2022, Vol. 43
2. 河海大学环境学院, 南京 210098
2. College of Environment, Hohai University, Nanjing 210098, China
据文献[1]的报道, 2016年全球进入水生生态系统的塑料废物约为19~23 Mt, 占废物总量的11%.据此预测, 如果废物产生趋势不变且没有改善管理措施, 到2030年进入世界水生生态系统的塑料废物量将达到90 Mt·a-1.这些进入水体中的塑料在光照、化学氧化以及微生物分解等作用下被逐渐分解为粒径小于5 mm的微塑料(microplastics, MPs)[2].在我国, 微塑料污染极为严重, 河口海岸和长江人口密集流域的水样中MPs浓度甚至达到了发达国家的30~50倍[3].在现有研究中, 水体中最常检测到的MPs之一是聚苯乙烯(polystyrene, PS)[4, 5].PS由于其耐化学腐蚀性和透明度, 在包装和技术项目中具有广泛的适用性, 因而在工业中广泛使用.
生物膜是环境中微生物最普遍的一种存在形式[6].生物膜的形成是一个多步骤过程[7], 微生物从浮游生长模式转变为固着生长模式[8].与游离态细胞相比, 生物膜具有稳定的三维结构[9], 这是因为生物膜不是通过细胞简单聚集而形成的, 在生物膜中存在大量胞外物质, 即胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS).EPS可以为包裹在生物膜内的细胞提供营养、抵御外界环境变化, 也可以作为细胞的外部消化系统, 增强细胞的代谢能力.对大多数细菌而言, 生物膜的形成可使自身在环境中占据有利生态位, 从而有利于自身的生存发展[6].在EPS内, 蛋白质、多糖、DNA、RNA和脂质等大小分子物质同时存在, 其中多糖和蛋白质是大多数细菌生物膜EPS的主要成分[10].MPs上微生物组成丰富, 存在真菌、细菌和藻类等多种微生物, 其中细菌为优势物种[11].MPs上微生物源于周围环境, 但群落结构却与周围环境或者其他介质上的大不相同[12~14].据文献[15]报道, MPs由于对特定生物类群具有潜在的代谢适应性, 能够提供特殊的生态位, 如变形菌、拟杆菌、厚壁菌和蓝细菌的某些细菌类群.在我国长江口采集的微塑料上也发现变形杆菌为主要的优势菌属[16].
MPs为微生物提供了生存空间的同时, 也可能对生物膜产生负面影响.据文献[17]报道, MPs会对微生物的生长发育、EPS分泌、活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS) 生成和酶活性产生影响.且随着粒径的减小, 环境中MPs的数量明显增多[18], 生物膜受MPs的影响也更加明显[19].目前关于MPs对生物膜群落的影响信息较少, 主要集中在对天然生物膜群落的研究.但天然生物膜在培养过程中存在暴露在微塑料中的风险, 且研究往往选取成熟生物膜而忽略了MPs对生物膜发育阶段的形态和形成的影响.
为了解微塑料对细菌生物膜发育的影响, 本文以变形杆菌生物膜为研究对象, 微塑料选择数量和赋存最广泛的1 μm聚苯乙烯微塑料(PS-MPs), 通过对细胞生长、生物膜发育、EPS成分和胞外酶活性分析深入探究1 μm PS-MPs对生物膜发育的影响.
1 材料与方法 1.1 实验材料变形杆菌冻干粉(BNCC-107965) 购自北京北纳创联生物技术研究院.
1 μm聚苯乙烯微球(乳白色悬浮液, 10 g·L-1) 购于天津倍思乐色谱技术开发中心.PS原液中含0.25%的十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS; 防止颗粒聚集的表面活性剂).
