2022, Vol. 43
2. 福建农林大学资源与环境学院, 福州 350002;
3. 福州大学环境与安全工程学院, 福州 350116
, HUANG Ya-ling1 , ZHANG Rui-rui1 , YUE Chen1,2 , LI Fei-xiang1,3 , ZHANG Chao-yue1,2 , MU Jing-li1
2. College of Resources and Environment, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;
3. College of Environment and Safety Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350116, China
人工湿地(constructed wetland, CW)由植物-微生物-基质三者组成, 是通过模拟自然湿地系统, 人为构建和控制的一种废水处理工艺, 具有操作简单, 投资成本低、易管理、低能耗和生态效果显著等优点[1~3].该系统通过沉淀、截留、吸附、氧化还原和生物转化等物理、化学和生物多重协同作用最终实现对污染物的高效去除[4~6].其中, 微生物是人工湿地污染物降解的主要驱动者和执行者, 如：厌氧细菌可将有机物分解为二氧化碳和甲烷; 好氧细菌则通过呼吸作用将有机物分解为水和二氧化碳; 亚硝化细菌可将总氨氮氧化为亚硝酸盐氮, 亚硝酸氮被硝化细菌的亚硝化作用进一步氧化为硝酸盐氮, 反硝化细菌可将硝酸盐氮转化为氮气等[7, 8].此外, 曝气处理可有效提高人工湿地细菌硝化作用的强度[9~12].目前, 人工湿地已经被成功运用于农村生活污水、畜禽养殖废水、富营养化水体、工业废水和食品废水等污染物控制领域[13~15].
Illumina高通量测序由于其通量高、准确率高和成本低等优点, 目前已经被广泛应用于环境样本中微生物的检测[16]. rDNA测序技术(DNA测序)的发展帮助微生物学家可以更好地认识环境样本中微生物的多样性及其群落结构[17, 18].然而, 由于DNA在胞外环境及死亡的细胞中仍可存活一段时间, 因此基于DNA测序容易受到胞外溶解态DNA、死亡细胞和碎屑等的影响, 其测序结果反映的是样本中存在的类群[19]. 相比于DNA, RNA在胞外的环境中更容易被降解, 同时rRNA序列信息可代表细胞中核糖体的活跃性或蛋白合成的潜能, 因此rRNA测序技术(RNA测序)可反映环境样本中活跃的类群[20].但RNA测序同样存在一定的局限性, 如：其序列信息并不是细胞活跃性的直接指标[21].基于两种测序方案的优势及局限性, 可以将其结合起来作为一种互补的方案, 更好地反映环境样本中存在的类群及活跃的类群[22~24].此外, RNA∶DNA可作为表征微生物类群/物种的代谢活性[25].
基于DNA和RNA高通量测序技术, 分析养殖污水和不同曝气处理人工湿地单元水体中细菌多样性、群落结构、代谢活性和细菌群落功能的变化.阐明养殖污水在进入不同曝气处理人工湿地后细菌群落结构的变化, 代谢活性的变化及其主要调控因子.此外, 本研究还通过对细菌功能的预测揭示人工湿地在处理污染物及营养盐过程中细菌群落的作用.
1 材料与方法 1.1 人工湿地构建本研究人工湿地由垂直潜流和水平潜流串联而成[图 1(a)], 依据不同的曝气方式可分为：垂直潜流和水平潜流湿地均不曝气组(A2); 垂直潜流和水平潜流湿地均曝气组(A3); 仅上行垂直流湿地曝气组(A4); 仅水平潜流湿地曝气组(A5)[图 1(b)]. 4组人工湿地进水均为福建省淡水养殖良种繁育基地养殖污水A1(对照组).本研究人工湿地建立在福建省淡水养殖良种繁育科研中试基地, 水平潜流人工湿地为长方体结构, 面积为0.48 m2(长0.8 m, 宽0.6 m), 垂直潜流人工湿地为圆柱形结构, 面积为0.5 m2, 半径为0.4 m, 两种类型人工湿地池体深度均为0.8 m.人工湿地填料为大沸石、小沸石、砾石和麦饭石, 各基质间的孔隙率分别为48%、45%、48%和45%.水平潜流和垂直潜流人工湿地填料深度均为0.65 m, 且各人工湿地中均种植海马齿.本研究人工湿地采用间歇式运行方式, 总的反应时间为4 d, 其中进水时间30 min, 反应时间为3 d 17 h, 排水时间为30 min, 排空闲置6 h.
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A2：无曝气; A3：曝气; A4：上行垂直流曝气; A5：水平潜流曝气; 长方体容器：水平潜流人工湿地; 圆柱形容器：垂直潜流人工湿地 图 1 人工湿地构建示意和实验装置 Fig. 1 Schematic diagram and picture of CWs |
采集进水(福建省淡水养殖良种繁育基地养殖污水)作为对照组, 同时采集不同处理组人工湿地停留3 d的水样0.5~1 L, 水样带回实验室后立即用0.45 μm玻璃纤维滤膜过滤, 收集的滤膜保存至-20℃冰箱.测定的营养盐指标包括：总氮(TN)、硝态氮(NO3--N)、氨氮(NH4+-N)、总磷(TP)、总溶解态磷(TDP)和正磷酸盐(SRP).营养盐分析方法参照文献[26].
