2022, Vol. 43
2. 贵州大学资源与环境工程学院, 贵阳 550025
2. College of Resources and Environmental Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China
镉(Cd)是公认的毒性较大的重金属元素之一, 在土壤中具有一定的迁移能力, 被植物吸收后可通过食物链最终威胁人类的健康[1].近年来, 随着含Cd“三废”排放的日益增加, 我国土壤Cd污染形势已较为严峻, 如何对镉污染土壤进行有效治理成为了普遍关注的问题[2].利用超积累植物对土壤重金属进行植物提取(phytoextraction), 具有成本低、原位修复、环境友好和适宜大面积推广等特点, 在土壤Cd污染领域具有较大的发展潜力[3, 4].但在实际应用中, 超积累植物个体矮小、生长缓慢以及土壤Cd生物有效性低往往是导致修复效率低下的限制因素[5~7].因此, 生长调节剂和螯合剂常被用于强化植物提取修复之中.植物生长调节剂主要是通过促进植株营养生长、增强植物的光合作用和抗逆性, 进而提高植物的生物量, 增加对Cd的提取量[8].目前使用得较多的生长素(IAA)、赤霉素(GA3)、乙烯利(ETH)和脱落酸(ABA)等植物生长调节剂大都属于直接从植物里提取的植物天然激素, 仍存在着提取方法复杂困难和含量少等问题[9].螯合剂主要是通过与土壤中Cd离子形成螯合物, 增强其活性, 进而促进植物的吸收和积累[10, 11].目前研究中使用得最为广泛的螯合剂EDTA存在着难降解、残留时间长和易对环境造成二次污染等问题[12].
DA-6(胺鲜脂)是一种人工合成的细胞分裂素类植物生长调理剂, 优点是低毒、安全而且价格低廉, 使用也比较方便[13].有研究表明, DA-6处理能促进污染土壤中的超积累植物的生长, 提高其对重金属的提取修复效率[14, 15].EDDS(乙二胺二琥珀酸), 对土壤中重金属螯合能力极强, 在土壤中残留时间短, 可生物降解, 其环境风险低于EDTA[16].裘希雅等[17]的研究结果表明, EDDS的添加在提高海洲香薷对Cu和Zn的吸收量的同时, 渗滤液中的重金属浓度低于国家Ⅲ类地下水水质标准, 淋滤风险较小.目前的研究中, 无论是DA-6还是EDDS大多以单施为主, 鲜见将两者联合起来强化植物修复Cd污染土壤的报道.
在利用植物生长调节剂和螯合剂强化植物提取效果的同时, 其对土壤质量的影响也不容忽视[18].因此, 进行强化调控条件下的土壤生态风险评价研究也是十分必要的.细菌对土壤扰动或污染能够快速响应, 是实时反映污染环境修复状态的最灵敏指标, 在修复后土壤的生态功能评价方面得到诸多应用[19].以高通量测序为代表的新一代测序技术凭借低成本、高通量和流程自动化的优势为研究微生物群落结构提供了新的技术平台, 为探明植物修复土壤重金属污染过程中根际土壤细菌群落组成和功能提供帮助[20].龙葵(Solanum nigrum L.)是茄科属一年生直立草本植物, 因其对Cd具有较强的积累特性, 是应用于土壤Cd污染植物提取的良好材料.基于此, 本研究采用盆栽试验, 通过测定EDDS与DA-6单施和联合施用条件下龙葵株高、鲜重、叶绿素含量、丙二醛含量、抗氧化酶活性和Cd含量等指标, 并采用Illumina MiSeq高通量测序技术, 研究修复后土壤细菌群落变化情况, 探讨DA-6和EDDS对龙葵修复Cd污染土壤的强化效果, 以期为Cd污染土壤的治理提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 供试材料供试土壤采自贵阳市乌当区贵州师范学院周边某污染地块, 土壤类型为石灰土, 其基本理化性质: pH为7.84, ω(有机质)为12.86 g·kg-1, ω(碱解氮)为84.00 mg·kg-1, ω(有效磷)为57.38 mg·kg-1, ω(速效钾)为229.23 mg·kg-1, 土壤ω(Cd)为5.25 mg·kg-1.土壤风干后, 挑出杂物磨碎过2 mm尼龙筛, 充分混匀后置于高22 cm、上口径23 cm和底径18 cm的花盆中, 每盆装土3 kg.
