2022, Vol. 43
2. 华南师范大学广东省化学品污染与环境安全重点实验室&环境理论化学教育部重点实验室, 广州 510006;
3. 德累斯顿工业大学市政与环境工程学院, 德累斯顿 01069, 德国
, WANG Zhen-yu3 , GAO Quan1,2 , YANG Yuan-yuan1,2 , GAO Fang-zhou1,2 , HUA Pei1,2
, YING Guang-guo1,2
2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Chemical Pollution and Environmental Safety & Key Laboratory of Theoretical Chemistry of Environment, South China Normal University, Guangzhou 510006, China;
3. School of Civil and Environmental Engineering, Dresden University of Technology, Dresden 01069, Germany
饮用水消毒和传输过程中, 余氯会和水中多种前体物反应生成具有遗传毒性、细胞毒性、潜在致突变性和致畸性的消毒副产物(disinfection byproducts, DBPs).目前已有700种DBPs被发现.其中, 三卤甲烷(trihalomethanes, THMs)为首次发现的含碳氯化消毒副产物, 已被列入受控清单; 亚硝胺是一类非卤代含氮DBPs, 因其致癌风险高而备受关注[1].DBPs前体物包括天然有机质、管壁生物膜分泌的胞外聚合物和水厂未完全去除的微污染物如抗生素等[2~4].因此, DBPs生成潜能受控于前体物特征, 包括天然有机质性质、微生物群落结构和抗生素赋存水平[5, 6].与此同时, DBPs生成还受到管网环境因素, 如pH和温度等影响[7].
近年来, 研究热点逐步从DBPs与单一水质指标或环境因素的相关性分析深入至与多水质指标的因果关系分析.以管网抗生素为例, 磺胺嘧啶和环丙沙星的加入使管网出水中总细菌和Mycobacteria avium增加, 造成具有抗药性的微生物分泌更多的胞外聚合物[8], 最终促进DBPs生成; 即通过微生物, 形成了抗生素与DBPs的因果链条.抗生素浓度变化还可能导致生物膜群落结构发生变化, 使得具有较强抗生素耐药性的微生物成为主导菌种[9], 进而改变胞外聚合物的组分并最终影响DBPs的生成种类.有研究发现, Pseudomonas putida和Pseudomonas aeruginosa的胞外聚合物主要成分分别为蛋白质和聚多糖[10, 11].由于蛋白质较多糖更易生成卤乙酸, 因此P. putida胞外聚合物的卤乙酸生成势高于P. aeruginosa[12].由此可见, 抗生素-微生物-DBPs间不仅相互关联, 还可形成具有一定逻辑关系的网络结构.由于实验研究难以厘清上述结构, 因此亟需更加灵活和精确的方法来描述DBPs与各水质指标的因果关系.
贝叶斯因果概率推理模型, 可以在复杂的关系网络中, 基于算法评估各输入因素的不确定性[13], 推理出局部因素的相互关联和整体网络的层次关系[14, 15]; 可以快速有效地建立含有大量输入参数的复杂网络系统, 并将关系网络的逻辑性可视化[16].目前已有研究将贝叶斯网络应用于环境科学研究[17~19].尽管如此, Aguilera等[20]的研究认为贝叶斯网络在解决环境类问题上的应用还不够充分, 在给水管网水质分析中的应用潜力还有待开发.Li等[7]通过大量文献调研进一步指出, 给水管网中的环境因素、微生物指标和DBPs赋存水平间存在复杂关系网, 贝叶斯网络是适合梳理该网络中因果关系的模型工具.综上, 本研究选择三卤甲烷和亚硝胺为目标DBPs, 构建管网基本水质参数、抗生素浓度和微生物群落结构的4层贝叶斯网络, 依靠模型解析影响DBPs生成的主控因子, 以期为给水管网的优化运行提供科学依据和理论支持, 对保障用户健康具有十分重要的现实意义.