1.3 人工湿地细菌样本收集采集进水养殖污水1~2 L作为对照组, 在各串联组人工湿地单元出水口处(水平潜流湿地单元出水口)采集水样1~2 L.水样采集完成之后立即带回实验室, 首先经过200 μm筛娟预过滤, 去除杂质及大粒径生物干扰.预过滤的水样通过蠕动泵富集到0.2 μm的核酸纤维膜上(直径142 mm, Milipore, USA).为减少样本中RNA样本的丢失, 本实验中通过调节蠕动泵控制水样过滤速度为0.5 L·min-1.收集的膜样立即放置-80℃冰箱中保存.
1.4 细菌DNA/RNA共提取、PCR扩增及Illumina高通量测序本研究采用AllPrep DNA/RNA Min Kit(Qiagen, #80204, Germany)试剂盒对样本中细菌DNA/RNA进行共提取.在实际操作中本研究对试剂盒操作步骤进行了适当优化, 确保每个样品可获得高质量的DNA及RNA.获得的RNA样本首先经过gDNA wipeout buffer (Qiagen, #205311, Germany)处理去除可能存在的基因组DNA, 纯化的RNA样本通过QuantiTect Reverse Transcription Kit(Qiagen, #205311, Germany)试剂盒反转录为cDNA.获得DNA及cDNA进行进一步的PCR扩增.本研究扩增的片段为16S V3~V4区, 引物片段为：上游引物341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′), 下游引物805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)[27].PCR体系(25 μL)包含：12.5 μL 2×Taq PCR mix (Takara, China), ≤1 μg DNA或cDNA模板, 0.1 μmol·L-1上游引物, 0.1μmol·L-1下游引物及ddH2O. PCR扩增步骤如表 1所示.PCR扩增产物通过2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检验, 对合格的产物进行磁珠纯化并采用酶标定量, 依据PCR产物浓度进行等量混样, 混匀后继续通过2%浓度的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检验.获得的目的条带通过QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, #28704, Germany)试剂盒进行回收.回收的PCR产物干冰保存并送至北京诺禾致源科技股份有限公司(Novogene)通过NovaSeq6000进行上机测序.
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表 1 16S PCR反应步骤1) Table 1 16S polymerase chain reaction |
1.5 序列处理及数据分析方法
依据Barcode和引物序列从下机序列中拆分出各个样本数据, 各样本序列截取Barcode和引物序列后使用FLASH[28](V1.2.7, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)进行拼接.拼接后得到的原始序列参照QIIME[29](V1.9.1http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html) 进行严格的质控.质控后得到的序列通过GitHub[30](https://github.com/torognes/vsearch/)检测嵌合体序列并移除.最终获得的高质量序列通过Uparse[31](v7.01001, http://www.drive5.com/uparse/)以97%的相似度聚类形成操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs).OTUs中出现频数最高的序列作为其代表序列, 代表序列通过Mothur方法比对SILVA138[31](http://www.arb-silva.de/)中的SSUrRNA数据库[32]进行物种分类注释(阈值为0.8~1).进一步分析中, 去除了只在一个样本中出现的OTUs、只含有一条序列的OTUs以及物种注释为非细菌的OTUs.为避免样本间因测序深度不同带来的误差, 本研究中所有DNA/RNA测序结果均以样本中最小序列数进行均一化处理, 均一化处理完成后各样本序列均为33 210条.
本研究中所有统计分析均基于R语言软件完成(V. 4.0.5)[33].主坐标分析(principal coordinates analysis, PCoA)用来检测样本间细菌群落结构的差异.热图(Heatmap)用来展示细菌代谢活性在各样本间的差异.细菌代谢活性(RNA∶DNA)基于OTUs在RNA/DNA测序结果中的相对丰度计算获得.典型关联分析(canonical correlation analysis, CCA)用来检测细菌代谢活性与环境因子间的相关性.FAPROTAX(functional annotation of prokaryotic taxa)用于预测细菌群落的功能.
2 结果与分析 2.1 人工湿地不同处理组营养盐浓度本研究中获得的营养盐参数：TN、NO3--N、NH4+-N、TP、TDP和SRP在对照组及各处理组间的浓度见表 2.TN在各处理组间去除率为31.58%~50.31%, 其中无曝气组去除率最高; NO3--N在各处理组间的去除率为：10.00%~32.56%, 其中水平潜流曝气组去除率最高; NH4+-N在各处理组间的去除率为：53.85%~76.92%, 其中水平潜流曝气组去除率最高; TP在各处理组间的去除率为：32.64%~58.33%, 其中水平潜流曝气组去除率最高; TDP在各处理组间浓度均高于对照组, 去除率为：101.00%~110.00%; SRP在各处理组间去除率为：27.93%~42.34%, 其中上行垂直流曝气组去除率最高.
