2. 宁波大学植物病毒学研究所, 农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室, 宁波 315211
2. State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Institute of Plant Virology, Ningbo University, Ningbo 315211, China
我国是农业大国, 农业生产对于我国农业发展至关重要.地膜覆盖因其可以改变土壤的水热条件, 具有较好的保温保墒功能, 因此在促进作物增产增收方面具有重要作用.因而地膜覆盖技术被广泛应用在农业生产中.有研究表明, 地膜覆盖会加快土壤养分耗损, 改变土壤物理、化学性质和生物学特征, 这些改变甚至会降低土壤生产功能, 对土壤造成不良影响; 另外, 塑料薄膜经过UV光降解、长期风化和机械破碎后, 形成残膜或者微塑料残留在土壤中, 对土壤水分和养分的运移, 土壤动物活动和微生物的活性均具有不利影响[1~4].目前关于覆膜下农田土壤的研究, 主要集中在覆膜期间作物的生长及产量、土壤养分供应和水分条件等方面[5~9], 而对覆膜后土壤养分、微生物和生态酶计量学特征等的研究却鲜见报道.
微生物是土壤中养分循环及有机质分解的驱动者.微生物生物量中的碳氮磷被认为是土壤活性养分库, 是植物可利用养分的重要来源, 因此微生物生物量的变化可以较好地反映土壤中养分的变化特征[10].根据计量学理论, 微生物的生长需要维持自身生物质组分的内稳态, 微生物和底物间化学计量(C∶N∶P)的不平衡驱动了有机质的分解, 即微生物通过非稳态行为改变自身化学组成以响应底物的化学成分变化, 以实现微生物的内稳态[11].因此微生物生物量化学计量比可以揭示微生物碳氮磷养分限制的情况[10].然而微生物的化学元素计量比变化范围相对较小, 通过非稳态行为难以较高效地调节微生物养分的获取[5].所以对于外源底物的分解, 微生物主要依靠分泌胞外酶分解有机物, 释放其可利用的养分[12].因此, 微生物用于获取碳氮磷的关键胞外酶的比值, 即生态酶计量比, 能够反映微生物群落的养分需求与环境中有效性养分之间的关系[13, 14], 可以用来衡量土壤微生物能量和养分资源限制状况.尽管有研究表明, 覆膜抑制作物生长期间土壤碳氮循环相关酶活性, 而促进磷酸酶活性[15].然而由于休耕期或者揭膜后与覆膜期间土壤水热条件的差异, 其微生物和酶活性的变化也存在较大差异[16].微塑料表面可以提供微生物定制的位点, 但是微塑料只富集特定的微生物菌群, 因此使微生物群落多样性降低[17].另外, 薄膜微塑料在农田土壤中积累, 使土壤细菌群落演替加剧, 降低土壤细菌群落结构的稳定性[18].虽然覆膜使微生物群落和酶活性发生变化, 而微生物所驱动的养分周转主要受微生物生物量及其活性的调节, 而该过程受到能源(C源)或养分(氮磷)物质的有效性的影响[19].然而养分元素的周转是多元素耦合的过程, 单一指标的评价并不能反映土壤养分供需和可利用性情况.因此, 探讨覆膜后土壤养分元素、微生物生物量和生态酶计量学特征, 对系统评估覆膜对农田土壤养分和土壤质量的影响具有重要意义.
因此, 本研究选取了湖北省4个地膜覆盖后处于休耕期的农田土壤, 分析土壤碳氮磷含量、微生物生物量和碳氮磷循环的关键酶活性的变化, 探究土壤碳氮磷含量、微生物生物量和生态酶计量学特征及其内在联系, 通过揭示地膜覆盖后薄膜残留对土壤养分特征, 以及土壤微生物对养分循环的响应以及调控机制, 以期为地膜的正确使用、回收措施和覆膜农业生产的可持续性提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 研究区域概况和样品采集研究区位于湖北省荆州市与咸宁市, 两地同属于亚热带季风气候, 光能充足, 无霜期长, 降水充沛.其中荆州市年均降水量为900~1 100 mm, 年均温度为16~16.4℃; 咸宁市年均降水量为1 380 mm, 年均温度为16.9℃.两地土壤类型以潮土为主.本研究选取的土壤均来自种植蔬菜的农田, 分别为湖北省咸宁市嘉鱼县新街镇马鞍山(S1);湖北省荆州市江陵县秦市乡陆阳台村(S2); 湖北省荆州市江陵县白马寺镇王市村(S3); 湖北省咸宁市嘉鱼县新街镇马鞍山(S4).根据调查方式确定4个研究区的覆膜年限.蔬菜收获后, 对农膜进行残膜回收.土壤中残膜含量基本随着覆膜年限增加而增加.但是由于S1中农户对农膜的回收意识较强, 所以土壤残膜含量较低(表 1).