1.2 实验方法 1.2.1 菌株和生物膜培养细菌冻干粉活化后接种在牛肉膏蛋白胨液体培养基中, 在26℃的黑暗环境下培养12 h. 4℃, 5 000 r·min-1条件下离心15 min将细菌细胞与培养基分离, 细胞用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline, PBS; pH 7.2) 冲洗两次以去除残留的培养基, 最终重悬于0.85%的生理盐水中[20], 细胞密度约为108 CFU·mL-1.在无菌、未经处理的12孔板各孔加入2 000 μL培养基和20 μL菌液, 每板A行不加入菌液作为该板的空白对照.将12孔板在26℃黑暗培养箱中培养0~72 h, 观察生物膜生长情况.
1.2.2 暴露实验依据文献[19]的方法对PS原液进行透析处理去除SDS后, 用无菌培养基稀释得到不同浓度的PS悬液.每次使用前超声30 min (100 W) 使MPs均匀分散在体系中.
取不同发育阶段的生物膜孔板, 用PBS洗涤微孔3次后, 在各孔中按组别加入0.1、10、30和40 mg·L-1不同浓度微塑料培养液, 继续将微孔板在26℃黑暗培养箱中培养24 h, 观察MPs对生物膜不同阶段发育的影响.
1.2.3 生物量测定将待测孔用PBS洗涤3次后加入2 000 μL 0.1%结晶紫溶液染色20 min, 再次用PBS冲洗3次.最后加入1 600 μL 33%的冰醋酸溶解染料, 使用酶标仪(Infinite 200 PRO NanoQuant, TECAN) 测量540 nm下的光密度(D540).用含菌微孔的读数减去空白孔读数平均值来表示生物膜发育情况, 即微量滴度板壁上的生物膜中细胞的总量.绘制生长曲线将生物膜发育分为5个阶段[21].
1.2.4 胞外聚合物分析EPS的提取方法采用乙二胺四乙酸(EDTA) 法[22].由于细菌生物膜EPS 75%~90%的成分为蛋白质和多糖[10], 本研究仅测定EPS中的蛋白质和多糖含量及其比例变化来探究变形杆菌生物膜对微塑料的应激反应.
蛋白质的测定采用南京建成生物工程研究所提供的基于考马斯亮蓝法的微板蛋白测定试剂盒; 多糖的测定采用苯酚-硫酸法[23, 24].
1.2.5 氧化应激程度测定微生物在生命过程中会不断产生ROS, 同时又形成一个清除ROS的防御系统, 包括酶促系统和非酶促系统, 使生物膜内ROS的产生与清除之间维持在一个动态平衡状态[25, 26].酶促系统包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等; 非酶促系统包括谷胱甘肽和抗坏血酸等.总抗氧化能力(total antioxidative capacity, T-AOC) 是一个用于衡量抗氧化系统功能状况的综合性指标[27].乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH) 是一种在氧化应激条件下容易变性的线粒体酶, 胞外LDH水平是细胞膜完整性的一个指标[28].本文选择ROS、T-AOC和LDH水平作为氧化应激程度的评判指标, 测定采用南京建城生物研究所的试剂盒.
1.2.6 统计分析所有实验重复3次, 数据以平均标准偏差表示.生化测量的数据被转换成与对照组的百分比形式以便比较.在Origin 2018版本中, 使用单因素方差分析(one-way ANOVA)和事后LSD检验分析了各组的显著性差异(P＜0.05).
2 结果与讨论 2.1 生物膜不同发育阶段细菌在生物膜中的共生作用增强了它们的生存能力和获得营养物质的能力.生物膜发育过程包括: ①可逆附着到表面; ②不可逆附着; ③通过细胞外基质产生形成微菌落; ④形成成熟的三维生物膜结构; ⑤成熟的生物膜分解这5个阶段[29].
图 1是变形杆菌生物膜的生长曲线, 其中, 生物膜在0~4 h生物量几乎为0, 处于生物膜初始附着阶段, 这个过程是可逆和动态的[30]; 4~12 h生物量有少量增长, 处于不可逆附着阶段, 这个阶段细菌借助鞭毛和菌毛等物理附属物抵御剪切排斥力并保持与表面的强相互作用[31]; 12~36 h生物膜的生物量快速增长并达到最大值, 生物膜进入生长期, 在这个阶段生物膜变成多层, 厚度也明显增加; 36~60 h生物膜生物量较为稳定, 这说明生物膜进入成熟阶段, 这个阶段生物膜发展三维结构, 并建立异质环境, 对外界环境的耐受能力最强[32]; 随着养分的耗竭以及有害物质的积累, 生物膜进入衰落阶段(60 h以后).