1 材料与方法 1.1 样品采集本研究选取广州市大学城某高校的给水管网为研究对象, 依据均匀布点原则进行水样采集和检测.研究区域内共设置7个采样点, 其中4个采样点位于教学区内, 3个采样点位于生活区内.教学区采样点为泵房、教学楼一栋(教一)、教学楼六栋(教六)和理学楼三栋(理三); 生活区采样点为北区超市(北超)、南区食堂(南食)和南宿舍八栋(南八).校区总面积约1 km2(约1 500亩), 教学区管网总长7.5 km, 生活区管网总长6.3 km.
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图 1 给水管网采样点分布示意 Fig. 1 Distribution map of sampling sites in the study area |
采样时间为2021年1~2月, 所有采样点均未配置终端净水装置.采样前, 打开水阀5 min以上至水温恒定.抗生素水样采集储存于1 L棕色玻璃瓶中, 并加入50 mL甲醇和0.4 mL 4 mol ·L-1硫酸/水溶液.亚硝胺水样采集储存于2 L棕色玻璃瓶中, 加入适量碳酸氢钠调节pH=8.三卤甲烷水样采集储存于40 mL玻璃瓶中, 装流溢满, 加入15 mg无水硫代硫酸钠.上述指标均设置3个平行和质控样.采集15 L水样于70%乙醇消毒的聚丙烯塑料采样桶中, 用于微生物水样处理.抗生素和DBPs水样于4℃保存, 并在48 h内进行前处理.微生物样品采集后送至实验室及时处理.常规水质参数如溶解氧、电导率、水温和pH等通过便携式水质检测仪(HACH HQ30D)现场测定.余氯和总氯使用便携式分光光度计(HACH DR900)现场检测.
1.2 化学试剂抗生素内标磺胺甲唑-D4、红霉素-13C-D3、噻苯咪唑-D4、环丙沙星-D8、甲氧苄啶-D3和林可霉素-D3购自Toronto Research Chemicals公司(加拿大), 磺胺甲基嘧啶-D4购自Dr.Ehrenstorfer公司(德国), 磺胺二甲嘧啶-13 C6购自Cambridge Isotope Laboratories公司(美国), 甲氯环素购自Sigma-Aldrich公司(美国); 亚硝胺替代物N-亚硝基二甲胺-D6(NDMA-D6, 1 000 μg ·mL-1)和内标N-亚硝基正丙胺-D14(NDPA-D14, 1 000 μg ·mL-1)购自Accustandard公司(美国); 乙二胺四乙酸四钠(AR, 纯度>99%)和甲醇(AR, 纯度>99.5%)购自天津大茂试剂公司; 硫酸(AR, 纯度>95%)购自广州化学试剂公司; 无水硫代硫酸钠(纯度>99%)和碳酸氢钠(ACS)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 乙酸乙酯(HPLC)、二氯甲烷(HPLC)、甲酸(HPLC)和甲醇(HPLC)购自Merck公司(德国); 正己烷(HPLC)购自CNW公司(德国); 超纯水使用MilliQ超纯水系统生产(德国Merck Millipore公司).甲醇(AR)仅用于样品采集, 样品前处理和上机检测使用甲醇(HPLC).
1.3 测试方法抗生素和亚硝胺检测均采用固相萃取法对样品进行前处理[21].抗生素水样中加入0.5 g乙二胺四乙酸四钠和100 μL 1 mg ·L-1混合内标; 依次通过10 mL甲醇和10 mL超纯水活化Oasis HLB小柱(6 mL, 200 mg); 以5~10 mL ·min-1流速加载水样; 上样结束后, 额外加入2次25 mL 5% 甲醇/水溶液于样品瓶中润洗, 并过柱; 然后加入10 mL超纯水于小柱中, 洗去残留的乙二胺四乙酸四钠; 真空抽干小柱中残留水分; 完成后向小柱内依次加入3 mL二氯甲烷, 4 mL乙酸乙酯和5 mL甲醇洗脱; 氮气吹干洗脱液, 并用0.22 μm聚醚砜滤膜以1 mL甲醇定容于棕色进样小瓶用于上机检测.
