2022, Vol. 43
, LI Lian-fang
, ZHU Chang-xiong , YE Jing , LIU Xue , GENG Bing , TIAN Yun-long , HUANG Xiao-ya
近年来, 由于工矿业活动、污水灌溉、污泥农用和含重金属畜禽粪便有机肥的施用等, 导致重金属向环境中的输入量不断增加, 重金属在土壤中不断累积甚至超标现象愈加明显, 其中, 砷(As)污染已经成为全球性的环境问题.如南亚国家(孟加拉国和印度等[1, 2])地下水As污染严重; 在我国的湖南石门、湖南株洲、湖南郴州、云南文山、广西河池和贵州独山等地[3~5]也发生过多起群体性As污染事件.As是一种毒性极强且具有致癌作用的类金属, 土壤中过量的As可减少土壤微生物的数量和多样性, 并导致植物生物学特性的异常变化[6], 在降低农作物产量和品质的同时, As还可通过食物链的传递累积而威胁人类健康安全.实施As污染农田修复与安全生产迫在眉睫, 而原位钝化修复则是实现重金属超标农田安全利用的合理选择之一.
生物炭作为土壤钝化修复材料, 近年来对其研究和应用正被国际社会广泛关注[7, 8], 利用对生物炭表面修饰及改性的方式以提高其对土壤重金属钝化效率的报道也不断增多[9].目前多数研究集中于生物炭和其改性材料对土壤重金属的固定效应以及其对重金属在土壤-植物系统中迁移转化的影响等方面, 而关于改性生物炭对土壤微生物的影响方面研究甚少.土壤微生物群落对土壤质量变化最为敏感, 是涉及土壤质量变化的关键功能指标[10], 钝化材料的施用可显著影响土壤微生物群落结构和多样性[11~14].据报道, 向土壤中施用海泡石、石灰和秸秆生物炭后, 土壤微生物多样性和丰度均增加, 并改变了土壤微生物群落组成, 且证实pH和重金属是影响微生物群落的关键因素[15].有研究还表明, 在As污染土壤中, 微生物活动也是介导As有效性变化的主要驱动力之一, 多种微生物谱系和As相关[16], 微生物可通过对As氧化还原等作用改变其在土壤中移动性和毒性[17].据Kataoka等[18]的研究结果, 在Sb和As污染土壤的细菌群落中以变形菌门相对丰度较高, 且变形菌门细菌中存在亚砷酸氧化酶序列[19], 通过影响土壤As形态转化而改变As的可利用性.因而, 探究钝化剂对土壤微生物的影响及其与微生物群落之间的相互作用关系显得至关重要.
前期研究已明确MBC能有效固定土壤As而降低As的移动性[20], 蚯蚓是土壤中生物量最大且对土壤污染具有强耐受力的典型无脊椎动物[21, 22], 其生理活动和生活习性可导致土壤性质和土壤重金属活性发生改变[23].MBC和赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)联合作用可使土壤中As的移动性能和环境风险大大降低, 将两者联合应用于As污染土壤修复效果更佳[24].但蚯蚓与生物炭/MBC单一或联合施用于土壤中后会对土壤微生物群落产生怎样的影响, 以及微生物群落变化和土壤中As转化之间的作用关系尚未可知.因此, 在前期研究的基础上, 本文拟探讨蚯蚓与生物炭/MBC单一或联合作用对土壤细菌多样性和群落结构的影响, 以期为As污染土壤修复提供一定的科学支撑.
1 材料与方法 1.1 供试土壤供试红壤采集于湖南石门雄黄矿周边500 m范围内的As污染菜地土壤, 经自然风干后研磨、过2 mm尼龙筛, 经测定分析, 土壤的ω(总As)为141.80 mg·kg-1, 土壤ω(As水提取态)为0.41 mg·kg-1.土壤其他基本性质如表 1所示.