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表 1 覆膜样地基本信息 Table 1 Basic information on the plastic film mulching site |
于2020年3月, 在4个研究区分别选取相邻的覆膜和不覆膜样地共8个, 每处样地选取3个田块作为重复, 采用“S”形取样法采集耕作层(0~20 cm)的土壤.将采集的土壤充分混合均匀后, 冷藏带回实验室, 一部分鲜样用于土壤微生物生物量的测定, 另取约20 g土壤置于-20℃条件下保存, 用于土壤酶活性的测定; 另取一部分风干后, 用于基本理化性质的分析.另外, 每个样点“梅花点法”选取5个样方, 每个样方距离为15 m, 每个样方设置长×宽×深为1 m×1 m×0.3 m的地膜残留量调查采集点.将土壤过2 mm孔径筛子, 捡出残膜带回实验室, 用超声波清洗风干后进行称重.
1.2 试验方法 1.2.1 土壤理化性质测定土壤理化性质主要参考文献[20]介绍的方法进行测定.土壤pH值采用Mettler-toledo320 pH计进行测定(土水比为1∶2.5); 土壤全氮(TN)采用半微量法消煮后用流动注射仪(FIAstar 5000, 瑞典福斯)测定; 土壤有机碳(SOC)采用重铬酸钾外加热法测定; 土壤全磷(TP)和速效磷(Olsen-P)分别用浓硫酸-高氯酸消煮和碳酸氢钠浸提后, 用流动注射仪测定; 土壤铵态氮(NH4+-N)、硝态氮(NO3--N)采用0.5 mol·L-1 K2SO4溶液振荡(180 r·min-1)1 h后, 过滤浸提液, 用流动注射仪测定.
1.2.2 土壤微生物生物量测定土壤微生物生物量碳、氮(MBC和MBN)采用氯仿熏蒸-浸提法, 称取两份10 g鲜土, 分别作为熏蒸和未熏蒸处理, 采用0.5 mol·L-1 K2SO4溶液浸提后, 用总有机碳自动分析仪(TOC 2500, 岛津)测定.其中未熏蒸土壤浸提液中为溶解性有机碳(DOC).浸提液中的氮用浓硫酸消煮后, 采用连续流动分析仪测定.以熏蒸和未熏蒸土样提取的有机碳和全氮的差值乘以转换系数Kc(0.45)分别作为MBC和MBN含量[21].土壤微生物生物量磷(MBP)采用氯仿熏蒸-浸提法, 用0.5 mol·L-1 NaHCO3溶液浸提, 除熏蒸和未熏蒸处理外, 另设置一组处理测定外加正磷酸盐态无机磷(Pi)的回收率, 用以校正被熏蒸后被土壤吸附和固定的微生物生物量磷.NaHCO3浸提液用连续流动分析仪进行测定, 转换系数Kc取值为0.4[22].
1.2.3 土壤生态酶活性测定参照Razavi等[23]介绍的方法, 对β-1, 4-葡萄糖苷酶(BG)、β-1, 4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)和磷酸酶(ACP)这3种土壤胞外酶的活性进行测定, 用4-甲基伞形酮(MUB)做标准底物, 土壤酶活性测定的种类和所用底物等见表 2, 称取1 g鲜土于乐扣盒中, 加入50 mL灭菌水, 180 r·min-1, 25℃下振荡30 min, 加样时将乐扣盒置于磁力搅拌器上, 边搅拌边用排枪取样, 每个样本取50 μL到96孔微孔板, 按照底物浓度梯度为0、20、40、60、100、200、600和800 μmol·孔-1加入相应体积的酶底物溶液, 并用MES缓冲液补足至200 μL·孔-1.同时设置标线, 标线浓度为0、100、200、400、600、800、1 000和1 200 pmol·孔-1.分别于0、30、60、120、180和240 min时上多功能酶标仪(Infinite M200 PRO, 上海)测定, 在365 nm处激发, 在450 nm处检测荧光值.最终用米氏方程拟合得到土壤酶的最大活性潜势Vmax.