供试龙葵(Solanum nigrum L.)种子购于寿光市沃田农业科技有限公司.选取颗粒饱满的龙葵种子经75%的酒精浸泡30 s杀菌处理后, 用蒸馏水清洗干净, 播种于育苗钵中, 待长出4片真叶后移栽长势一致的幼苗于花盆中培养, 每盆2株.
1.2 试验设计本试验于2020年4~8月在贵州师范学院温室大棚进行, 共设计4个处理. ①CK: 对照, 不添加EDDS和DA-6; ②DA-6:施用10 μmol·L-1的DA-6; ③EDDS: 施用3 mmol·kg-1的EDDS; ④EDDS+DA-6:施用10 μmol·L-1的DA-6和3 mmol·kg-1的EDDS.每个处理设置4次重复.DA-6溶液以叶面喷施形式每盆添加10 mL(移栽后第21、28、35和42 d喷施)[21].EDDS溶液在收获前10 d均匀淋溶在土壤表面, 每盆用量为100 mL[22].龙葵生长期间均浇灌去离子水, 根据天气情况把握浇水频率, 保持土壤含水量为最大含水量的60%左右, 移栽3个月后收获.
将收获的龙葵分为地上部和根部两部分.分别用自来水、去离子水各洗涤2~3次, 擦干后测量株高和鲜重, 并留取一部分鲜样用于生理指标测定, 剩余部分在105℃烘箱中杀青30 min, 然后再调于70℃条件下烘干至恒重, 取出粉碎装袋备用.同时将土壤样品充分混合后分为两部分: 一部分迅速装入无菌袋中包扎密封, 低温条件下带回实验室于-80℃冰箱保存, 用于微生物高通量测序分析; 另一部分在室内自然风干, 剔除杂物研磨过筛后, 用于土壤有效态Cd含量的测定.
1.3 测定项目及方法龙葵的株高用卷尺测量, 鲜重用万分之一天平称取.龙葵叶片叶绿素采用95%乙醇提取, 分别于470 nm(类胡萝卜素)、649 nm(叶绿素b)和665 nm(叶绿素a)下测定吸光度并计算含量; 丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸显色法测定; 龙葵叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性分别采用氮蓝四唑法、愈创木酚法和双氧水法测定[23, 24].龙葵地上部Cd含量采用HNO3∶HClO4(优级纯, 3∶2, 体积比)的混合酸液消煮, 火焰原子吸收光谱仪(novAA 350)测定.测试过程通过添加标准物质灌木枝叶GBW07603(GSV-2)进行质量控制, 同时做空白试验, Cd检测的回收率为92.3%~103.5%.土壤有效态Cd含量采用0.1 mol·L-1 HCl浸提, 火焰原子吸收光谱仪测定.
土壤DNA按E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的DNA提取试剂盒操作步骤提取, 利用1%的琼脂糖电泳和紫外分光光度法检测质量.通过引物341F (5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')和805R(5'-CTACHVGGGTATCTAATCC-3')对细菌16S rDNA V3-V4区进行扩增, 通用引物上加有接头序列, 其中341F引物接有Barcode标签.PCR反应体系如下: 2×Hieff® Robust PCR Master Mix 15 μL、Bar-PCR primer F 1 μL、Primer R 1 μL、基因组DNA 10~20 ng, 补充无菌水至30 μL.PCR扩增条件为: 94℃预变性3 min; 94℃变性30 s, 45℃退火20 s、65℃延伸30 s, 共5个循环; 94℃变性20 s, 55℃退火20 s、72℃延伸30 s, 共20个循环; 最后72℃延伸5 min. PCR结束后, 对PCR产物进行琼脂糖电泳, 用琼脂糖回收试剂盒(cat: SK8131)对DNA进行回收.回收产物用Qubit 3.0 DNA检测试剂盒定量, 根据测得的DNA浓度, 将所有样品按照1∶1的比例进行混合, 混合后充分振荡均匀, 将混合样品送至生工(上海)生物工程有限公司, 利用Illumina MiSeq平台进行高通量测序[25, 26].
1.4 数据处理与分析用Excel 2019进行数据的处理和作图, 运用SPSS 26进行单因素方差分析, 采用最小显著差异法(LSD) 比较数据组间的差异.利用Uparse软件在97%相似性下, 对样品有效数据进行OTU序列聚类.采用Mothur软件计算土壤中细菌的ACE指数、Shannon指数和Simpson指数.