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表 1 土壤的基本性质 Table 1 Characteristics of the soil |
1.2 铈锰改性生物炭(MBC)的制备
小麦秸秆生物炭(biochar, BC)采用小麦秸秆制备而成, 具体制备过程如下: 将小麦秸秆粉碎后过100目筛, 然后置于马弗炉内, 设置温度为600℃无氧热解2 h, 冷却至室温后研磨过100目筛备用.BC的基本性质见表 2.
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表 2 BC和MBC的基本性质 Table 2 Characteristics of the BC and MBC |
MBC的制备采用文献[20]的制备方法.其具体制备过程如下: 称取10 g制备的BC置于烧杯中, 用1 mol·L-1的盐酸浸泡12 h以去除杂质, 然后用去离子水清洗至中性.将该处理后的BC放入70~80℃烘箱中烘干, 研磨过100目筛后依次加入浓度为0.2 mol·L-1的高锰酸钾溶液50 mL和浓度为0.5 mol·L-1的氯化铈溶液50 mL, 搅拌均匀, 超声分散2 h后, 将其放入水浴锅95℃恒温水浴蒸干, 然后于600℃的马弗炉内无氧热解2 h, 冷却至室温, 所得产物即为MBC.其基本理化性质如表 2所示.
1.3 试验设计蚯蚓培养: 试验用蚯蚓为赤子爱胜蚓(Eisenia foetida), 购于北京大地聚龙生物科技有限公司.试验前先将蚯蚓置于试验环境中预培养2周, 使蚯蚓适应环境的变化.试验前需要将蚯蚓清肠, 选取大小基本一致的成年蚯蚓, 用去离子水洗净后置于烧杯中, 烧杯底部放置被去离子水湿润的滤纸, 室温下清肠48 h, 其间更换滤纸并保持滤纸湿润.
试验处理: 准确称取1.2 kg的As污染土壤置于每个花盆(上部内径×底部内径×高依次为23 cm×11 cm×18 cm)中, 按照MBC、BC以及和蚯蚓的不同组合, 共设置6个试验处理, 每个处理3次重复, 共18盆, 蚯蚓处理每盆添加35条[生物量为(8.23±0.54 g)].具体处理如下: ①污染土壤(CK); ②污染土壤+蚯蚓(AE); ③污染土壤+0.3%BC(AB); ④污染土壤+蚯蚓+0.3%BC(AEB); ⑤污染土壤+0.3%MBC(AMB); ⑥污染土壤+蚯蚓+0.3%MBC(AEMB), 本试验周期为60 d.
向土壤中放入蚯蚓前, 调节土壤含水量为最大田间持水量的70%(70% MWHC), 并在(25±2)℃条件下孵育48 h, 孵育结束后按各处理放入蚯蚓.恒重法每隔1 d补充去离子水以保持土壤含水量不变, 土壤培养温度为(25±2)℃.分别在培养的1、15、30和60 d取土样分析土壤中的WSAs含量和土壤As赋存形态, 同时测定土壤pH值, 将部分第60 d土样置于-80℃条件下保存, 用于土壤细菌DNA提取和测序.
1.4 分析方法 1.4.1 土壤、BC和MBC理化性质的测定土壤、BC和MBC理化性质的分析采用文献[25]的方法.土壤As赋存形态采用Wenzel连续提取法[26], WSAs采用1∶10土水比提取分析, pH采用1∶5土水比-电位法测定, 全N采用凯氏定氮法, 全P采用钼锑抗比色法, 全K采用火焰原子吸收法, 土壤有机碳采用K2Cr2O7外加热法, MBC中锰和铈含量的测定采用型号为Optima 8300的电感耦合等离子体光谱仪(PerkinElmer公司, USA)分析, 检出限为0.01 mg·L-1.
1.4.2 土壤中细菌群落高通量分析(1) 基因组DNA提取 使用PowerSoil DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories, Carlsbad, CA)试剂盒提取基因组DNA.
(2) 基因组DNA质检 使用Nanodrop检验DNA质量和浓度.