亚硝胺前处理方法参考US EPA521方法[22]进行改进.水样中加入50 μL 200 μg ·L-1 NDMA-D6替代物; 依次通过10 mL正己烷、10 mL二氯甲烷、12 mL甲醇和12 mL超纯水活化冲洗椰子壳活性炭小柱(CNWBOND Coconut Charcoal, 6 mL, 2 g, 80~120目); 以15 mL ·min-1流速加载水样; 上样结束后加入10 mL二氯甲烷用于洗脱柱上富集的亚硝胺物质; 洗脱液中加入400 μL超纯水混合; 氮气洗脱液至400 μL后加入100 μL超纯水定容, 过0.22 μm聚四氟乙烯滤膜后加入25 μL 1 mg ·L-1内标NDPA-D14, 最后保存于棕色进样小瓶.
抗生素和亚硝胺检测采用ACQUITY超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱联用仪(ACQUITY UPLC I-Class-Xevo TQ-S micro, 美国Waters公司).抗生素检测色谱柱选用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm); 流动相为0.1%甲酸水A和甲醇B, 流速为0.3 mL ·min-1; 梯度洗脱, 即0~0.5 min为80% A, 0.5~6 min为0% A, 6~6.5 min为80% A; 柱温为40℃; 样品室温度为10℃; 进样量为5 μL.质谱采用电子轰击源负离子模式(ESI-)进行检测, 离子源温度为150℃, 脱溶剂温度为400℃, 脱溶剂气流速为800 L ·h-1, 毛细管电压为3.5 kV, 碰撞气体为高纯氩气.
亚硝胺检测色谱柱选用Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm); 流动相为0.1%甲酸水A和甲醇B, 流速为0.4 mL ·min-1; 梯度洗脱, 即0~1 min为90% A, 1~3 min为88% A, 3~9 min为10% A, 9~11 min为95% A.质谱采用电子轰击源正离子模式(ESI+)进行检测; 其他条件与抗生素质谱条件相同.
三卤甲烷检测采用吹扫捕集-气相色谱质谱联用仪(P&T-GC 7890A-MS 7000, 美国Aglient公司).吹扫流量为40 mL ·min-1; 吹扫温度为20℃, 吹扫11 min; 解析温度为220℃, 解析2 min; 烘烤温度为260℃, 烘烤2 min.色谱条件为毛细管色谱柱HP-5UIms(30 m×250 μm×0.25 μm), 进样口温度为220℃, 分流比为20 ∶1; 程序升温设置为: 35℃保持5 min, 然后以6 ℃ ·min-1的速度升至100℃, 再以20 ℃ ·min-1的速度升至210℃保持1 min.质谱采用EI源, 离子源温度为230℃, 传输线温度为260℃, 溶剂延迟2 min.
1.4 微生物高通量测序微生物水样富集于孔径为0.22 μm的水相滤膜, 滤膜放置于2 mL无菌离心管中, 避光保存于-80℃, 送至上海美吉生物医药科技有限公司进行微生物PCR扩增和高通量测序.扩增引物为: 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′), 扩增区间为V3~V4可变区.PCR扩增产物在Illumina-MiSeq平台进行测序.
1.5 贝叶斯网络利用贝叶斯网络对多水质指标相关性建立有向层次网络结构.贝叶斯网络是一种用于因果概率推理的有向概率图模型, 模型通过有向无环图定性和条件概率分布定量.有向图由含有随机变量的节点和表示节点间的概率相依性的有向边组成.有向边的尾部定义为父节点, 而头部为子节点.每个子节点Xi使用条件概率分布来列出其相对于父节点Xi1, …, Xini的所有可能的条件概率.对于离散变量使用条件概率表来表示条件概率分布, 而连续变量子节点则使用线性高斯模型函数计算见式(1).
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(1) |
式中, bni为Xi对第ni个父节点的回归系数, s为标准差.贝叶斯网络定义了从全体节点的联合概率分布或全局概率分布到每个节点间的局部概率分布的因子化过程.因子化由马尔科夫性质表示, 即每个子节点的概率只依赖于父节点, 关系式见式(2)和式(3):
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(2) |
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(3) |
式中, P和f分别为离散变量和连续变量概率分布; π(Xi)是节点Xi的父节点集合, 若节点Xi没有父节点, 则π(Xi)=P(Xi)或f(Xi); P[Xi π(Xi)]或f[Xiπ(Xi)]是父子节点间的局部概率.