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表 2 不同人工湿地处理组营养盐浓度/mg·L-1 Table 2 Nutrient concentration of different constructed wetland treatment groups/mg·L-1 |
2.2 对照组和不同处理组间的细菌多样性
本研究共获得细菌序列917 604条, 经拼接、质控和去除嵌合体后共获得高质量序列528 454条.所获序列以97%的相似度聚类后共获得4 042个操作分类单元(OTUs).基于RNA测序方案表征的各样本细菌多样性高于基于DNA的测序结果(图 2), 多样性指数也表现出相似的趋势(表 3).基于DNA测序表征的细菌在各样本间的多样性为：曝气(1 770, OTUs数目, 下同)>水平潜流曝气(1 533)>上行垂直流曝气(1 151)>无曝气(968)>对照组(887).而基于RNA测序表征的细菌在各样本间的多样性为：水平潜流曝气(2 076)>曝气(1 992)>无曝气(1 817)>对照组(1 587)>上行垂直流曝气(1 351).基于DNA测序表征的细菌在各样本间多样性最高的类群主要为：α-变形菌(α-Proteobacteria)、γ-变形菌(γ-Proteobacteria)和拟杆菌(Bacteroidia). γ-变形菌多样性在各样本间变化范围为：130(对照组)~273(曝气组), α-变形菌多样性在各样本间变化范围为：112(对照组)~214(曝气组), 拟杆菌多样性在各样本间变化范围为：61(无曝气组)~136(曝气组)(图 2).基于RNA测序表征的细菌多样性最高的类群同样为：α-变形菌、γ-变形菌和拟杆菌, 且这3种细菌类群多样性在不同处理组间的变化均为上行垂直流曝气组最低, 水平潜流曝气组最高(图 2).
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1.对照组; 2.无曝气; 3.曝气; 4.上行垂直曝气; 5.水平潜流曝气 图 2 基于DNA/RNA测序方案表征的各样本细菌在纲水平的多样性 Fig. 2 Diversity of bacteria (class level) at each sample based on DNA/RNA high-throughput sequencing |
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表 3 对照组及不同人工湿地处理组间的细菌多样性指数 Table 3 Bacterial diversity index between control group and different constructed wetland treatment groups |
基于DNA测序表征的细菌在各样本间共有的OTUs为342个, 各样本独有的OTUs为曝气组(338, OTUs数目, 下同)>水平潜流曝气组(202)>上行垂直流曝气(156)>对照组(106)>无曝气组(90)[图 3(a)].基于RNA测序表征的细菌在样本间共有的OTUs为519个, 各样本独有的OTUs为水平潜流曝气(358)>曝气组(280)>无曝气组(226)>上行垂直流曝气(206)>对照组(173)[图 3(b)].
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图 3 韦恩图展示了基于DNA和RNA测序方案表征的细菌在各样本间共有的及独有的OTUs Fig. 3 Venn diagram showing the numbers of unique and shared OTUs of bacteria among samples based on DNA and RNA sequencing |
基于DNA测序结果, γ-变形菌在各样本间均有着较高的相对丰度, 其在对照组相对丰度高达38.3%, 在水平潜流曝气组、无曝气组、曝气组和上行垂直流曝气组的相对丰度分别为：30.15%、26.16%、22.13%和16.96%(图 4).放线菌门(Actinobacteria)在对照组相对丰度仅为1.04%, 但其相对丰度在其他处理组却有着极大地提升, 在水平潜流曝气组、曝气组、无曝气组和上行垂直流曝气组的相对丰度分别为：9.33%、10.34%、21.54%和35.69%. α-变形菌(5.99%~21.34%)和拟杆菌(5.29%~13.58%)在各样本间也有着较高的相对丰度.梭杆菌纲(Fusobacteriia)在对照组的相对丰度为20.95%, 然而其相对丰度在处理组间均明显下降, 在上行垂直潜流曝气组、无曝气组、水平潜流曝气组及曝气组的相对丰度分别为：0.07%、0.12%、0.92%和1.62%(图 4).其他细菌类群相对丰度仅占DNA测序结果的很小一部分.
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1.对照组; 2.无曝气; 3.曝气; 4.上行垂直曝气; 5.水平潜流曝气 图 4 基于DNA/RNA测序表征的细菌群落(纲水平)在各样本间的相对丰度分布 Fig. 4 Relative abundance of bacterial groups (class level) based on DNA-derived and RNA-derived approaches for each sample |
基于RNA测序结果, γ-变形菌同样为各样本中相对丰度最高的类群, 其在对照组相对丰度为36.22%, 在其他处理组相对丰度略有下降, 在无曝气组、曝气组、水平潜流曝气组和上行垂直流曝气组的相对丰度分别为：23.94%、26.47%、27.17%和28.77%(图 4). α-变形菌在对照组的相对丰度为27.06%, 在其他处理组其相对丰度略有下降, 在上行垂直流曝气组、水平潜流曝气组、曝气组和无曝气组的相对丰度分别为：13.74%、19.32%、22.64%和26.12%.拟杆菌在各样本间有着较高的相对丰度：11.38%(曝气组)~34.88%(上行垂直流曝气).放线菌纲在对照组相对丰度为5.04%, 在其他处理组其相对丰度明显上升, 在上行垂直流曝气组、无曝气组、曝气组和水平潜流曝气组的相对丰度分别为6.23%、8.97%、9.98%和19.68%.芽孢杆菌纲(Bacilli)在样本间相对丰度较低, 但其在曝气组相对丰度达12.97%(图 4).其他细菌类群在RNA测序结果中仅占很小一部分.