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表 2 土壤酶活性测定的种类、缩写、功能和所用底物 Table 2 Abbreviations, types, function and substrates used for the determination of soil enzyme activity |
1.3 数据处理
使用Excel 2016软件对数据进行处理后, 用IBM SPSS Statistics 22软件对数据进行统计分析, 采用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验覆膜效应的显著性, 采用独立样本T检验检验同一样地覆膜与不覆膜之间土壤指标的差异性.采用R 4.0.3软件的“vegan”程序包进行影响生态酶化学计量比的环境因子及微生物生物量因素的冗余分析(RDA).用Origin 2017进行绘图.土壤碳氮磷和微生物生物量元素计量比均为相应元素的质量摩尔浓度比值.图表中数据均为平均值±标准差.
2 结果与分析 2.1 地膜覆盖后农田土壤养分化学计量比特征覆膜对农田土壤SOC影响较小(表 3).覆膜显著提高S2和S4土壤TN含量, TP含量差异不显著; S1和S3中TP含量增加而TN含量无明显差异(表 3).覆膜对DOC和Olsen-P有显著影响, 其中, 覆膜之后的土壤中DOC是不覆膜土壤的1.2~2.1倍. S1和S4样地的Olsen-P在覆膜土壤中分别为不覆膜土壤的48.2%和62.3%; 而在S2和S3样地中, 覆膜土壤中的Olsen-P比不覆膜土壤分别提高了203%和144%.各样地中NO3--N均高于NH4+-N, 其中NO3--N在S1和S4样地的覆膜土壤分别降低至不覆膜土壤的24%和16%; S2和S3样地的覆膜处理使NO3--N提高了5.1倍和1.9倍(表 3).地膜覆盖对土壤中的养分计量比影响不同(图 1).覆膜降低土壤中SOC∶TN, 尤其在S2和S3中分别降低了25.8%和6.6%; 然而两个样地的SOC∶TP和TN∶TP分别增加了16.4%~90.7%和56.8%~104%(图 1).
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表 3 覆膜与不覆膜农田土壤基本理化性质1) Table 3 Soil properties under (non-) plastic film mulching |
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图中误差线为标准差(n=3); 不同大写字母表示同一样地不覆膜与覆膜间差异显著(P < 0.05)不同小写字母表示不同覆膜样地间差异显著(P < 0.05), 下同 图 1 覆膜农田土壤养分计量比特征 Fig. 1 Stoichiometry of nutrient elements in soils from plastic film mulching |
除S4外, 地膜覆盖农田土壤中MBC的含量显著低于不覆膜的土壤, 其降幅达20.3%~54.5%(表 4).由于覆膜下土壤MBN和MBP也随之降低, 造成S2样地的MBC∶MBN显著增加了3.3倍, 但MBC∶MBP无显著差异(图 2).覆膜后的土壤MBN∶MBP在S1和S2中分别降至不覆膜土壤的36.6%和23.8%, 而在S3和S4中分别提高了5.4倍和1.3倍(图 2).
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表 4 覆膜农田土壤微生物生物量/mg·kg-1 Table 4 Microbial biomass in soils from plastic film mulching/mg·kg-1 |
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图 2 覆膜农田土壤微生物量计量比特征 Fig. 2 Stoichiometry of microbial biomass in soils from plastic film mulching |
S3和S4中覆膜后土壤BG酶活性比不覆膜的土壤分别提高了28.4%和212%.而覆膜降低了S1~S3土壤中与氮循环相关的NAG酶活性, 却使S4中的NAG酶活性提高约2倍.另外, S3覆膜后土壤磷酸酶活性降低至不覆膜土壤的38.4%(图 3).