(3) PCR扩增 选择引物338F (5'-ACTCCTA CGGGAGGCAGCAG-3')和806R (5'-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3') 对16S rRNA的V3~V4区进行PCR扩增, PCR扩增总体积为25 μL(表 3).
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表 3 PCR扩增总体系 Table 3 Total PCR amplification system |
(4) PCR产物电泳检测 用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的条带大小, 电泳电压为170 V, 时间为30 min.
(5) PCR产物纯化 PCR产物使用磁珠法进行自动化纯化.使用Caliper LabChip GX Touch HT (PerkinElmer, USA)检测PCR产物浓度、片段大小.
(6) MiSeq文库构建 按照混池比例, 对每一个样本的PCR产物取一定体积混合成一个上机文库, 并使用2%琼脂糖凝胶对文库片段进行筛选、纯化回收和PCR富集, 完成文库构建, PCR富集反应程序: 94℃ 5 min, 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 60 s, 28个循环; 72℃ 7 min, 4℃保存.最后, 构建完成的MiSeq文库使用磁珠法进行纯化.
(7) 上机测序 最后文库在Illumina MiSeq平台上机测序, 由北京奥维森基因科技有限公司提供技术支持.
1.5 数据处理与统计分析数据处理和统计分析采用SPSS 22软件和Origin 9.5完成; 土壤微生物多样性分析使用QIIME软件和R软件等完成.
2 结果与分析 2.1 样品中所含OUT数目分析通过对蚯蚓、BC和MBC单一及其两者联合作用的6个处理共18个样品进行高通量测序, 共获得466 452条高质量序列, 样本平均条带数为25 914.各处理的稀释曲线斜率均已接近饱和(图 1), 表明其测序深度基本满足要求, 对各组样品的独特OTUs和组间样品的重叠OTUs进行Venn图分析发现(图 2), CK、AE、AB、AEB、AMB和AEMB这6个处理的OTUs总数分别为2 962、3 085、2 999、2 971、2 950和2 814个, 蚯蚓处理下OTUs最多, 蚯蚓-MBC联合处理下OTUs较少, 而不同处理下特有的OTU的数目分别是847、988、1 063、461、853和1 197个, 各处理下特有的OTUs按高低排序为: AEMB > AB > AE > AMB > CK > AEB, 各组样品中检测到共有的OTUs为2 014个(表 4).各组样品中细菌群落共包含38个门、96个纲、140个目、269个科和438个属.
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图 1 土壤样品细菌群落稀释曲线 Fig. 1 Rarefaction curve of bacterial community in soil samples |
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图 2 不同处理中土壤细菌群落的OTUs数量Venn图 Fig. 2 Venn diagram of OTUs numbers of bacterial communities of soils in different treatments |
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表 4 不同处理中土壤细菌群落的OTUs数量 Table 4 OTUs numbers of bacterial communities of soils in different treatments |
2.2 土壤细菌多样性的变化
Chao1、PD_whole_tree和Shannon指数为表征微生物群落丰富度和多样性的指标[27], 数值越大表示丰富度和多样性越高.不同处理比较, 发现此3种多样性指数均表现为大致相似的规律(表 5).其中, 以蚯蚓处理(AE)的Chao1、PD_whole_tree和Shannon指数最高, 相较于CK分别增加了15.81%、14.22%和1.34%, 蚯蚓的加入显著增加了As污染土壤中细菌的丰富度和多样性(P < 0.05); 而单一的BC和MBC处理AB和AMB中Chao1、PD_whole_tree和Shannon指数则降低, 说明BC和MBC均可在一定程度上导致土壤微生物多样性和丰富度的下降, 但两处理间及其和对照间均无显著差异(P > 0.05); 相较于AB和AMB处理而言, 蚯蚓/BC(MBC)联合的AEB和AEMB这2个处理中, Chao1、PD_whole_tree、Shannon指数分别增加了11.61%和3.8%、0.11%和0.70%、1.71%和2.38%, 表明BC(MBC)和蚯蚓的联合作用有利于增加土壤微生物多样性, 但多样性指数在AEB和AEMB两处理间及其和对照间均无显著差异(P > 0.05).