2.4 对照组和不同处理组间细菌群落代谢活性主坐标分析(PCoA)发现对照组和人工湿地不同处理组间各样本基于DNA测序表征的细菌群落与基于RNA测序的结果在X轴分开, 表明两种测序方法表征的细菌群落结构存在差异; 人工湿地各处理组细菌群落结构在Y轴与对照组分开(图 5).为便于比较细菌代谢活性在样本间的差异, 本研究筛选了在DNA和RNA测序结果中同时出现且在所有样本中均检测到的OTUs, 并计算其RNA/DNA比例.本研究中共筛选出168个OTUs, 主要为：α-变形菌(46, OTUs数目, 下同)、γ-变形菌(52)、拟杆菌(21)和放线菌(13). α-变形菌、γ-变形菌、拟杆菌和放线菌在各样本中的代谢活性如图 6所示.结果发现, 细菌在OTU水平的代谢活性在样本间存在差异, 深红色表明其代谢活性较高, 深蓝色则代表其代谢活性较低.基于CCA进一步分析发现, 人工湿地单元细菌代谢活性主要受总氮(TN)和硝态氮(NO3--N)浓度的调控(图 7).
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A1(CA1)：对照组; A2(CA2)：无曝气; A3(CA3)：曝气; A4(CA4)：上行垂直曝气; A5(CA5)：水平潜流曝气 图 5 基于Bray-Curtis距离矩阵的各样本细菌群落的主坐标分析 Fig. 5 Principal coordinate analysis (PCoA) of bacteria in all samples based on the Bray-Curtis distance matrix |
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1.对照组; 2.无曝气; 3.曝气; 4.上行垂直曝气; 5.水平潜流曝气 图 6 α-变形菌、γ-变形菌、拟杆菌和放线菌OTUs代谢活性(RNA∶DNA)热图 Fig. 6 Heatmap of the OTU activities (RNA∶DNA) of α-Proteobacteria, γ-Proteobacteria, Bacteroidia and Actinobacteria |
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TN：总氮; NO3--N: 硝态氮; 图中仅展示了具有显著相关的环境因子(P < 0.05); A1：对照组; A2：无曝气; A3：曝气; A4：上行垂直曝气; A5：水平潜流曝气 图 7 基于典型相关分析的α-变形菌、γ-变形菌、拟杆菌和放线菌代谢活性与环境因子间的相关性 Fig. 7 Plot of the canonical correlation analysis (CCA) integrating environmental factors and the metabolic activities of the bacterial groups, including Actinobacteria, α-Proteobacteria, Bacteroidia, and γ-Proteobacteria |
基于DNA测序表征的细菌分类结果, 采用FAPROTAX数据库对人工湿地中细菌功能注释发现, 本研究中细菌功能主要为：化能异养(平均丰度为13.31%)、好氧化能异养(8.78%)、发酵(5.07%)、胞内寄生(2.98%)、暗氢氧化(2.68%)、光合自养(2.36%)、光合异养(2.29%)和硝酸盐还原(1.49%), 其中前35种功能热图如图 8所示.化能异养和发酵在对照组的占比分别高达27.79%和21.86%, 而其相对丰度在各处理组间均明显下降.此外, 在对照组还包含丰度较高的氮循环功能：硝酸盐还原、固氮、氮呼吸及硝酸盐呼吸作用(图 8).曝气组中存在丰度较高的碳氢化合物降解、光自养、产氧光自养、蓝藻、亚硝酸盐呼吸、氧化亚氮反硝化和硝酸盐反硝化功能.此外, 该处理组细菌存在丰度较高的致病功能, 如：人类肠道疾病、哺乳动物肠道疾病、动物寄生虫或共生体、人类病原体等.无曝气组存在丰度较高的好氧化能异养功能.上行垂直流曝气组存在丰度较高的胞内寄生、芳香化合物降解、亚硝酸盐呼吸、反硝化、氧化亚氮反硝化和硝酸盐反硝化功能.水平潜流曝气组存在丰度较高的暗氢氧化、捕食性或寄生性、反硝化相关功能和致病功能(图 8).
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1.对照组; 2.无曝气; 3.曝气; 4.上行垂直曝气; 5.水平潜流曝气 图 8 人工湿地细菌FAPROTAX功能预测(前35) Fig. 8 FAPROTAX metabolic predictions (top 35) of the bacterial communities in our constructed wetland |
人工湿地处理养殖污水具有成本低、二次污染小和操作维护简单等优点.曝气处理是一种提高人工湿地溶解氧的有效手段, 常被用于提高湿地系统的处理性能[34].持续的曝气有利于硝化细菌和亚硝化细菌的生长繁殖, 从而有助于加强人工湿地的硝化作用, 然而高浓度的溶解氧会抑制反硝化细菌[35, 36].本研究中人工湿地对氮的去除效果比较好, 曝气处理不利于反硝化作用, 这可能是有些曝气处理组TN和NO3--N浓度高于无曝气组的原因.人工湿地对磷的去除途径主要包括：离子交换、沉积和基质吸附等[37].相比于无曝气组, 曝气处理对TP、TDP和SRP的去除效果并不明显, 这也与前人的研究结果相似[38].综合来看, 在本研究中针对该类养殖废水, 水平潜流曝气组为最优选择, 营养盐去除效果最好(表 2).