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图 3 覆膜农田土壤胞外酶活性 Fig. 3 Soil extracellular enzyme activities in soils from plastic film mulching |
由于覆膜后土壤BG酶活性的增加, 而NAG酶和磷酸酶活性呈现不同程度的降低, 覆膜后土壤碳循环相关的酶活性与氮磷循环相关的生态酶活性计量比呈现不同程度的提高.其中S2和S3中覆膜后土壤BG∶NAG比值分别是不覆膜土壤的1.3和15倍. S3和S4中覆膜后土壤BG∶ACP比值与不覆膜土壤比分别提高了341%和60.1%. NAG∶ACP比值在S1~S3中普遍降低, 降幅为39.8%~82.2%(图 4).
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图 4 覆膜农田土壤生态酶计量学特征 Fig. 4 Stoichiometry of eco-enzymatic activity in soils from plastic film mulching |
以土壤生态酶计量比作为响应变量, 以土壤的理化性质、微生物生物量及土壤养分化学计量比为解释变量, 进行冗余分析(RDA), 探究土壤理化性质、微生物生物量和土壤养分化学计量比与土壤生态酶计量比之间的关系.如图 5所示, 第一轴解释了变量的72.9%, 第二轴解释了变量的7.35%.此外, 从RDA分析结果可知, NH4+-N、TP、pH和DOC与NAG∶ACP和BG∶ACP呈正相关关系, 而与BG∶NAG呈负相关关系. MBP、SOC、TN和Olsen-P与BG∶NAG呈正相关关系, 而与NAG∶ACP和BG∶ACP呈负相关关系.
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蓝线表示覆膜土壤理化指标及微生物生物量, 红线表示生态酶计量比 图 5 覆膜土壤理化性质及微生物生物量对生态酶计量比影响的冗余分析 Fig. 5 Redundancy analysis (RDA) of the effects of soil physical and chemical properties, microbial biomass on stoichiometry of ecoenzymatic activity in soils from plastic film mulching |
农田生态系统中, 作物凋落物、秸秆还田以及根茬残留是土壤有机质的重要来源.覆膜通过保温保墒的作用, 提高作物根系生物量, 进而增加土壤有机碳[23].然而植物来源的有机物由于较易被微生物利用而分解, 同时通过激发效应, 促进土壤原有有机碳的矿化[24, 25], 而农田土壤中的有机碳积累是长期缓慢积累的结果, 多数情况下都处于输入和输出相对平衡状态[26].因此覆膜后作物来源有机碳输入的增加, 并不意味最终会使土壤有机碳显著增加.Mo等[27]通过数据的整合分析, 发现覆膜促进作物碳输入的同时, 也显著提高了CO2的排放.另外, Yu等[24]整合分析结果表明, 长期覆膜对小麦、玉米和油料作物农田土壤有机碳的含量均无显著影响, 甚至在水稻土壤中还显著降低了有机碳的储量.可见, 尽管覆膜农业生产可以通过增加植物生物量输入更多的有机碳, 但是由于有机碳的矿化率也随之增加, 从而提高了土壤有机碳的周转率, 因而并未增加土壤有机碳含量.这些结果与本研究结果相一致(表 3).另外, 由于覆膜使通过植物生物量形式输入的有机碳增加, 其中的不稳定化合物经过生物降解作用和光降解作用, 土壤可溶性有机碳的含量也因此增加[28].此外, 由于覆膜后薄膜回收不充分, 大量残膜或微塑料遗留在土壤中, 造成土壤容重降低, 土壤孔隙度和通气性增加, 有利于有机质分解为小分子有机物[29].由于覆膜能促进作物生长, 进而吸收土壤中有效养分, 造成土壤有效养分的降低.然而由于S2和S3样地主要以有机和无机配施为主, 无机肥中以有机质形式存在的养分可经过分解释放出有效养分, 同时残膜造成土壤孔隙度和通气性增加, 进而可以促进这一过程, 因此导致S2和S3样地中有效养分显著增加.相反, 由于大量残膜遗留在土壤中, 能提高土壤疏松度、孔隙度和导水率, 促进养分的淋失, 因此本研究S1和S4样地中的有效养分降低(表 3).