本研究首先通过相关性分析和文献信息确定贝叶斯网络基本结构, 然后利用结构学习算法获得最优网络结构, 并建立最终的贝叶斯网络结构.结构学习算法选用的tabu搜索算法; 该算法是一种评分类亚启发式随机算法[23], 相较于其他算法, 如约束类或评分-约束混合类算法, 在贝叶斯网络结构建立的准确度和速度方面具有显著优势[24].
1.6 数据处理抗生素和亚硝胺数据利用Masslynx软件进行处理.三卤甲烷质谱数据通过MassHunter软件进行处理.采用Excel 2010和Origin 2018软件进行数据分析.ANOVA TEST(α=0.05)通过IBM SPSS Statistics 25软件计算.应用Chao指数、Shannon指数和覆盖率进行微生物α多样性分析.利用上海美吉生物医药科技有限公司信息平台, 采用Bray-Curtis距离算法, 以样品平均层级聚类方法对微生物群落相对丰度进行聚类分析.相关性分析和贝叶斯网络构建及分析使用R-4.0.6进行编译计算.相关性分析利用Pearson相关系数衡量基本水质参数、抗生素、三卤甲烷和亚硝胺间相关性; 采用Mantel检验计算各微生物群落矩阵与各基本水质参数和微污染物之间的相关性.
2 结果与讨论 2.1 给水管网水质参数、抗生素和DBPs分布特征给水管网水样为弱碱性(pH 7.88~8.01), 各采样点水温稳定在14.6~15.9℃之间, ρ(溶解氧)范围为9.82~10.01 mg ·L-1, 电导率范围327~332 μS ·cm-1. ρ(余氯)和ρ(总氯)在泵房最高, 分别为0.61 mg ·L-1和0.72 mg ·L-1.生活区管网pH略高于教学区, 其他基本水质参数在教学区和生活区未见明显差异(ANOVA TEST, P>0.05), 如表 1所示.
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表 1 给水管网各采样点基本水质参数 Table 1 Primary water quality parameters of the drinking water in each sampling site |
饮用水样品中共检出23种抗生素.由图 2可见, 检出ρ(抗生素)为47.92~210.33 ng ·L-1.其中以氯四环素和甲烯土霉素为主的四环素类抗生素, 占总抗生素质量浓度的68.6% ~85.6%.氟喹诺酮类和磺胺类抗生素分别占1.6% ~5.6%和0.1% ~12.6%.检测出的氟喹诺酮类主要有培氟沙星和达诺沙星等, 而磺胺类抗生素主要为磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶等.以脱水红霉素和罗红霉素为主的大环内酯类占1.0% ~12.8%.除四环素类抗生素外, 其它各类抗生素质量浓度略低于国内饮用水抗生素水平[25].抗生素在教学区和生活区间未发现显著性差异(P>0.05).
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图 2 给水管网末端出水中抗生素的空间质量浓度分布 Fig. 2 Spatial distribution of the antibiotics mass concentrations in the drinking water distribution system |
对饮用水中4种三卤甲烷和9种亚硝胺进行检测, 其中三卤甲烷类DBPs包括三氯甲烷(trichlormethane, TCM)、二氯一溴甲烷(bromodichloromethane, BDCM)、一氯二溴甲烷(dibromochloromethane, DBCM)和三溴甲烷(tribromomethane, TBM); 亚硝胺包括N-亚硝基甲基乙基胺(N-nitrosomethylamine, NMEA)、N-亚硝基二甲胺(N-nitrosodimethylamine, NDMA)、N-亚硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine, NPYR)、N-亚硝基二乙胺(N-nitrosodiethylamine, NDEA)、N-亚硝基二正丙胺(N-nitrosodi-n-propylamine, NDPA)、N-亚硝基哌啶(N-nitrosopiperidine, NPIP)、N-亚硝基二正丁胺(N-nitrosodi-n-butylamine, NDBA)、N-亚硝基吗啉(N-nitrosomorpholine, NMOR)和N-亚硝基二苯胺(N-nitrosodiphenylamine, NDPhA).除TBM、NDEA、NDPA和NDBA外, 其他物质均有检出.