3.2 对照组和人工湿地不同处理组间的细菌多样性曝气处理会不同程度地增加人工湿地细菌的多样性.基于高通量测序技术, 本研究在对照组和人工湿地不同处理组中共检测到细菌4 042 OTUs.基于DNA测序技术表征的细菌多样性结果表明：曝气组细菌多样性最高, 且不同曝气处理人工湿地细菌多样性均高于对照组(图 2).基于RNA测序发现细菌在对照组及不同人工湿地处理组均有着很高的多样性, 上行垂直流曝气处理人工湿地细菌多样性略低于对照组, 其他处理组细菌多样性均高于对照组(图 2).基于16S rDNA测序技术来表征环境样本中细菌的多样性及群落结构已经被应用于海洋、沉积物、活性污泥[39, 40]和废水处理系统[23]等环境样本中.但基于rDNA测序存在一定的局限性, 如：DNA在胞外的环境中可存活一段时间, 因此基于rDNA测序技术表征的细菌类群不仅包含活跃的类群, 同时也包含休眠细胞、最新死亡的细胞和裂解的细胞, 因此基于rDNA测序反映的是环境样本中总的类群[20].相比于DNA, RNA在胞外的环境中更容易被降解, 且rRNA序列信息可代表细菌细胞中核糖体的活跃性或蛋白合成的潜能, 因此基于rRNA的测序结果可反映环境样本中活跃的类群[20].然而, 本研究中基于RNA测序反映的细菌多样性均高于基于DNA的测序结果(图 2).类似的现象在土壤环境中也有发现[41].可能原因是基于RNA测序技术表征的高细菌多样性是由稀有类群所导致的, 已有研究证实部分细菌稀有类群虽然在DNA测序结果中占极低的丰度, 但其却有着相对较高的代谢活性, 因此可以在RNA测序结果中检出[42].本研究检测到细菌4 042 OTUs, 其中序列丰度大于1%的高丰度OTUs仅为15个, 而序列丰度小于0.1%的稀有类群却高达3 935 OTUs.此外, 不能排除转录后其他过程的影响, 如：选择性剪切, 该过程可能导致表达的转录产物比其基因组模板更加多样化[43].
3.3 对照组和不同处理间组细菌群落组成及代谢活性α-变形菌、γ-变形菌和拟杆菌均为DNA和RNA测序结果中丰度较高的类群(图 4). α-变形菌和γ-变形菌为污水和人工湿地中的常见菌群, γ-变形菌可利用水体中的甲烷和有机物.硝化-反硝化和氨氧化作用是人工湿地去除氮的主要机制.拟杆菌是常见的反硝化细菌, 该类群在氮的去除中起着非常重要的作用[44].基于RNA测序, 拟杆菌在对照及不同处理组间相对丰度均高于基于DNA的测序结果, 表明该反硝化类群处于代谢活跃的状态.硝化菌属Nitrospiraceae和Nitrosomonadaceae虽然相对丰度不高, 但其在RNA测序结果中的丰度均高于基于DNA的测序结果, 表明其处于代谢活跃状态.基于DNA测序, 放线菌在对照组仅检测到极低的丰度, 然而其在无曝气组和上行垂直流曝气组间却检测到较高的丰度.放线菌是一类革兰氏阳性细菌, 在厌氧硝化反应器中有着重要的功能, 本研究无曝气组和上行垂直流曝气组提供的厌氧环境有利于该类群的生长繁殖.放线菌在RNA测序结果的相对丰度均低于基于DNA的测序结果, 表明该类群处于代谢不活跃的状态.芽孢杆菌及疣微菌(Verrucomicrobiae)则表现出相反的趋势.PCoA分析发现对照组及不同处理组间细菌群落结构存在差异, 其中上行垂直流曝气组与对照组差异最大, 且基于DNA及RNA测序方案表征的群落结构存在明显差异(图 5).
目前, 微生物学家普遍认为：基于DNA测序可反映环境样本中存在的类群, 而基于RNA测序可以反映环境样本中活跃的类群[16], RNA∶DNA可作为类群或物种的代谢活性[21, 24].已有的研究发现微生物群落或物种的代谢活性受到环境因子的调控. 如Romanowicz等[45]的研究揭示了森林土壤中微生物活跃类群的组成主要受到pH和土壤中水分的调控; Wang等[23]的研究揭示了西太平洋微微型真核生物的代谢活性主要受到营养盐浓度的调控.本研究中发现α-变形菌、γ-变形菌、拟杆菌和放线菌代谢活性在对照组和不同人工湿地处理组间的变化(图 6), 且其代谢活性主要受总氮和硝态氮浓度的调控(图 7).
