOX菌活性影响的单因素ANOVA方差分析 Table 2 One-way ANOVA analysis results on the effect of Fe2+ concentrations on AnAOB activity |
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图 5 不同浓度Fe2+对ANAMMOX菌SAA的影响 Fig. 5 Effect of different Fe2+ concentrations on SAA of AnAOB |
图 6为Fe2+投加前后R1和R2反应器污泥属水平下优势菌群分布变化.由图 6(a)可知, Candidatus_Kuenenia是具有厌氧氨氧化能力的优势菌群.在各Fe2+浓度条件下, R1中Candidatus_Kuenenia的相对丰度分别为3.83%、19.27%、16.18%和16.25%, 表明适当浓度Fe2+的添加有效促进了厌氧氨氧化菌的富集生长.由图 6(b)可知, 各Fe2+浓度条件下R2中Candidatus_Kuenenia相对丰度分别为3.09%、3.74%、4.22%和3.30%.ρ(Fe2+)为10 mg·L-1时的厌氧氨氧化菌富集效果最好, 这与污泥活性和反应器运行效能的变化一致.综上可以推测, Fe2+可以促进Candidatus_Kuenenia丰度的增加, 加上系统异养反硝化菌的存在, 从而实现两级ANAMMOX生物膜反应器在低总氮浓度下高效稳定地脱氮.此外, 有研究表明Candidatus_Kuenenia菌属下的一些ANAMMOX菌能够在发生厌氧氨氧化反应的同时利用NO3--N氧化Fe2+[45, 46], 本研究中是否存在此现象还需后续进一步探索.
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(a)R1反应器, (b)R2反应器; R1_Fe0表示R1反应器中Fe2+浓度为0 mg·L-1, 以此类推 图 6 Fe2+存在下反应器污泥中属水平优势菌群分布 Fig. 6 Distribution of dominant bacteria at the genus level in sludge under the presence of Fe2+ in a two-stage reactor |
(1) 采用两级ANAMMOX生物膜系统处理低浓度总氮废水, 最高NLR可达0.62 kg·(m3·d)-1, NRE平均值为67.13%.
(2) 长期投加5、10和15 mg·L-1的Fe2+能够有效提高两级ANAMMOX生物膜系统脱氮性能.其中ρ(Fe2+)为10 mg·L-1的促进作用最明显, 最高NRE可达81.71%.添加适量的Fe2+有助于EPS的分泌和亚铁血红素c的合成, 以进一步提高反应器的污泥稳定性和脱氮性能.
(3) 不同浓度Fe2+对AnAOB活性的短期影响存在显著性差异. ρ(Fe2+)为5、10和15 mg·L-1时, 对AnAOB活性有明显促进作用, 其中ρ(Fe2+)为10 mg·L-1时的SAA是对照组的3.6倍.当ρ(Fe2+)为20 mg·L-1时, AnAOB活性受到明显抑制, 其SAA仅为对照组的38%.
(4) 不同Fe2+浓度条件下能促使优势菌属Candidatus_Kuenenia相对丰度发生变化. ρ(Fe2+)为10 mg·L-1时, R1和R2中Candidatus_Kuenenia的相对丰度分别从ρ(Fe2+)为0 mg·L-1时的3.83%和3.09%增至16.18%和4.22%.
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