2 结果与分析 2.1 DA-6和EDDS对龙葵株高、鲜重的影响不同处理条件下龙葵的株高和鲜重情况见表 1.对照组的平均株高为46.20 cm, 添加DA-6后显著增加至53.13 cm.添加EDDS以及DA-6+EDDS的处理组龙葵株高分别为48.98 cm和49.85 cm, 与对照和DA-6处理组相比均无显著差异.添加DA-6和DA-6+EDDS处理组龙葵的地上部鲜重较对照分别显著增加了24.58%和19.57%(P < 0.05), 也显著高于EDDS处理组, 但两者之间差异不明显(P > 0.05).
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表 1 不同处理条件下龙葵的株高和鲜重1) Table 1 Plant height and fresh weight of Solanum nigrum L. under different treatments |
2.2 DA-6和EDDS对龙葵生理指标的影响
由表 2可知, 不同条件下龙葵叶片的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量大小顺序均为: DA-6 > DA-6+EDDS > CK > EDDS, 其中DA-6、DA-6+EDDS处理组龙葵叶绿素含量与CK、EDDS处理组的差异达显著水平(P < 0.05).与对照相比, 添加EDDS未引起龙葵叶片丙二醛含量改变, 而添加DA-6和DA-6+EDDS则使该指标分别显著降低了17.22%和12.32%(表 2).此外, 本研究还发现, 施用DA-6和EDDS以后, 龙葵叶片的抗氧化酶活性也呈现不同变化趋势(表 2).其中超氧化物歧化酶(SOD)活性表现为DA-6与DA-6+EDDS处理组显著高于CK与EDDS处理组, 但前两者、后两者相互之间差异不显著; 过氧化物酶(POD)活性介于100.06~110.13 U·(g·min)-1之间, 其余处理与对照均无显著差异, 但DA-6处理组显著高于EDDS处理组; 过氧化氢酶(CAT)活性以DA-6处理组最高, 与对照相比增幅达21.58%, 也显著高于EDDS和DA-6+EDDS处理组.
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表 2 不同处理条件下龙葵叶片的生理指标 Table 2 Physiological indexes of Solanum nigrum L. leaves under different treatment |
2.3 DA-6和EDDS对龙葵地上部镉吸收的影响
表 3显示了各处理条件下龙葵地上部Cd含量和Cd吸收量情况.添加EDDS和DA-6+EDDS促进了龙葵地上部对Cd的积累, 使其Cd含量分别较对照显著提高了26.95%和27.67%, 两者之间差异不显著.相比之下, DA-6处理组与另外3个处理组的龙葵地上部Cd含量无显著差异.本研究还发现, 与对照相比, 无论单施DA-6或EDDS还是将两者联合施用, 均能显著增加龙葵地上部Cd吸收量(P < 0.05), 其增幅分别为39.42%(DA-6)、30.17%(EDDS)和51.04%(DA-6+EDDS), 其中DA-6+EDDS处理组龙葵地上部Cd吸收量还显著高于EDDS处理组.
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表 3 不同处理条件下龙葵地上部Cd含量和Cd提取量 Table 3 Cd concentration and extraction capacity in plant shoots of Solanum nigrum L. under different treatments |
2.4 DA-6和EDDS对土壤pH和有效态镉含量的影响
各处理土壤pH值介于7.45~7.74之间(表 4), 其中DA-6处理组土壤pH值显著低于其余3个处理.此外, 添加生长调节剂DA-6和螯合剂EDDS后土壤Cd有效性呈增加趋势(表 4).具体而言, DA-6+EDDS、EDDS和DA-6处理组土壤有效态ω(Cd)为3.06、3.04和2.69 mg·kg-1, 分别是对照组[土壤有效态ω(Cd)为2.15 mg·kg-1]的1.42、1.41和1.25倍(P < 0.05), 其中联合施用DA-6和EDDS处理组还显著高于单独添加DA-6处理组.
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表 4 不同处理条件下土壤pH值和有效态Cd含量 Table 4 Soil pH and available Cd content under different treatments |
2.5 对土壤细菌群落结构的影响 2.5.1 土壤细菌群落多样性
本研究16个样品共获得有效序列1 241 795个, 平均长度为415 bp, 平均测序覆盖率达到99%.样品OTU稀释性曲线趋于平坦, 表明测序深度包括了样品中的绝大多数细菌类型, 测序数据量合理, 比较真实地反映了修复后土壤中的细菌群落组成, 可以满足后续多样性及丰度功能分析.运用Shannon、ACE和Simpson指数对各处理土壤细菌群落多样性进行分析(表 5).结果表明, 土壤细菌的Shannon指数以EDDS处理组为最小, 显著低于DA-6处理组, 其余3个处理组之间无显著差异.添加DA-6和DA-6+EDDS使土壤细菌的ACE指数略有增加, 但差异并未达显著水平; 添加EDDS处理组土壤细菌群落的ACE指数则显著低于其余3个处理(P < 0.05).与之相反的是, EDDS处理组土壤细菌的Simpson指数为0.011, 显著高于CK(0.008)、DA-6(0.006)和DA-6+EDDS(0.007)处理组.