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图 1 变形杆菌生物膜生长曲线 Fig. 1 Growth curve of Proteus biofilm |
本实验依据变形杆菌生物膜生长曲线, 选取培养了2、8、24和48 h的生物膜代表其发育的可逆附着期、不可逆附着期、生长期和成熟期, 并对这些发育阶段的生物膜进行进一步的微塑料暴露实验.
2.2 生物量的变化将处于不同发育阶段的生物膜暴露在不同浓度PS-MPs中24 h, 其生物量变化情况如图 2所示.与对照组[ρ(MPs)为0 mg·L-1]相比, ρ(MPs)为0.1~30 mg·L-1时, 各阶段的生物膜生物量均有增加, 其中ρ(MPs)为10 mg·L-1时, 生物量增量最大, 分别为对照组的(46.67±12.12)%、(49.18±13.66)%、(16.55±4.27)%和(17.84±3.81)%.说明ρ(MPs)≤30 mg·L-1时, 对变形杆菌增殖和生物膜发育起促进作用.当ρ(MPs)为40 mg·L-1时对生物膜前3个阶段的发育起抑制作用, 生长抑制率分别为(20.61±10.91)%、(16.39±6.39)%和(2.73±5.28)%, 但对于成熟期生物膜, MPs仍起到了一定的促进作用, 增量为(8.69±4.57)%.同时, 从图 2可以发现, 生物膜越成熟, 变化率波动越小, 受环境的影响越小.
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图 2 变形杆菌不同阶段生物膜在不同浓度PS-MPs中暴露24 h后生物膜发育情况 Fig. 2 Biofilm development of different stages of Proteus biofilms exposed to different concentrations of PS-MPs for 24 hours |
在ρ(MPs)≤30 mg·L-1时, 各阶段生物膜生物量均升高, 可能是因为微塑料并非剧毒物质[33], 低浓度和小粒径的MPs反而为变形杆菌的定植提供了极大的定植表面[20], 从而生物量随MPs浓度的增加而上升.当ρ(MPs)≥40 mg·L-1时生物膜发育受到抑制, 可能是生物膜内活性氧失衡或营养循环受到影响, 本文将进行深入研究.
2.3 氧化应激反应程度的变化有研究表明, 纳米粒子(如PS-NPs、TiO2和Fe2O3) 对微生物的毒性主要归因于氧化损伤[34].本实验中1 μm PS-MPs对普通变形杆菌生物膜也表现出了与纳米粒子相似的毒性.从图 3中可以发现, ROS、T-AOC和LDH水平的变化呈现一致性, 即随着MPs浓度的上升而上升.且生物膜发育越成熟, 受MPs的影响越小.
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不同小写字母表示不同PS浓度下的显著差异(P < 0.05),下同 图 3 不同PS-MPs浓度下不同阶段生物膜的相对氧化应激反应水平 Fig. 3 Relative oxidative stress response levels of biofilms at different stages under different PS-MPs concentrations |
氧化应激反应程度分为3类: 抗氧化反应、氧化抑制和抗氧化失活[35], 当ρ(PS-MPs)为0.1~30 mg·L-1时, T-AOC的水平均随ROS的升高而升高, 生物量相较对照组也有增长, 表明PS-MPs在实验期间并没有破坏微生物抗氧化系统, 氧化应激水平相对较低[36], 也说明在此浓度下MPs对普通变形杆菌各阶段生物膜仅有低毒性.在这一阶段, ROS可以通过酶和非酶的作用来减轻, 保护生物膜中的细胞免受氧化应激[37]. ρ(MPs)＞10 mg·L-1时, 生物膜生物量逐渐减少, 可能是因为累积的ROS使呼吸系统损伤, 坏死细胞增多, 减缓了生物膜发育. ρ(MPs)＞40mg·L-1时, ROS的持续积累可能破坏了抗氧化防御系统, 导致氧化抑制, 从而导致细胞死亡, 生物膜发育受到抑制[38].
