在基于生物法的污水处理工艺中, 有机负荷率(又称食料与微生物的比例, F/M)是一个重要的操作参数, 影响污染物降解过程和污染物去除率^[1~4].这是由于生物法污水处理系统主要依靠微生物实现污染物的去除^[5], F/M高低能够直接影响微生物的代谢和生长.保持适当的F/M, 可以将内源代谢聚合物与微生物的比例控制在适宜范围, 使其形成具有良好沉降和浓缩性能的生物絮体^[6].活性污泥法的F/M(以BOD/MLVSS计, 下同)一般为0.2~0.5 kg ·(kg ·d)^{-1[2, 3]}.F/M较低或较高都能显著影响出水水质和污泥质量.

为了更好地揭示F/M与污水处理系统运行间的关系, 学者们探究了F/M对活性污泥(activated sludge, AS)微生物群落的影响, 并有了一定的认识.例如: F/M较低时, 对基质亲和力更强的丝状菌相对丰度会升高, 容易引发丝状菌污泥膨胀^[7]; 而F/M较高时, 适应高负荷的细菌大量繁殖, 形成大量松散絮体, 也会使得污泥沉降性能降低^[2], 同时还伴随有COD去除率降低、氧曝气量高和污泥产量高等问题^[8].此外, F/M较低时, 由于资源受限而产生的选择压会使AS微生物群落物种多样性和功能基因多样性均有所降低^{[1, 9]}.然而, AS微生物群落整体多样性高, 不同微生物对环境选择压的响应不同, 且存在复杂的相互作用关系, 仅从多样性和组成揭示F/M对AS微生物群落的影响还远远不够.

微生物间的共现(co-occurrence)关系作为一种确定性因素, 是群落形成的重要驱动力^[10].在复杂的生态系统中, 微生物间的网络关系能够影响群落的稳定性^[11], 并最终影响系统的功能和稳定性^[12].有研究表明, 微生物生态网络中的多种拓扑学性质都与系统的功能和稳定性存在联系, 例如, 生态网络的模块生态网络中的关键物种(keystone)所执行的特殊代谢功能维持了微生物群落的稳定性^[13]; 环境胁迫能够降低网络关系的模块化程度和正负相关关系比例, 群落稳定性也随之降低^[14]; 生态网络较短的平均路径距离和较高的平均路径效率有利于提高系统的运行效率^[5].另外, 微生物网络复杂度与群落多样性并不存在直接关联, 网络复杂度甚至随群落多样性的降低而增加^[15], 和微生物群落多样性相比, 微生物群落间的相互作用关系可能对环境胁迫及扰动更为敏感^[16].因此, 探究不同F/M条件下AS微生物间的相互作用关系和识别网络关系中的关键物种(OTUs)以及对环境的响应对深入理解F/M对AS微生物的影响机制十分必要.但目前关于F/M影响AS微生物共现关系的研究还十分缺乏, 仅有的研究表明, F/M较低时, 由于可利用食物存在限制, 功能基因间联系更加紧密且主要是正相关关系^[9].

基于以上背景, 本研究采用高通量16S rRNA基因测序技术, 运用基于随机矩阵理论(random matrix theory, RMT)的分子生态网络分析(molecular ecological network analysis, MENA)方法, 解析F/M对AS微生物共现关系的影响, 以期为WWTPs的优化设计、精准调控提供理论依据.

本研究采用统一方法对中国21个WWTPs进行了AS样品采集, 每个WWTP采集3个样品, 最终共获得63个AS样品.由于目前对F/M还未有统一的建议范围, 本研究基于国内外的报道^{[2, 3]}, 将 < 0.2 kg ·(kg ·d)^-1、0.2~0.5 kg ·(kg ·d)^-1和>0.5 kg ·(kg ·d)^-1作为划分较低F/M、正常F/M和较高F/M的标准.按照此标准, 63个样品共划分为3组(按照F/M从低到高依次命名为A、B和C组), 每组21个样品, 每组样品所在污水厂的地理位置信息、F/M值及处理工艺见表 1.