如图 3所示, 三卤甲烷质量浓度高于亚硝胺质量浓度. ρ(TCM)、ρ(BDCM)和ρ(DBCM)平均值分别为(15.97±3.40)、(6.71±1.40)和(1.96±0.36) μg ·L-1, 均未超过国家标准限值[26].此外, 亚硝胺中ρ(NDMA)最高, 为(22.20±13.24)ng ·L-1, 紧随之后的是ρ(NMEA)[(2.94±1.78)ng ·L-1]、ρ(NPIP)[(0.98±0.60)ng ·L-1]、ρ(NMOR)[(0.78±0.33)ng ·L-1]和ρ(NPYR) [(0.50±0.17)ng ·L-1].所有样品中ρ(NDPhA)均小于0.10 ng ·L-1.本研究区域亚硝胺平均质量浓度与我国某中部城市饮用水中实测亚硝胺浓度[27]相当.在空间分布上, 教学区内三卤甲烷平均质量浓度较高, 而亚硝胺相反, 但空间差异性不显著(ANOVA TEST, P>0.05).DBPs在两区域内的浓度变化可能由生活区和教学区的用水量和水力停留时间差异造成[28].
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图 3 给水管网末端出水中三卤甲烷和亚硝胺的空间质量浓度分布 Fig. 3 Spatial distribution of the trihalomethane and nitrosamine mass concentrations in the drinking water distribution system |
根据给水管网微生物群落的α多样性分析(表 2), 泵房的Chao和Shannon指数普遍很高, 说明管网集中流动区域具有较高的微生物群落复杂度和群落稳定度.空间分布上, 教学区的Shannon指数基本高于生活区, 反映教学区管网中微生物具有更高的群落多样性.
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表 2 给水管网各采样点α多样性指数 Table 2 The α diversity index for the drinking water in each sampling point |
调查区内共发现236种细菌物种(OTU), 其中泵房、教学区和生活区共有OTU 97种, 采样点间共有OTU为30种.如图 4(a)所示, 在微生物的门分类水平上, Proteobacteria为所有样品中最主要的菌门, 占86.6% ~97.4%, 这与已报道的给水管网微生物多样性研究结论相同[8, 29].此外, 管网中含有较多的Cyanobacteria(1.9% ~12.6%)、Actinobacteriota(0.3% ~3.9%)和Firmicutes(0.1% ~1.0%).在Proteobacteria中Rhizobiales、Caulobacterales和Sphingomonadales为优势菌目[图 4(b)], 而Cyanobacteria的优势菌目为Obscuribacterales. 所有样品中, Rhizobiales相对丰度最高(58.2% ~85.3%), 在空间分布上, Rhizobiales在生活区的相对丰度要高于教学区.Caulobacterales发现在教学区的相对丰度为9.5% ~34.9%, 高于生活区(2.2% ~14.4%).通过图 4(c)层级聚类分析结果可见, 微生物群落相对丰度在教学区和生活区具有差异性, 但整体微生物群落结构分布的差异性变化较小.
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图 4 门和目水平上的微生物相对丰度和微生物群落的层级聚类分析 Fig. 4 Relative abundance of the microbial phyla and orders with Bray-Curtis distancing cluster analysis of microbial community in drinking water distribution systems of the study area |
构建贝叶斯网络需首先通过Pearson相关性分析和文献信息确定基础网络.如图 5(a)所示, 四环素类抗生素与余(总)氯正相关, 与三卤甲烷显著负相关(P < 0.05).左下角连线图为微生物群落与抗生素、基本水质参数的距离矩阵Mantel相关性检验.结果显示Caulobacterales与氟喹诺酮类和磺胺类抗生素有显著相关性(P < 0.05).基于Pearson相关性分析和Mantel检验, 利用tabu网络结构学习算法寻找最优贝叶斯网络结构, 完善多层关联性信息.考虑到基本水质参数在样品间的差异性较小, 除余(总)氯外, 贝叶斯网络将忽略其他基本水质参数如pH, 水温等环境因素关联性.图 5(b)显示了以DBPs作为目标的贝叶斯网络结构.网络分成了4层, 分别为实测余(总)氯质量浓度(第一层)、抗生素质量浓度(第二层)、微生物群落丰度(第三层)和DBPs质量浓度(第四层).