2.4 胞外聚合物组分的变化除了抗氧化作用的响应机制外, 也可以通过EPS的2种主要成分, 即蛋白质和多糖, 与自由基发生反应保护膜内微生物[39].图 4所示为生物膜各阶段EPS主要成分的变化.与对照组相比, ρ(MPs)为0.1~10 mg·L-1时, EPS中蛋白含量明显上升; 当ρ(MPs)＞30 mg·L-1时, 附着期生物膜EPS中蛋白质含量明显减少, 而多糖含量在各组中基本不变, 在ρ(MPs)为40 mg·L-1时附着期生物膜EPS中多糖含量明显上升.
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图 4 不同PS-MPs浓度下各阶段生物膜EPS组分变化 Fig. 4 Changes in biofilm matrix secreted by biofilms at different stages under different PS-MPs concentrations |
根据文献[39]的报道, 微生物暴露在MPs中时, 会改变自身分泌的EPS组成来积极应对环境压力.而蛋白质可以提高生物膜表面的疏水性和黏性来加速微生物的聚集和定植, 也可以增厚细菌自身细胞壁, 提高个体在环境中的存活能力抵御环境危害[40].本实验中ρ(MPs)为0.1~10 mg·L-1时变形杆菌很可能释放了富含蛋白质的EPS, 减轻氧化应激反应, 物理阻断危险性物质.当ρ(MPs)为30 mg·L-1时, 变形杆菌氧化应激反应增强, ROS与蛋白发生反应, 导致蛋白含量减小, 细菌形态和聚集能力都被抑制, 也解释了生物膜发育抑制现象.EPS中多糖可以保护膜内细胞免受外部侵害, 并作为各种小分子扩散的屏障[41].本实验中各阶段生物膜多糖含量在暴露后基本不变, 说明微塑料对多糖的影响不显著, 而附着期多糖含量的上升尚无法解释.相同暴露浓度下, 生物膜成熟度越高所受到的影响越小.成熟期生物膜的EPS受PS-MPs的影响明显减少.说明生物膜形成初期较为脆弱, 成熟生物膜对MPs有更强的抗性[42].
2.5 胞外酶活性的变化EPS中的蛋白质包括酶蛋白和非酶蛋白.酶蛋白可以将溶解的高分子量化合物水解成更小的生物分子, 只有这些物质才会被微生物吸收.本研究选取了3种对营养循环起重要作用的水解酶[β-葡萄糖苷酶(β-d-glucosidase, GLU; 碳循环)、亮氨酸氨基肽酶(leucine arylamidase, LAP; 氮循环)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP; 磷循环)]进行进一步探究.
2.5.1 β-葡萄糖苷酶GLU可以降解多糖, 并通过碳水化合物结合蛋白将复合物定位到纤维素表面和细胞膜上[43].各阶段生物膜GLU相对活性如图 5所示, 在生物膜成熟期GLU活性较对照组的变化较小, 但在附着期GLU随浓度升高活性受到了明显的抑制.GLU活性随暴露浓度的升高而降低, 生物膜发育越成熟受到的影响越小.而在ρ(MPs)为40 mg·L-1时附着期生物膜中多糖含量有上升情况, 结合GLU活性明显降低的情况, 猜测是由于细胞死亡破裂离开细胞外基质所导致[44].
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图 5 不同PS-MPs浓度下各阶段生物膜GLU的相对活性 Fig. 5 Relative activity of GLU in biofilms at different growth stages under different PS-MPs concentrations |
LAP是一种金属肽酶, 它将蛋白质和肽的n端残基裂解, 在肽循环中起关键作用[45].LAP相对活性如图 6所示, LAP活性与GLU变化趋势一致但幅度较小. ρ(MPs)为0.1~30 mg·L-1时, 对LAP活性并无显著影响, 但ρ(MPs)为40 mg·L-1时, 可逆附着期LAP活性有明显地下降, 降至对照组的(29.9±8.3)%.LAP活性与EPS中蛋白质含量的变化趋势较为一致, 高浓度MPs中, 蛋白质含量的减少可能因为胞外氮循环有关酶活性受到抑制, 从而抑制了蛋白质的表达.