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表 5 不同处理对细菌群落α多样性的影响1) Table 5 Effect of different treats on α diversity of bacterial community |
2.3 土壤细菌群落结构的变化
在相对丰度上, 细菌门水平的结果如图 3(a)所示.将相对丰度大于0.5%的细菌门选为优势细菌门, 可以发现, 本研究土壤中的细菌优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽孢杆菌门(Gemmatimonadetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、浮霉菌门(Planctomycetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、糖杆菌门(Saccharibacteria), 这10种菌门占了总丰度的98%以上, 不同处理的As污染土壤中细菌组成基本相似.
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图 3 各处理中细菌门和纲水平的相对丰度 Fig. 3 Relative abundance at phylum and class levels in different treatments |
不同处理比较而言, 相对丰度变化较明显的为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi).从变形菌门看, 除CK处理外, 其在其他各处理中的相对丰度均超过了40%, 试验处理AE、AB、AEB、AMB和AEMB中变形菌门相对丰度均比对照CK明显增加, 相应的增幅为8.69%~17.08%, 即在As污染土壤中加入蚯蚓、BC(改性)及蚯蚓和BC(改性)联合处理均增加了变形菌门的相对丰度, 其中以AEMB联合处理增幅最大, AB处理变化最小; 从拟杆菌门的变化看, 各处理下其相对丰度按高低排序为: AEMB > AE > AEB > AB > AMB > CK, 可见, 蚯蚓、BC(改性)及蚯蚓和BC(改性)联合处理均增加了拟杆菌门的丰度, 增幅为3.13%~329.47%, 其中AEMB处理相对丰度增幅最大, 其次为AE处理, 增幅为218.47%, 以AB和AMB增幅较小, 分别为36.20%和3.13%; 而酸杆菌门的相对丰度在各处理中明显下降, 相对丰度从高至低排序为: CK > AB > AMB > AE > AEB > AEMB, 和对照CK比较, AEMB、AEB、AE、AMB和AB处理的相对丰度依次下降了19.18%、17.85%、16.23%、14.09%和8.43%, 即加入蚯蚓、BC和MBC均导致酸杆菌门相对丰度降低, 且蚯蚓和BC(改性)联合处理降幅最大; 与此相似, 蚯蚓、BC和MBC的添加也降低了绿弯菌门的相对丰度, 其中, 以AEMB联合处理下的相对丰度最低.
从变形菌门的主要3个纲情况看[图 3(b)], 可以发现蚯蚓、BC和MBC均促进了α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)和γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)的生长.其中所有加入蚯蚓的处理组(AE、AEB和AEMB)中, γ-变形菌纲的相对丰度均明显高于未加入蚯蚓的处理组(CK、AB和AMB), AE、AB、AEB、AMB和AEMB的相对丰度比对照CK增加270.07%、57.89%、248.11%、35.79%和524.41%, 蚯蚓/MBC的联合处理AEMB对γ-变形菌纲细菌生长的促进作用最为明显.从拟杆菌门2个主要纲的情况看, 黄杆菌纲(Flavobacteria)在加入蚯蚓的3个处理AE、AEB和AEMB中相对丰度依次为5.27%、4.00%和7.31%, 显著高于CK(0.02%)、AB(0.02%)和AMB(0.03%), 相对丰度相比CK增加了199.2~364.5倍, 其中AEMB联合处理下的相对丰度最高; 与此同时, 鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria)在加入蚯蚓、BC和加入MBC的处理下, 其相对丰度均增加, 其中尤以AEMB联合处理最为显著, 增幅为73.78%.