表 1 (Table 1)

表 1 采样污水厂的地理位置及处理工艺 Table 1 Geographic locations and treatment processes of sampled WWTPs 分组 污水厂 F/M /kg·(kg·d)-1 纬度(N) /(°) 处理工艺 A组 DL1 0.02 38.88 AO A组 DL2 0.02 38.87 CASS A组 XA1 0.02 34.37 A2O A组 WX2 0.04 31.53 A2O A组 XM2 0.09 24.56 A2O A组 SZ1 0.15 22.56 SBR A组 WH2 0.15 30.67 AO B组 CD1 0.27 30.51 A2O B组 XM4 0.28 24.58 OD B组 XA2 0.31 34.37 A2O B组 XM3 0.33 24.46 A2O B组 SH2 0.41 31.25 A2O B组 BJ2 0.47 39.83 A2O B组 BJ1 0.48 39.90 A2O C组 WX1 0.58 31.61 MBR C组 SZ2 0.60 22.54 A2O C组 SH1 0.82 31.28 A2O C组 SH3 0.83 31.35 AO C组 SZ3 1.15 22.54 OD C组 WH1 1.24 30.59 A2O C组 XM1 1.66 24.47 A2O

表 1 采样污水厂的地理位置及处理工艺 Table 1 Geographic locations and treatment processes of sampled WWTPs

使用PowerSoil^® DNA提取试剂盒对63个AS样品离心后的污泥沉淀物进行DNA提取.将满足上机要求的DNA样品进行PCR扩增, 扩增区为16S rRNA基因的V4区.PCR扩增使用的前引物为515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′), 反向引物为806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′).完成PCR扩增后, 对PCR产物进行凝胶纯化, 纯化后的产物通过Illumina MiSeq平台完成16S rRNA基因测序.获得测序的原始数据后, 通过Galaxy平台完成数据的预处理, 预处理过程中参数的设置详见文献[17].

本研究采用美国环境基因组研究所(IEG)开发的开放型网络分析平台进行活性污泥微生物间共现关系的分析.该网络分析方法基于随机矩阵理论(RMT): 若实对称随机矩阵的最近邻特征值之间具有相关性, 则特征根的最近邻间距分布(nearest neighbor spacing distribution, NNSD)服从高斯正交系综(Gauss orthogonal ensemble); 若无相关性, 则NNSD服从泊松分布.此方法的主要步骤为: 计算OTUs间的皮尔森相关系数或斯皮尔曼相关系数; 获得由高斯分布转变为泊松分布的最小相似性阈值; 基于该阈值构建样品OTUs间的网络关系^[18].生态网络通常具备无标度、小世界和模块化的特征.在一个生态网络中绝大多数的节点(物种、OTU或基因)只和少数几个节点相邻, 只有少数几个节点存在大量的相邻节点, 这种现象称作无标度^[19].无标度是复杂系统中生态网络最显著的特征, 可利用网络的连通度分布是否符合幂律模型(R²>0.8)进行判断^[20].若生态网络内的大多数节点仅通过少数几个节点就能实现互相连接, 节点间的平均距离较短, 则认为该生态网络具有小世界的特征^[21].此外, 模块化也是生态网络的基本特征之一, 网络中的每个模块被认为是具有相似生境偏好^[22]或空间区划^[23], 执行相似生态功能^{[24, 25]}的物种、OTUs或基因的集合, 网络的模块化程度可通过模块系数来衡量.除此之外, 还有其他一些较为重要的生态网络参数, 例如: 能够反映网络的复杂度的平均聚集系数, 反映网络中信息传输或物质交换的效率的平均路径距离等^[5].

存在环境胁迫时的群落多样性变化一直是学者们关注的重点, 这是因为群落多样性与系统的功能和稳定性存在密切联系: 微生物群落的均匀度越高越有益于系统抵御外界环境的干扰、保持稳定^[26].同时, 多样性高的群落可能含有更多执行相同功能的物种, 由此形成的功能冗余现象有助于系统抵御环境扰动, 维持功能及稳定性^{[5, 27]}.因此, 本研究首先考察了F/M对微生物群落多样性的影响.然而, 通过计算不同F/M条件下群落的香农-维纳指数(H)以及Pielou均匀度指数(J)后发现, A组微生物群落的多样性和均匀度显著低于B组和C组(P < 0.01), 但B组和C组间的群落多样性和均匀度无显著差异(P>0.05)(图 1).这说明, 较低的F/M能够显著抑制AS微生物群落的多样性和均匀度, 但群落多样性和均匀度对较高的F/M不敏感.因此, 生物多样性指标无法全面评价F/M对AS微生物群落的影响, 需借助对环境胁迫更敏感的生态网络关系进行探究^[15].

图 1

Fig. 1

图 1 不同F/M条件下的微生物群落香农-维纳多样性和均匀度 Fig. 1 Shannon-Wiener diversity and evenness of microbial community at different F/M ratios

由于目前生态网络的构建主要是基于不同OTU或基因丰度间的相关性, 因此OTU在样品中的分布频率和最小相似性阈值都会直接影响生态网络中最终保留的节点个数以及生态网络的复杂度.基于此, 本研究在构建网络时每组采用统一的OTU分布频率(0.67)和最小相似性阈值(0.83)以保证不同组进行比较时的公平性.