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表 5 不同处理条件下土壤中细菌群落多样性指数 Table 5 Diversity index of bacterial community in soil under different treatments |
根据OTU聚类结果对样品进行均一化处理后, 用Mothur软件作Venn图, 比较不同处理条件下土壤细菌群落的相似性.不同样本用不同的颜色表示, 且不同颜色图形间重叠部分为两样本组间共有的OTU数(图 1).共检测到4 154个OTU, 其中CK、DA-6、EDDS和DA-6+EDDS处理组的OTU数分别为3 655、3 723、3 649和3 668个, 4个处理的公有OTU为3 074个, 占CK、DA-6、EDDS和DA-6+EDDS总OTU的比例分别为84.10%、82.57%、84.24%和83.81%, 而CK、DA-6、EDDS和DA-6+EDDS各自特有的OTU数分别为62、90、48和67个, 占相应样本总OTU的比例分别为1.70%、2.42%、1.32%和1.83%.
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图 1 不同处理条件下土壤细菌OTUs的韦恩分析 Fig. 1 Venn diagram of bacteria in soil under different treatments |
在门水平上, 土壤中的细菌主要分布在10个门类[图 2(a)].相对丰度最大的是变形菌门(Proteobacteria), 为38.13%~43.80%, 各处理之间无显著差异(P > 0.05); 其次是拟杆菌门(Bacteroidetes), 相对丰度为9.48%~12.97%, 其中DA-6处理组显著低于EDDS处理组.此外, 放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)和酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度也较高, 分别为8.06%~8.78%、5.75%~8.26%和5.60%~6.47%, 不同处理相对丰度不同, 但差异未达显著水平(P > 0.05).此外, 在其他相对丰度较小的细菌门中, 各处理间的差异不显著.
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图 2 不同处理条件下土壤细菌门水平和属水平相对丰度 Fig. 2 Relative abundance of the taxonomic composition of the bacterial communities at the phylum level and genus level in soil under different treatments |
在属水平上, 土壤所有测序结果中OTU平均相对丰度＞1%的属有10个.除其他(other, 丰度小于1%的物种的集合)和未分类(unclassified, 数据库中未收录)的细菌类群外, 最优势属均为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)[图 2(b)], 其相对丰度为7.30%~8.82%, 各处理之间无显著差异; 次优势属均为Ohtaekwangia属, 其相对丰度为3.39%~4.64%, 各处理间差异也不显著.本研究还发现, DA-6+EDDS处理组土壤Streptophyta属和DA-6处理组土壤Devosia属相对丰度显著高于EDDS处理组, 而添加EDDS使土壤Lysobacter属相对丰度显著低于其余3个处理(P < 0.05).
3 讨论 3.1 DA-6和EDDS对龙葵生长的影响龙葵的生长状况是决定其对土壤中Cd提取总量的一大因素, 主要通过株高、鲜重和干重等指标来反映.刘金等[27]的研究发现, 施用EDDS会使植物在生长过程中出现茎秆细和叶片小等现象, 进而不同程度地降低生物量.在本研究中, 与对照相比, 单独施用EDDS并未对龙葵生长产生明显影响, 可能是因为本研究中所采用的螯合剂浓度较低, 其本身对龙葵的毒害作用以及所活化的Cd对龙葵的胁迫作用不明显[28].本研究还发现, 单独添加DA-6后, 龙葵的株高和鲜重较对照均有显著提高, 这是因为喷施DA-6一方面提高了龙葵的叶绿素含量, 促进了龙葵的光合作用[29]; 另一方面增加了龙葵叶片的抗氧化酶活性, 降低了丙二醛含量, 使活性氧(ROS)对质膜的破坏作用得到抑制, 进而增强了龙葵的抗逆性[30~32].此外, DA-6+EDDS处理组龙葵地上部鲜重较对照显著增加了19.57%, 与单施DA-6处理组差异不显著, 说明两者联用后并未对DA-6本身的促进效果产生明显影响.