3.4 人工湿地不同处理组细菌群落功能细菌有着快速地繁殖速度, 在污水处理系统中起着非常关键的作用[46].揭示对照组及人工湿地处理组细菌群落的生态功能, 有助于加深对人工湿地处理养殖废水中细菌群落生化过程的认识.FAPROTAX数据库是基于可培养菌的文献证据整理的原核生物功能注释数据库, 其包含了超过4 600个不同原核生物种类, 收录了氮、碳和硫等元素循环、甲烷生成、发酵和动植物病原等80多种功能分类, 可较好地预测环境样本中的原核生物的生物化学循环过程[47].基于FAPROTAX数据库功能注释, 本研究在对照组和不同人工湿地曝气处理组的细菌群落中共检测到56个功能群组.其中对照组细菌群落功能预测率可达到76.8%, 主要为化学异养类群(27.79%).化学异养菌可消化分解养殖废水中的有机物, 消化产物可成为细菌发酵的底物, 其次发酵作用也是对照组中一个丰度较高的功能(21.86%).然而, 人工湿地不同曝气处理组间细菌功能的预测率均较低(无曝气组：44.46%; 曝气组：30.02%; 上行垂直流曝气组：29.25%; 水平潜流曝气组：28.33%), 这可能与处理组环境改变产生的新的细菌类群有关(图 3).氮循环相关功能, 如：硝酸盐还原、固氮、氨呼吸和硝酸盐呼吸作用, 亚硝酸盐呼吸、氧化亚氮反硝化和硝酸盐反硝化功能, 该功能的发现表明在污水处理系统中氮循环相关的细菌类群参与了总氮、氨氮和硝态氮的去除(表 2).对照组中硝酸盐还原、固氮、氮呼吸和硝酸盐呼吸功能的发现表明进水养殖污水中存在与氮循环相关的类群.上行垂直流曝气和水平潜流曝气组提供的好氧-缺氧环境有利于反硝化作用的进行, 如：亚硝酸盐呼吸、亚硝酸盐反硝化、氧化亚氮反硝化和硝酸盐反硝化.曝气组发现较高的碳循环功能如：光自养、产氧光自养和蓝藻等.此外, 在曝气和水平潜流曝气组还检测到人类肠道疾病、哺乳动物肠道疾病和人类病原体等功能类群.
4 结论(1) 本研究中在对照组及不同处理人工湿地组中共检测到细菌4 042 OTUs, 其中多样性最高的类群为：α-变形菌、γ-变形菌和拟杆菌.此外, 曝气处理会不同程度地增加人工湿地细菌的多样性.
(2) α-变形菌、γ-变形菌、拟杆菌和放线菌均为基于DNA和RNA测序表征的主要细菌群落, 但基于DNA和RNA测序方案表征的细菌群落结构存在差异.
(3) 在本研究中, α-变形菌、γ-变形菌、拟杆菌和放线菌在对照组及不同人工湿地处理组代谢活性主要受到总氮和硝态氮浓度的调控.
(4) FAPROTAX数据库注释发现本研究样本间中存在与氮循环相关的功能类群, 其可能在人工湿地中总氮、氨氮和硝态氮的去除过程中起到重要的作用.
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孙茜, 徐圣君, 曾贤桂, 等. 畜禽养殖废水人工湿地处理技术研究进展[J]. 煤炭与化工, 2019, 42(4): 155-160. Sun Q, Xu S J, Zeng X G, et al. Research progress of treatment livestock and poultry wastewater technologies for using constructed wetlands[J]. Coal and Chemical Industry, 2019, 42(4): 155-160. |
| [2] |
赵林丽, 邵学新, 吴明, 等. 人工湿地不同基质和粒径对污水净化效果的比较[J]. 环境科学, 2018, 39(9): 4236-4241. Zhao L L, Shao X X, Wu M, et al. Effects of different substrates and particle sizes on wastewater purification[J]. Environmental Science, 2018, 39(9): 4236-4241. |
| [3] |
李慧贤, 熊志鹏, 王倩, 等. 垂直流人工湿地强化地表径流脱氮的研究[J]. 环境科学与技术, 2019, 42(12): 137-143. Li H X, Xiong Z P, Wang Q, et al. Study on enhanced removal of nitrogen in vertical flow constructed wetland[J]. Environmental Science & Technology, 2019, 42(12): 137-143. |
| [4] |
王加鹏, 崔正国, 周强, 等. 人工湿地净化海水养殖外排水效果与微生物群落分析[J]. 渔业科学进展, 2014, 35(6): 1-9. Wang J P, Cui Z G, Zhou Q, et al. Removal effect of mariculture wastewater and analysis of microbial communities in constructed wetlands[J]. Progress in Fishery Sciences, 2014, 35(6): 1-9. |
| [5] |
王森, 任伶, 刘琳琳, 等. 纳米氧化锌粒径对人工湿地性能及微生物群落的影响[J]. 环境科学, 2019, 40(11): 4971-4979. Wang S, Ren L, Liu L L, et al. Size-dependent effects of zinc oxide nanoparticles on performance and microbial community structure of a constructed wetland[J]. Environmental Science, 2019, 40(11): 4971-4979. |
| [6] |
夏梦华, 刘铭羽, 郭宁宁, 等. 美人蕉、梭鱼草和黄菖蒲人工湿地系统对养猪废水的脱氮特征研究[J]. 生态与农村环境学报, 2020, 36(8): 1080-1088. Xia M H, Liu M Y, Guo N N, et al. Study on nitrogen removal characteristics of swine wastewater in the constructed wetland systems of Canna indica, Pontederia cordata and Iris pseudacorus[J]. Journal of Ecology and Rural Environment, 2020, 36(8): 1080-1088. |
| [7] |
黄健, 赵晓芬. 微生物在人工湿地污水处理中的研究进展[J]. 海洋湖沼通报, 2012(2): 151-156. Huang J, Zhao X F. Progress of study on microorganisms in the constructed wetland for wastewater treatment[J]. Transactions of Oceanology and Limnology, 2012(2): 151-156. DOI:10.3969/j.issn.1003-6482.2012.02.018 |
| [8] |
李丽. 11种湿地植物在污染水体中的生长特性及对水质净化作用研究[D]. 广州: 暨南大学, 2011. Li L. Growth characteristics and roles of 11 species of wetland plants in polluted water purification[D]. Guangzhou: Jinan University, 2011. |
| [9] |
方焰星, 何池全, 梁霞, 等. 曝气对人工湿地氮去除效果的影响[J]. 湿地科学, 2011, 9(3): 270-276. Fang Y X, He C Q, Liang X, et al. Influence of aeration on nitrogen removal of constructed wetlands[J]. Wetland Science, 2011, 9(3): 270-276. |
| [10] |
王宁, 黄磊, 罗星, 等. 生物炭添加对曝气人工湿地脱氮及氧化亚氮释放的影响[J]. 环境科学, 2018, 39(10): 4505-4511. Wang N, Huang L, Luo X, et al. Impact of biochar on nitrogen removal and nitrous oxide emission in aerated vertical flow constructed wetland[J]. Environmental Science, 2018, 39(10): 4505-4511. |
| [11] |