从最大优势菌变形菌门目水平看(表 6), 黄杆菌目(Flavobacteriales)和气单胞菌目(Aeromonadales)在所有加入蚯蚓的试验组中含量分别为4.00%~9.21%和1.37%~5.50%, 均明显高于未加入蚯蚓的处理组, 各处理中, AEMB处理相对丰度最大; 属水平上, 贪食菌属(Variovorax)在CK、AB和AMB所占丰度很低, 分别为0.23%、0.42%和0.55%, 而在AE、AEB和AEMB所占丰度为3.70%、2.59%和5.13%, 分别为CK的16.09、11.26和22.30倍, 其中以AEMB联合处理的相对丰度最高.
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表 6 各处理中细菌目水平和属水平平均相对丰度1)/% Table 6 Relative abundance at order and genera levels in different treatments/% |
选取所有样本绝对丰度前20个属进行相互关联性分析(P < 0.05, |R| > 0.6), 绘制成微生物属间共现性关系网络(图 4), 表现为属间高度联系组成的复杂关系.本研究分析发现, 有19个菌属(顶点数是19)间丰度显著相关, 分别是属于酸杆菌门的11_24和RB41菌属, 属于拟杆菌门的Flavisolibacter和黄杆菌属(Flavobacterium), 属于放线菌门的Pseudarthrobacter, 属于绿弯菌门的玫瑰弯菌属(Roseiflexus), 属于硝化螺旋菌门的硝化螺菌属(Nitrospira), 属于芽孢杆菌门的芽单胞菌属(Gemmatimonas)以及属于变形菌门的Burkholderia_Paraburkholderia、堆囊菌属(Sorangium)、贪食菌属(Variovorax)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、马赛菌属(Massilia)、气单胞菌属(Aeromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Caenimonas、溶杆菌属(Lysobacter)、Haliangium、Methylotenera和鞘脂单胞菌属(Sphingomonas). 其中, 除酸杆菌门的11_24和RB41这2个菌属的丰度与硝化螺旋菌门的硝化螺菌属(Nitrospira)和变形菌门的贪食菌属(Variovorax)的丰度显著负相关外, 其余菌属丰度均为显著正相关.本研究网络分析中细菌菌属来源于酸杆菌门、拟杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、硝化螺旋菌门、芽孢杆菌门和变形菌门, 均为优势菌门, 其中, 大部分的细菌菌属来源于变形菌门.
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点的颜色代表所属门, 点的大小代表丰度的大小, 线的粗细代表相关性大小, 线为红色表示呈正相关, 蓝色表示呈负相关 图 4 微生物属间共现性关系网络 Fig. 4 Network of co-occurrence among bacteria genera |
土壤中WSAs是易被生物吸收的主要As存在形式, 其含量的高低决定了土壤As的毒性高低和风险强弱.将细菌门水平相对丰度的变化和土壤中WSAs含量进行相关分析(图 5), 发现变形菌门和拟杆菌门细菌与WSAs含量为显著负相关(P < 0.05), 而酸杆菌门和绿弯菌门细菌与WSAs含量之间呈显著正相关(P < 0.05), 即随着MBC、蚯蚓的单一或联合作用造成土壤中As固定效应增加, 导致变形菌门和拟杆菌门的大量繁殖, 却抑制了酸杆菌门和绿弯菌门细菌的生长.
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*表示P < 0.05，*表示P < 0.01 图 5 细菌门水平相对丰度与土壤水溶态As含量相关性分析 Fig. 5 Correlation analysis between relative abundance of bacteria at phylum level and WSAs in soils |
另经LDA Effect Size分析, 明确组间在丰度上有显著差异的菌[阈值> 2, 图 6(a)], 对于不同的处理而言, AE、AB、AEB、AMB、AEMB和CK中的差异指标分别为9、3、10、14、7和6.具体而言, 在与WSAs含量具有显著相关的4个菌门中, 发现丰度上有显著差异的菌[图 6(b)], 添加蚯蚓(AE)主要促进变形菌门中普罗卡杆菌属(Procabacter)和Haliangium属细菌的大量繁殖, 蚯蚓-BC联合(AEB)处理下以拟杆菌门中Prevotellaceae OPB56科细菌发挥了主要作用, 在AMB处理下则带来变形菌门中亚硝化单胞菌科(Nitrosomonadaceae)、Afipia属和苯基杆菌属(Phenylobacterium)细菌相对丰度的增加, 在AEMB联合处理下, 其种群则以变形菌门中丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)和Ramlibacter属细菌为主, 上述处理均和对照土壤中以变形菌门Undibacterium属为主的细菌群落呈现明显差异.细菌物种丰度上的差异正体现了细菌对蚯蚓/BC(改性)单一和联合作用的选择性适应, 这些菌可能参与土壤中As的固定和形态转化过程.