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图 5 给水管网目水平上的消毒副产物、微生物目水平丰度、抗生素和管网基本水质参数的相关性分析和贝叶斯网络 Fig. 5 Correlation analysis and Bayesian network structure corresponding to DBPs, abundance of the microbial orders, antibiotics, and basic water quality parameters |
第一层贝叶斯网络提示, 余氯与三卤甲烷和四环素类抗生素关联, 与实验结论一致, 即氯四环素容易发生氯化反应并生成三氯甲烷[30, 31].此外, 余氯仅与三卤甲烷关联, 与亚硝胺无关联, 符合基于实验得出的亚硝胺与余氯投加量无相关性的结论[32].第二层网络显示, 磺胺类和大环内酯类抗生素均与三卤甲烷直接相关.这一结果已得到多项实验研究证实, 即大环内酯类和磺胺类等抗生素会与氯消毒剂发生氧化还原反应, 产生大量DBPs[33, 34].其中磺胺类抗生素含有靠近苯环的氧、氮类基团, 具有较强的氯反应活性, 因此更容易生成三卤甲烷等DBPs[35].贝叶斯网络还发现四环素类抗生素与亚硝胺具有关联性.前期调查发现, 四环素在氯和氯胺化条件下是亚硝胺的潜在前体物[3, 36].需要指出的是, 给水管网中抗生素的质量浓度较低(处于ng ·L-1水平), 而且四环素类抗生素的亚硝胺转化率和磺胺类抗生素的三氯甲烷转化率分别约为1%和6%[3, 5], 这说明给水管网中抗生素氯化产生的DBPs质量浓度有限, 仅是给水管网中DBPs生成的因素之一.
抗生素不仅是DBPs前体物, 而且会选择性抑制微生物菌群, 改变微生物群落在管网饮用水中的结构分布[37].贝叶斯网络发现了抗生素与Caulobacterales和Corynebacteriales丰度间的关联性.值得注意的是, 采样点余氯变化波动小且并未发现与微生物丰度有关联, 说明余氯在给水管网中的空间差异性对微生物群落组成的影响有限.
除了抗生素以外, 微生物有机质也是DBPs的重要前体物之一.微生物胞外聚合物中的色氨酸类物质被发现与多种DBPs具有很显著的正相关性(Rmin2≥0.76, P < 0.05)[38].微生物有机质会受到微生物群落结构影响, 因此微生物群落丰度会间接与DBPs关联.第三层贝叶斯网络发现Caulobacterales和Obscuribacterales与亚硝胺具有相关性; Corynebacteriales与三卤甲烷显著相关.有研究证实[29, 39], 以Caulobacterales为代表的Proteobacteria和以Corynebacteriales为代表的Actinobacteria是建立管网生物膜结构并影响胞外聚合物的化学组分的重要菌种.其次, Obscuribacterales作为蓝藻菌门微生物, 会产生胞内和胞外藻类有机物, 是水环境中重要的DBPs前体物[40].由于微生物结构组成复杂, 通过贝叶斯网络挖掘管壁生物膜中重点菌群, 可为进一步分析管网生物膜对DBPs生成贡献提供参考.
3 结论(1) 给水管网中三卤甲烷、亚硝胺、抗生素质量浓度空间上未发现明显差异. ρ(三卤甲烷)、ρ(亚硝胺)和ρ(抗生素)分别为18.33~32.09 μg ·L-1、13.08~53.50 ng ·L-1和47.92~210.33 ng ·L-1.
(2) Rhizobiales和Caulobacterales为调查区域给水管网的优势菌目.由于管网的水力条件变化, 微生物群落丰度具有空间分布差异性.
(3) 基本水质参数、抗生素质量浓度、微生物群落组成和DBPs质量浓度之间具有层次、有向性的网络结构.四环素类、磺胺类和大环内酯类抗生素与三卤甲烷相关, 氟喹诺酮与亚硝胺相关.Caulobacterales和Corynebacteriales丰度均受抗生素赋存水平影响.同时, Caulobacterales和Obscuribacterales与亚硝胺生成相关, Corynebacteriales与三卤甲烷生成显著相关.
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