分析不同F/M条件下的分子生态网络及对应的随机网络的主要拓扑特征后发现(表 2), 3组生态网络均具有无标度、小世界和模块化的网络特征.此外, 3组生态网络与相对应的随机网络的网络拓扑特性存在显著性差异, 表明不同F/M条件下的微生物间相互作用均是非随机的.值得注意的是, 与A、C两组相比, B组具有较多的总节点数、较大的平均聚集系数以及较小的平均路径距离, 说明F/M在0.2~0.5 kg ·(kg ·d)^-1范围内, AS微生物群落更倾向于紧密联系、共同利用物质, 提高物质的降解效率.C组虽然生物多样性和B组无显著差异, 但网络最终保留的节点却显著低于B组, 一方面说明F/M较低或较高均能影响AS微生物网络结构的拓扑性质; 另一方面则说明, 网络的节点数和复杂程度与群落多样性间并非正相关关系, 这与之前研究的结果也是一致的^[15].

表 2 (Table 2)

表 2 不同F/M的分子生态网络及对应的随机网络的主要拓扑特征 Table 2 Topological properties of the empirical MENs of microbial communities in each group and their associated random MENs 组别 F/M /kg·(kg·d)-1 实际网络 随机网络2) R2 网络节点数1) 平均路径距离 平均聚集系数 模块系数 平均路径距离±标准差 平均聚集系数±标准差 模块性值±标准差 A < 0.2 0.848 150 8.887 0.071 0.843 5.522±0.354 0.013±0.010 0.750±0.012 B 0.2~0.5 0.881 321 5.542 0.351 0.747 4.029±0.077 0.193±0.014 0.610±0.013 C >0.5 0.932 272 6.222 0.169 0.697 3.930±0.072 0.030±0.007 0.525±0.006 1)生态网络中保留的节点数目; 2)通过重置各节点的连接情况构建的100个随机网络, 其总节点数和总连接数与所对应的功能分子生态网络相同; 对应的拓扑特性为100个随机网络的平均值和标准差

表 2 不同F/M的分子生态网络及对应的随机网络的主要拓扑特征 Table 2 Topological properties of the empirical MENs of microbial communities in each group and their associated random MENs

为了更清晰直观地表示微生物间的网络关系随F/M的变化, 揭示F/M对微生物间共现关系的影响, 采用Gephi软件对各组的生态网络进行了可视化处理.数据可视化后可以看出, 在F/M较低的条件下, 微生物网络结构整体较为简单, 网络易形成包含较少节点的模块, 不同模块间的联系也较少; 随着F/M的提高, 微生物间的网络关系变得复杂, 微生物更易形成包含大量节点的复杂模块, 模块间的联系变得紧密; 但较高的F/M会降低网络结构的复杂度以及模块间的连接, 模块的规模变小, 模块间的联系也变得相对疏松(图 2).分析相关数据后发现, A组中59.1%的模块属于简单模块(包含节点个数少于5个), 最大模块仅包含21个节点, 21%的节点来自简单模块; 当F/M在适宜范围时, 简单模块的占比降低至47.6%, 仅有7%的节点来自简单模块, 最大模块包含59个节点; 当F/M继续升高, 简单模块的比例再次升高, 达到62.1%, 此时, 18%的节点来自简单模块.最新的研究表明, 网络复杂程度越高, 群落的结构和功能也越稳定^[28].因此, 适宜的F/M[0.2~0.5 kg ·(kg ·d)^-1]有利于AS群落维持其稳定的结构和功能.

图 2

Fig. 2

不同节点表示OTU, 节点间的蓝色直线表示两个OTU显著正相关, 红色直线表示两个OTU显著负相关; 网络图中不同颜色表示不同模块(不同组别的模块颜色随机), 节点数小于5的模块显示为灰色 图 2 不同F/M条件下(A~C组)微生物间的网络关系 Fig. 2 Microbial networks at different F/M ratios (Group A-Group C)

F/M能够显著影响AS微生物群落网络结构的主要原因是, 食物可利用性是生态网络的重要驱动因子^{[29, 30]}.例如, 空气中CO₂含量升高能够增加土壤的碳输入, 进而提高土壤微生物生态网络的复杂度^[31]; 植物根能够改变土壤环境同时为土壤输入大量碳, 因此, 根际微生物的网络规模以及复杂度也会显著大于空白土壤微生物群落^[15].然而, 当F/M超过适宜范围时, 过量的食物输入可能会使更适应高负荷基质的微生物大量繁殖, 由于其他资源的消耗所引入的新的选择压则可能会降低网络的规模及复杂程度.