3.2 DA-6和EDDS对龙葵地上部Cd吸收的影响龙葵地上部对Cd的吸收状况是影响其对土壤中Cd植物提取效率的另一大因素.施加适量DA-6或EDDS能显著提高土壤重金属有效性, 促进植物的吸收, 这已经在许多研究上得到证实[33, 34], 本研究也得到了相似的结论.无论DA-6和EDDS单施或联合施用, 土壤有效态Cd含量均显著高于对照.因此, 添加DA-6和EDDS后, 龙葵地上部Cd含量有不同程度的提高.其中DA-6的作用机制可能是因为促进了龙葵根系生长, 分泌更多的有机酸, 降低了土壤pH, 通过溶解作用和解吸作用使土壤有效态Cd含量得到增加[35, 36]; 而EDDS作为一种螯合剂, 可以和土壤中的Cd离子结合形成配位基, 增加土壤Cd的流动性, 进而也提高了其生物有效性[37, 38].植物对重金属的提取量是综合考虑植物生长情况和重金属吸收情况后, 用于评价植物修复效果的重要指标.在本研究中, 单独施用DA-6和EDDS后龙葵地上部Cd提取量分别较对照显著增加了39.42%和30.17%, 将两者联用后, 增幅达51.04%.表明DA-6和EDDS发挥了协同效应, 在促进龙葵生长的同时还提高了对Cd的富集, 进而提高了对Cd污染土壤的修复效率.
3.3 DA-6和EDDS对土壤细菌群落的影响本研究采用Shannon指数、ACE指数和Simpson指数来分别反映土壤中细菌群落的多样性、物种丰富度和优势度.结果显示与对照组相比, EDDS处理组土壤细菌群落的ACE指数显著降低, 而Simpson指数显著增加.表明EDDS添加后, 土壤细菌的丰富度和多样性有所下降.原因是细菌对EDDS的毒性具有较强的响应, 再加上土壤Cd被活化以后, 增加了对细菌的胁迫[39].将DA-6和EDDS联用后, 细菌群落ACE指数和Simpson指数又变化为和对照组差异不显著.说明两者联合施用后, 土壤环境相对单独施用EDDS而言有所改善, 细菌群落的多样性得到恢复.这点从Venn图上EDDS处理组OTU总数以及各自特有的OTU占总OTU的比例均低于对照组和DA-6+EDDS处理组得以进一步证实.
对土壤中细菌群落物种分布进行了分析, 结果表明在门水平上, 变形菌门(Proteobacteria)在所有处理上丰度均为最高, 这与相关学者的研究结果是相同的[40, 41].变形菌门外膜主要由脂多糖组成, 保护内部遗传物质不受外部干扰, 因此可以在大多数环境条件下生存并繁殖, 成为优势菌[42].拟杆菌门是有机碳的主要矿化者[43], 在退化土地生态恢复过程中可以增加有机碳的含量, 并为其他微生物及土壤酶活性提供能量, 影响其他养分的含量, 是本研究中的第二大菌门.此外, 放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)和酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度也较高, 大于5%.在属的水平上, 各处理均以鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)丰度最高, 表明该属具有繁殖速度快、对贫营养或污染环境的生长适应性强等特点[44].溶杆菌属(Lysobacter)细菌具有很强的溶菌抑菌效果, 对多种植物病原真菌、细菌及线虫等都具有较强的拮抗活性[45].在本研究中, 添加EDDS处理组土壤溶杆菌属相对丰度较对照显著下降, 表明EDDS添加降低了土壤有益菌群的数量, 对龙葵生长产生不利影响.而将DA-6和EDDS联用后, 不仅使该菌属相对丰度恢复到和对照接近的水平, 还使土壤中与有机质分解、固氮等功能相关的Streptophyta属细菌相对丰度显著增加[46], 是土壤生态环境逐步变健康的标志.
4 结论(1) 单独施用DA-6以及DA-6与EDDS联合施用可显著提高龙葵叶片叶绿素含量和抗氧化酶活性, 进而促进龙葵的生长;
(2) 添加DA-6或EDDS均能提高土壤Cd有效性, 促进龙葵地上部对Cd的吸收.其中DA-6和EDDS联合施用条件下, 龙葵地上部Cd提取量最高, 较对照显著增加了51.04%;
(3) 单独施用EDDS会降低土壤细菌群落多样性, 使有益菌属相对丰度减少.将DA-6与EDDS联用后, 细菌群落多样性和分类学组成恢复到对照组水平.
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