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LDA得分表示阈值, (a)展现不同组中丰度有显著差异的物种(阈值> 2), 柱状图的长度代表显著差异物种的影响大小; (b)为与WSAs含量具有显著相关的4个菌门(变形菌门、拟杆菌门、酸杆菌门和绿弯菌门)中, 具有显著差异的细菌的进化分支, 由内至外辐射的圆圈代表由门至属的分类级别; 在不同分类级别上的每一个小圆圈代表该水平下的一个分类, 小圆圈直径大小和相对丰度大小呈正比; 无显著差异的物种统一着色为黄色, 差异物种Biomarker跟随组进行着色, 红色节点表示在红色组别中起到重要作用的微生物类群, 绿色节点表示在绿色组别中起到重要作用的微生物类群, 其它圈颜色意义类同 图 6 基于分类信息的LEfSe分析的LDA分布和进化分支 Fig. 6 LEfSe analysis based on the classification information of the LDA distribution and the evolutionary branch |
为进一步了解土壤WSAs、pH和As赋存形态与细菌群落结构间的关系, 明确细菌菌属和土壤As形态转化之间的关联性, 将土壤中细菌菌属和各指标进行相关分析, 图 7为WSAs、pH和As赋存形态F1~F5(F1:非专性吸附态As; F2:专性吸附态; F3:无定型结晶水合铁铝氧化物结合态; F4:结晶水合铁铝氧化物结合态; F5:残渣态)与不同细菌菌属间的相关性热图.结果发现, 贪食菌属(Variovorax)与WSAs和土壤pH值间均呈显著负相关(P < 0.05), 即随着土壤pH值降低及蚯蚓/MBC对土壤有效As固定的同时, 贪食菌属(Variovorax)则大量繁殖, 这可能与贪食菌属对As的吸收、吸附和转化等作用导致土壤As的固定有关; 从土壤As赋存形态看, 发现与无定形及弱结晶水合铁铝氧化物结合态As(F3)显著相关的菌属大量繁殖, 涉及发挥显著负相关作用的细菌(11_24属和RB41属)与具有显著正相关作用的马赛菌属(Massilia)、Caenimonas属和芽孢杆菌属(Gemmatimonas)细菌, 其中Caenimonas属和As形态F3呈现极显著正相关关系.前期研究已证明一个突出事实: 蚯蚓和MBC的加入均促进了F3的形成[24].由此可推测, 与无定型结晶水合铁铝氧化物结合态As(F3)显著相关的菌属可能直接导致土壤活性As向无定形及弱结晶水合铁铝氧化物结合态的转化, 导致F3的质量分数大幅提升.
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1.WSAs, 2.pH, 3.F1, 4.F2, 5.F3, 6.F4, 7.F5; *表示P < 0.05, **表示P < 0.01 图 7 菌属与WSAs、pH和砷赋存形态之间的相关性热图 Fig. 7 Heatmap of the correlation between bacteria genera and WSAs, pH, and As species |
根据本研究的结果, 蚯蚓和BC(改性)单一与联合作用均导致细菌群落结构发生明显变化.As污染红壤中细菌群落的变化, 一方面由于某些细菌表现出耐As性, 使其中具有As抗性的细菌相对丰度增加; 另一方面, 某些细菌因影响土壤中As的形态转化及其对As的吸附, 从而呈现相对丰度的差异.