古腾, 吴勇, 王橚橦. 曝气生物滤池-模块化人工湿地组合工艺处理农村生活污水[J]. 环境工程, 2018, 36(1): 20-24. Gu T, Wu Y, Wang X T. Treatment of rural domestic sewage by using biological aerated filter and modular constructed wetland combined process[J]. Environmental Engineering, 2018, 36(1): 20-24. |
| [12] |
康晓荣, 刘亚利, 周友新, 等. 间歇曝气强化人工湿地低温脱氮研究[J]. 森林工程, 2019, 35(3): 74-77, 106. Kang X R, Liu Y L, Zhou Y X, et al. Studies on intermittent aeration enhancing nitrogen removal of constructed wetland at low temperature[J]. Forest Engineering, 2019, 35(3): 74-77, 106. |
| [13] |
崔丽娟, 张曼胤, 李伟, 等. 人工湿地处理富营养化水体的效果研究[J]. 生态环境学报, 2010, 19(9): 2142-2148. Cui L J, Zhang M Y, Li W, et al. Research on the effects of constructed wetlands for eutrophication waterbodies[J]. Ecology and Environment, 2010, 19(9): 2142-2148. DOI:10.3969/j.issn.1674-5906.2010.09.021 |
| [14] |
张彩莹, 王岩, 王妍艳. 潜流人工湿地对畜禽养殖废水的净化效果[J]. 农业工程学报, 2013, 29(17): 160-168. Zhang C Y, Wang Y, Wang Y Y. Purification effect of subsurface flow constructed wetland on livestock wastewater[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2013, 29(17): 160-168. |
| [15] |
陈靖. 农村生活污水大肠杆菌污染防治方法研究[D]. 成都: 西南交通大学, 2018. Chen J. Study on prevention and treatment of rural domestic wastewater E. coli pollution[D]. Chengdu: Southwest Jiaotong University, 2018. |
| [16] | Wang F P, Huang B Q, Xie Y Y, et al. Diversity, composition, and activities of nano- and pico-eukaryotes in the northern South China Sea with influences of Kuroshio intrusion[J]. Frontiers in Marine Science, 2021, 8. DOI:10.3389/fmars.2021.658233 |
| [17] | Lozupone C A, Knight R. Global patterns in bacterial diversity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, 104(27): 11436-11440. DOI:10.1073/pnas.0611525104 |
| [18] | de Vargas C, Audic S, Henry N, et al. Eukaryotic plankton diversity in the sunlit ocean[J]. Science, 2015, 348(6237). DOI:10.1126/science.1261605 |
| [19] | Kearns P J, Angell J H, Howard E M, et al. Nutrient enrichment induces dormancy and decreases diversity of active bacteria in salt marsh sediments[J]. Nature Communications, 2016, 7. DOI:10.1038/ncomms12881 |
| [20] | Sundberg C, Al-Soud W A, Larsson M, et al. 454 pyrosequencing analyses of bacterial and archaeal richness in 21 full-scale biogas digesters[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2013, 85(3): 612-626. |
| [21] | Blazewicz S J, Barnard R L, Daly R A, et al. Evaluating rRNA as an indicator of microbial activity in environmental communities: limitations and uses[J]. The ISME Journal, 2013, 7(11): 2061-2068. |
| [22] | Ye D D, Liang H B, Zhou W, et al. Total and active microbial communities in a full-scale system treating wastewater from soy sauce production[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2017, 123: 206-215. |
| [23] | Wang F P, Xie Y Y, Wu W X, et al. Picoeukaryotic diversity and activity in the Northwestern Pacific Ocean based on rDNA and rRNA high-throughput sequencing[J]. Frontiers in Microbiology, 2019, 9. DOI:10.3389/fmicb.2018.03259 |
| [24] | Liang H B, Luo X T, Ye D D, et al. Seasonal succession of bacterial communities, metabolic potential and ecological functions in soy sauce wastewater treatment system[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2020, 154. DOI:10.1016/j.ibiod.2020.105083 |
| [25] | Baldrian P, Kolařík, Štursová M, et al. Active and total microbial communities in forest soil are largely different and highly stratified during decomposition[J]. The ISME Journal, 2012, 6(2): 248-258. |
| [26] | 国家环境保护总局. 水和废水监测分析方法[M]. (第四版). 北京: 中国环境科学出版社, 2002. |
| [27] | He S Q, Li D, Wang F P, et al. Parental exposure to sulfamethazine and nanoplastics alters the gut microbial communities in the offspring of marine madaka (Oryzias melastigma)[J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 423. DOI:10.1016/j.jhazmat.2021.127003 |
| [28] | Mago Dč T, Salzberg S L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies[J]. Bioinformatics, 2011, 27(21): 2957-2963. |
| [29] | Caporaso J G, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. QⅡME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nature Methods, 2010, 7(5): 335-336. |