3.2 地膜覆盖对土壤养分和生态酶计量学特征的影响生物量的化学计量比变化范围较小, 但仍可通过其非稳态行为调节底物的分解和利用.生物量非稳态行为特征主要包括两个方面: 一方面, 当环境中可利用性碳磷元素增加时, 微生物可以通过合成体内的脂质和葡聚糖或聚磷酸盐等保存碳或磷元素, 然而微生物体内缺乏储存氮元素的特殊氮库[11].因此, 通过这种方式保存在微生物体内的碳磷元素含量通常都比较低, 均不超过微生物干物质量的20%[11], 所以虽然本研究中覆膜土壤碳有效性(DOC)显著增加, 或S2和S3中的有效磷(Olsen-P)增加, 但通过微生物的非稳态行为调节功能, 微生物生物量的化学计量比(即MBC∶MBP)变化均不明显.另一方面, 微生物还可以通过调节群落结构的变化, 在响应外源底物时, 实现微生物生物量化学元素计量比在微生物群落水平的内稳态[5].由于不同微生物群落间的化学元素计量比存在显著差异, 其对底物的分解能力不同, 如K型策略微生物(如真菌等)比r型策略微生物(如细菌等)对底物利用时具有范围更广的C∶N∶P计量比范围[30], 对结构复杂的有机物分解能力较强.本研究中S2和S3样地采用有机-无机配施的施肥方式, 有机肥的投入促进K型策略微生物的生长以分解有机物[31], 因此使这两个样地的微生物生物量元素计量比相对增加.Wang等[32]的研究表明, 农田土壤残膜的积累使微生物的多样性降低.其原因可能有两种: 微塑料表面为一些特定类群微生物提供定殖的界面[17]; 另外残膜中释放有害物质抑制微生物的生长[32].而K型策略微生物一般对环境的变化耐受性更强, 因此残膜和微塑料污染下可能更不利于r型策略微生物的生长, 而K型策略微生物的相对富集使覆膜后有机-无机配施的土壤微生物生物量C∶N∶P计量比增加.MBN∶MBP在覆膜后S1和S2土壤中显著降低, 而在S3和S4土壤中增加, 可能由于随着残膜和微塑料积累量的增加, 由于其表面存在与环境中离子吸附界面, 其对有效磷的吸附量增加, 降低有效磷的有效性[33]; 还有可能是磷酸酶活性受到抑制(图 3), 造成有效磷的活化能力降低, 使微生物可利用的磷降低, 因此使MBP降低, 从而提高MBN∶MBP比值.另外由于覆膜使S1中的TP含量显著增加, 从而使SOC∶TP和TN∶TP显著降低, 即该样地中能量物质(即碳源)和养分元素氮成为限制因子, 而磷元素充足, 因此在微生物底物利用中体现为该覆膜土壤MBC∶MBP和MBN∶MBP显著降低.
微生物吸收利用有机质中能量物质或养分元素, 首先需要通过分泌胞外酶将有机物分解为易利用的简单有机物.而有机物的分解需要多种酶的协同作用, 并且受到限制性元素的调节.生态酶化学计量比能够反映微生物新陈代谢和养分需求与环境中养分有效性之间的生物地球化学平衡模式, 可以用来衡量土壤微生物能量和养分资源限制状况[13, 14].本研究中, 有机-无机配施的覆膜土壤(S2和S3), 其BG∶NAG显著高于不覆膜的土壤(图 4).由于覆膜保温保墒作用, 土壤有机质分解加速, 大量小分子有机物释放到土壤中, 进一步促进了将有机物分解并被微生物利用的单糖的酶活性.该过程使覆膜期间土壤较易利用的有机物大量被分解利用, 因此揭膜休耕时土壤碳分解酶的活性增加, 促使结构较复杂的有机物降解, 为微生物的生长提供碳源和能量物质.另外, 由于休耕期没有种植作物, 前期释放出的有效养分在土壤里保存而相对充足(表 3), 造成氮磷相关酶活性降低(图 3), 因此BG∶NAG比值增加而NAG∶ACP比值降低.
4 结论尽管覆膜可促进作物增产增收, 但是大量残膜遗留在农田土壤中, 会带来环境风险和影响土壤功能.覆膜农田土壤有效养分显著降低, 但是通过有机和无机配施的施肥方式, 可以增加土壤有效养分.因此在进行覆膜农业生产中, 可通过调整和探索施肥模式, 以降低长期覆膜对土壤功能和作物生长的影响.
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