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图 6 不同PS-MPs浓度下各阶段生物膜LAP的相对活性 Fig. 6 Relative activity of LAP in biofilms at different growth stages under different PS-MPs concentrations |
AKP是由细菌phoD编码的, 参与有机磷向无机磷的矿化[46].本实验中除了ρ(MPs)为40 mg·L-1时附着期生物膜AKP活性降低了(20.7±7.1)%, AKP的活性一直较为稳定, 不受MPs的影响(图 7).
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图 7 不同PS-MPs浓度下各阶段生物膜AKP的相对活性 Fig. 7 Relative activity of AKP in biofilms at different growth stages under different PS-MPs concentrations |
本研究结果与Miao等[19]所研究的PS-MPs对淡水生物膜胞外酶活性的影响相似, ρ(MPs)为0~100 mg·L-1时, 生物膜中GLU活性先升后降, LAP活性显著下降而AKP活性相对稳定.GLU在低浓度PS-MPs中活性增强可能是因为淡水生物膜对PS的抵抗能力优于单菌种生物膜, 使得GLU在低浓度PS中被刺激提升活性, 但随着浓度的升高, GLU和LAP的活性均受到抑制. 3种胞外酶对PS-MPs敏感性的差异可能是3种酶不同的定位模式造成的.有研究表明, 大部分GLU位于EPS外层, 因此, GLU可能更容易被MPs和ROS影响[47].而LAP和AKP主要与不溶性组分有关, 与GLU相比受影响较小.GLU和LAP活性的降低表明MPs在生物膜形成初期对碳氮循环有负面影响, 该负面影响在成熟期生物膜中均有所降低, 这表明较为完整的EPS起到了部分屏障的作用, 防止了MPs的毒性, 清除了产生的ROS, 并保持了胞外酶的活性.
2.6 敏感性分析表 1总结了各指标抑制效应的临界浓度(no observed effect concentration, NOEC)[48].可以发现可逆附着期生物膜对PS-MPs最敏感, 随着生物膜的发育, 其对PS-MPs的耐受性明显增强.不同阶段生物膜敏感程度的不同主要与EPS有关, EPS分泌量、胞外酶GLU和AKP活性在可逆附着期NOEC值相较其他时期生物膜低.氧化应激相关指标受MPs影响较小, ROS在生长期对MPs耐受度增强, T-AOC和LDH在生物膜不同阶段NOEC值不变.这可能是ROS介导的蛋白质氧化的结果.生物膜发育初期, EPS分泌量较少, ROS可能与胞外酶蛋白结合使其失活, 成熟期生物膜完整的EPS可减少但不会完全消除这种作用.总体而言, 可逆附着期生物膜对PS-MPs的敏感性可能会对生物膜养分获取产生不利影响, 并可能对养分循环和环境系统中污染物的降解产生影响.
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表 1 PS-MPs对各阶段变形杆菌生物膜各指标抑制效应的NOEC值 Table 1 NOEC of PS-MPs inhibitory effect on each index of Proteus biofilm at each stage |
3 结论
(1) 1 μm的PS-MPs为低毒性物质.
(2) 不同生长发育阶段的生物膜对MPs敏感度不同.可逆附着期生物膜对PS-MPs最敏感, 随着生物膜成熟度的提高, MPs对生物膜的影响明显减弱.成熟生物膜EPS可以有效减轻MPs的负面影响, 清除ROS, 并保障功能酶的活性.
(3) 变形杆菌生物膜暴露在MPs中时会提高氧化应激水平, 高浓度MPs会导致生物膜改变EPS的多糖和蛋白质的含量和比例, 抑制生物膜功能酶特别是GLU和LAP的活性, 导致变形杆菌生物膜生物量降低, 对营养循环产生不利影响.
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