据报道, 变形菌门是细菌中最大的门, 是全球土壤中相对丰度最高的一类细菌, 被认为是最耐胁迫的细菌[28], 携带有绝大多数的重金属抗性基因[29].有研究表明, 变形菌门中的α-、β-和γ-变形菌纲细菌可将As(Ⅲ)氧化为As(V)[30], 降低As的有效性; 其中, 气单胞菌(属于γ-变形菌纲)、贪食菌属(属于β-变形菌纲)也被证明能够氧化As(Ⅲ)[31].本研究中, 土壤中变形菌门所占相对丰度最大, 蚯蚓、BC(改性)的单一和联合各处理中变形菌门的相对丰度均比对照大大增加, 其中以蚯蚓-MBC的联合处理增幅最大; 进一步的分析也表明, 变形菌门与土壤中WSAs含量呈显著负相关, 这可能与变形菌门中某些细菌具有对土壤As的转化固定功能有关, 在蚯蚓、BC(改性)的单一及联合处理下, 变形菌门细菌通过吸附、转化和固定等作用降低土壤WSAs含量的同时大量繁殖, 因而相对丰度明显增加; 同时, 变形菌门中的γ-变形菌纲、气单胞菌目和贪食菌属在蚯蚓参与下相对丰度也大大增加, 前期研究结果已证实蚯蚓和MBC联合作用对土壤As固定效果最优, 这可能是由于该处理在蚯蚓介导下可大大促进变形菌门中的γ-变形菌纲、气单胞菌和贪食菌属的生长, 而这些菌均与As的转化有关, 因此蚯蚓通过促进这些菌的生长繁殖, 参与As的转化, 从而降低As的有效性.另据细菌菌属与WSAs的相关性热图分析结果, 贪食菌属和WSAs呈显著负相关, 这也证实了贪食菌属参与土壤As的固定转化作用, 而马赛菌属被证实可参与As的氧化还原[32], 溶杆菌体内不仅具有As抗性基因, 且在洛克沙胂降解中起着重要作用[33], 这2种菌分别来自于β-和γ-变形菌纲, 其因参与土壤As的形态转化从而造成土壤不同赋存形态As与其细菌丰度间显著相关的必然联系.
有研究证实拟杆菌门、酸杆菌门和绿弯菌门均能良好适应重金属污染土壤[34~37].Chen等[37]的研究发现拟杆菌门和酸杆菌门具有较多的重金属抗性和还原基因, 而绿弯菌门在重金属污染场地中相对丰度也相应增加[38].拟杆菌门、酸杆菌门和绿弯菌门作为优势细菌门, 其相对丰度的变化可反映出它们对土壤As的响应.本研究发现拟杆菌门相对丰度和土壤中WSAs含量呈负相关关系, 即随着MBC、蚯蚓的单一和联合作用造成土壤中As的固定效应增加的同时, 拟杆菌门细菌也大量繁殖, 其中, 尤以黄杆菌纲和鞘脂杆菌纲细菌更甚, 而这2种菌则具有很强的耐砷性, 前者能够将As甲基化, 且对亚砷酸盐的甲基化速度比砷酸盐快[39], 从而影响土壤中As的有效性.此外, 酸杆菌对重金属不仅具有较强耐性[40], 且发现酸杆菌内存在与As转运或转化有关的功能基因[30]; 绿弯菌可作为电子传导受体, 将活性更强的亚砷酸盐氧化为移动性更弱的砷酸盐[41], 这表明其参与土壤中As形态转化过程, 从而影响了土壤As的固定, 这两种菌的存在均利于降低土壤中As的有效性.