微生物间的正负相关关系也是反映微生物网络结构的一个重要指标.结果表明, 不同F/M条件下AS微生物间的相互作用关系绝大多数为正相关(60.0% ~76.8%), 表明大多数微生物倾向于共现(co-occurrence)而非互相排斥(co-exclusion).但不同组别正相关关系的比例受到F/M的影响: F/M较低时, 网络中节点的正连接比例为71.1%; 当F/M在0.2~0.5 kg ·(kg ·d)^-1时, 微生物间的正相关关系最多(76.8%); 当F/M继续升高, 超过0.5 kg ·(kg ·d)^-1时, 正相关关系反而减少, 降至60.0%(图 3).负相关关系随F/M的变化则与之相反.可能的原因是, F/M较低时, 微生物间因为缺乏足够食物而相互竞争, 导致负相关关系的比例较高; 而F/M较高时, 产生絮体的细菌因其更适应高负荷的基质可能会大量繁殖, 从而消耗了其他资源, 如溶解氧等, 从而提高了微生物间的竞争.网络中的负相关关系越少, 则微生物间竞争、偏害共生等相互作用就越少, 越利于微生物的生存和群落的稳定性^[5].例如, 进水可生化性及污泥龄在最适宜范围时正相关关系比例最大, 较低(较短)或较高(较长)的进水可生化性及污泥龄均能导致负相关关系比例增多, 正相关关系比例下降^{[5, 32]}.这说明, F/M在0.2~0.5 kg ·(kg ·d)^-1时有助于维持微生物群落的功能和稳定性.

图 3

Fig. 3

图 3 不同F/M条件下微生物间的正负相关关系 Fig. 3 Positive and negative links between microbes at different F/M ratios

由于和其他微生物联系紧密, 群落中的关键物种可能在维持群落结构和稳定性中发挥着独特且关键的作用^{[33, 34]}, 能够驱动微生物群落的形成过程^{[35, 36]}.因此, 在上述研究基础上, 通过分析不同组别生态网络中节点(OTUs)的模块内连接度和模块间连接度, 识别出了不同F/M条件下生态网络中的关键物种.从图 4可以看出, 不同F/M组别的网络中绝大多数OTUs的模块间连接度小于0.62, 模块内的连接度小于2.5, 即大多数OTUs在模块内和模块间的连接度都不高, 属于外围节点, 同时3组均未检测到在整个网络结构中起关键作用的网络枢纽.F/M在0.2~0.5 kg ·(kg ·d)^-1时, 模块枢纽最多, 共识别出16个, 而F/M较低和较高时分别只识别出4个和6个模块枢纽.分析了这26个模块枢纽的种属信息, 结果表明这些模块枢纽来自不同的门类, 其中10个来自Proteobacteria、6个来自Bacteriodetes, 其他还包括Chloroflexi、Actinobacteria、Firmicutes和Ignavibacteriae, 表明Proteobacteria和Bacteriodetes在群落结构中发挥了更大的作用.此外, B组中有8个节点被识别为连接器, 分属于Proteobacteria、Armatimonadetes、Actinobacteria、Bacteriodetes和Chloroflexi; 而A组中未检测到连接器, 表明A组不同模块间的联系较少; C组识别到1个连接器, 该连接器来自Proteobacteria.

图 4

Fig. 4

图 4 不同F/M条件下网络节点的分类 Fig. 4 Classification of nodes within networks at different F/M ratios

有研究指出, 微生物的网络结构需要依靠一些十分活跃的OTUs进行信息交换或者产生中间代谢产物以维持庞大而复杂的模块结构, 较多的模块枢纽可以提高微生物群落的交换效率^[31].当遇到环境扰动时, 关键物种的缺失可能会损害群落的稳定性, 同时引起群落的组成和功能发生巨大改变^[34].因此, 拥有较多模块枢纽和连接器的B组微生物可能会更高效地进行物质传输和利用, 同时, 抵御环境扰动的能力也更强.

(1) 较低的F/M能够显著抑制AS微生物群落的多样性和均匀度, 但较高的F/M未对群落多样性和均匀度产生显著影响, 表明多样性指标对高F/M不敏感.

(2) 不同F/M条件下的生态网络均具有无标度, 小世界和模块化的网络特征.但较低或较高的F/M均会降低网络的规模、复杂度、正相关关系的比例以及网络中的关键物种.

(3) F/M在0.2~0.5 kg ·(kg ·d)^-1内, 生态网络具有最多的总节点数、最大的平均聚集系数以及最小的平均路径距离; 网络规模大, 网络复杂度高; 节点间的正相关关系最多; 网络拥有较多模块枢纽和连接器, 这些性质均表明此条件下AS微生物可能会更高效地进行物质传输和利用, 同时, 抵御环境扰动的能力也更强.