| [30] | Rognes T, Flouri T, Nichols B, et al. VSEARCH: a versatile open source tool for metagenomics[J]. PeerJ, 2016, 4. DOI:10.7717/peerj.2584 |
| [31] | Edgar R C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J]. Nature Methods, 2013, 10(10): 996-998. |
| [32] | Wang Q, Garrity G M, Tiedje J M, et al. Naiïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(16): 5261-5267. |
| [33] | 黄文, 王正林. 数据挖掘: R语言实战[M]. 北京: 电子工业出版社, 2014. |
| [34] | Fan J L, Wang W G, Zhang B, et al. Nitrogen removal in intermittently aerated vertical flow constructed wetlands: impact of influent COD/N ratios[J]. Bioresource Technology, 2013, 143: 461-466. |
| [35] |
刘国华, 陈燕, 范强, 等. 溶解氧对活性污泥系统的脱氮效果和硝化细菌群落结构的影响[J]. 环境科学学报, 2016, 36(6): 1971-1978. Liu G H, Chen Y, Fan Q, et al. Effects of dissolved oxygen concentration on nitrogen removal and nitrifying bacterial community structure in an activated sludge system[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2016, 36(6): 1971-1978. |
| [36] |
姜应和, 李瑶, 张莹, 等. NO3--N负荷对树皮填料人工湿地早期反硝化及释碳速率的影响[J]. 环境科学, 2017, 38(5): 1898-1903. Jiang Y H, Li Y, Zhang Y, et al. Effects of NO3--N loading on the early-period efficiency of denitrification and carbon releasing in constructed wetland filled with bark[J]. Environmental Science, 2017, 38(5): 1898-1903. |
| [37] |
潘傲, 张智, 孙磊, 等. 种植不同植物的表面流人工湿地净化效果和微生物群落差异分析[J]. 环境工程学报, 2019, 13(8): 1918-1929. Pan A, Zhang Z, Sun L, et al. Purification effects and microbial community differences of the surface-flow constructed wetlands with different vegetation plantation[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2019, 13(8): 1918-1929. |
| [38] |
高海鹰, 刘佳, 徐进. 湖滨带复合型人工湿地氮磷的去除效果[J]. 生态环境, 2007, 16(4): 1160-1165. Gao H Y, Liu J, Xu J. Removal efficiency of nitrogen and phosphorus in integrated constructed Lake-side wetlands[J]. Ecology and Environment, 2007, 16(4): 1160-1165. |
| [39] | Zhang J, Chen M, Huang J F, et al. Diversity of the microbial community and cultivable protease-producing bacteria in the sediments of the Bohai Sea, Yellow Sea and South China Sea[J]. PLoS One, 2019, 14(4). DOI:10.1371/journal.pone.0215328 |
| [40] | Qin H, Ji B, Zhang S F, et al. Study on the bacterial and archaeal community structure and diversity of activated sludge from three wastewater treatment plants[J]. Marine Pollution Bulletin, 2018, 135: 801-807. |
| [41] | Mikkonen A, Santalahti M, Lappi K, et al. Bacterial and archaeal communities in long-term contaminated surface and subsurface soil evaluated through coextracted RNA and DNA[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2014, 90(1): 103-114. |
| [42] | Jones S E, Lennon J T. Dormancy contributes to the maintenance of microbial diversity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107(13): 5881-5886. |
| [43] | Helm M. Post-transcriptional nucleotide modification and alternative folding of RNA[J]. Nucleic Acids Research, 2006, 34(2): 721-733. |
| [44] |
吕纯剑, 高红杰, 宋永会, 等. 潮汐流-潜流组合人工湿地微生物群落多样性研究[J]. 环境科学学报, 2018, 38(6): 2140-2149. Lv C J, Gao H J, Song Y H, et al. Microbial community diversity in the combined tide flow-subsurface flow constructed wetland[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2018, 38(6): 2140-2149. |
| [45] | Romanowicz K J, Freedman Z B, Upchurch R A, et al. Active microorganisms in forest soils differ from the total community yet are shaped by the same environmental factors: the influence of pH and soil moisture[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2016, 92(10). DOI:10.1093/femsec/fiw149 |
| [46] | Wei Z Y, Liu Y Y, Feng K, et al. The divergence between fungal and bacterial communities in seasonal and spatial variations of wastewater treatment plants[J]. Science of the Total Environment, 2018, 628-629: 969-978. |
| [47] | Louca S, Parfrey L W, Doebeli M. Decoupling function and taxonomy in the global ocean microbiome[J]. Science, 2016, 353(6305): 1272-1277. |