3.2 蚯蚓/生物炭(改性)对土壤细菌多样性的影响和物种选择性生物炭为微生物提供了一个独特的微环境, 可以促进某些细菌的快速增长而抑制其他细菌的生长, 从而导致细菌多样性降低[42].一方面, 生物炭的施用会改变土壤某些物理化学性质[43], 从而对土壤中微生物群落产生影响; 另一方面, 生物炭来源、颗粒直径和施用量等均可对微生物多样性构成直接影响, 已有研究证实大颗粒、高施用量和高温制备的生物炭会降低细菌生物量和多样性[44].本试验中, BC和MBC的施入均导致微生物群落多样性和丰富度的下降, 可能因为本研究中BC为高温制备(600℃), 而MBC则经过2次高温热解(600℃), 因而对细菌群落影响较未改性的更大.在土壤污染钝化修复技术研发过程中, 生物炭设计改性方面应该注重热解温度对土壤微生物的影响而适当优化材料制备工艺.本研究中, 蚯蚓和BC(改性)联合处理下微生物群落多样性大大高于BC/MBC的单一处理, 说明蚯蚓的加入利于缓解和恢复土壤中被BC和MBC影响的微生物群落, 这可能与蚯蚓对土壤的挖掘、吞食活动及蚯蚓粪改良了土壤性能有关, 包括土壤颗粒变小、表面积变大、湿度增加、有机质转化和C/N比的变化等[45]土壤物理化学性质, 从而更有利于微生物的繁殖; 加之蚯蚓消化道中存在大量特殊微生物[46], 这些微生物可随蚯蚓粪进入土壤.因而, 相对于BC/MBC的单一施用, 其与蚯蚓的联合作用更利于As污染环境的恢复和改善, 同时也表现了微生物对As污染的选择适应性.已有研究表明, 在单一蚯蚓对As污染土壤处理下的Haliangium属细菌是土壤As和Sb污染的核心微生物群, 其可直接参与As和Sb的代谢过程[47]; 在本研究MBC处理下的土壤中存在的Afipia属细菌含有arsC基因, 可参与As的还原过程[48]; 蚯蚓-MBC(AEMB)联合作用下存在的Comamonadaceae科细菌具备氧化As(Ⅲ)的能力[49], 而Ramlibacter属细菌和重金属浓度存在显著的相关性, 被认为是土壤修复的生物指示剂[50].这些差异性强的细菌物种可作为特异性功能微生物参与As的代谢转化过程, 从而影响土壤中As的移动性和生物有效性.
4 结论(1) 小麦秸秆生物炭和铈锰改性生物炭的施用均降低了土壤中细菌的丰富度和多样性, 单一蚯蚓的加入则大大提升了土壤中细菌多样性指数, 其Chao1、PD_whole_tree和Shannon指数均显著高于生物炭(改性)单一及其与蚯蚓联合处理, 显著增加了As污染土壤中细菌的丰富度和多样性, 蚯蚓的加入可缓解和恢复因生物炭(改性)施用导致的土壤细菌群落丰富度和多样性的降低.
(2) 在蚯蚓、小麦秸秆生物炭(改性)及其两者联合处理下, 土壤中优势菌门主要为变形菌门、酸杆菌门、绿弯菌门和拟杆菌门等10种菌门, 其中, 相对丰度变化较大的为变形菌门、酸杆菌门、绿弯菌门和拟杆菌门这4种菌门; 在改性生物炭-蚯蚓AEMB联合处理下变形菌门和拟杆菌门的相对丰度均大大提升, 而在各处理下绿弯菌门和酸杆菌门相对丰度均明显下降, 且以AEMB联合处理下最低.
(3) 土壤中变形菌门和拟杆菌门细菌与WSAs含量为显著负相关, 而酸杆菌门和绿弯菌门菌与WSAs含量之间呈显著正相关, 其中, 蚯蚓的加入显著促进了γ-变形菌纲、黄杆菌目、气单胞菌目和贪食菌属的生长, 从而导致As的浓度和有效性产生变化.蚯蚓、生物炭(改性)及两者联合处理对As污染红壤中细菌群落具有选择性作用, 并通过这种选择性作用影响土壤中As的有效性.
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