2022, Vol. 43
2. 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所, 北京 100081
, QIN Shan-mei1 , CHEN Zhao-jin1 , ZHANG Jun1 , YAO Lun-guang1 , LI Na1 , PANG Fa-hu1
, HAN Hui1,2
2. Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
我国农田土壤重金属污染形势严峻, 已对粮食安全构成威胁, 尤其是广大偏酸性农田土壤, 给我国农作物(尤其是水稻和小麦)的安全生产带来了严峻挑战[1~3].镉(Cd)是一种致癌性很强的重金属元素, 在很低的浓度下就能对生物造成毒害作用.土壤环境中的Cd既能通过植物的累积作用进入食物链, 也能经径流和淋溶作用造成水污染[4, 5].因此探寻修复Cd污染农田和阻控小麦Cd吸收的方法迫在眉睫.常用的阻控农田作物吸收重金属的方法主要有低累积品种的筛选、农艺调控措施、原位钝化修复、水肥管理和叶面阻控剂的施用等[6, 7].对于广阔的中轻度重金属超标农田而言, 原位钝化修复是常用的修复方法.例如在土壤中施用化学钝化剂, 种植高蓄积体植物, 在土壤中添加特殊的菌群等[8, 9].而微生物钝化修复有着成本低、操作简单和对原生态系统影响小等优点, 越来越受到广泛地关注[10, 11].
环境中有些细菌具有抵抗高浓度重金属胁迫的能力, 并且能够通过细胞吸附和螯合重金属, 或者通过分泌磷酸酶和脱落酸等次级代谢物固定沉淀重金属从而降低重金属在环境中的移动性, 被称为重金属固定细菌[12, 13].当外源接种这些菌株到植物根际土壤中, 这些菌株能够降低重金属在土壤中的生物利用度, 从而阻控作物对重金属的吸收.菌株Serratia. sp HY-22、Pseudomonas. sp WRS8和Bacillus. sp H3被报道分别具有阻控蔬菜、小麦和水稻对Cd的吸收的能力[14~16].有研究表明外源钝化剂的使用能够改变土壤的理化性质, 同时对作物根际的微生物群落也会造成一定的影响[9], 但是关于外源菌株的接种对于作物根际功能细菌群落结构的影响以及这种影响对作物吸收重金属的影响的报道不多.多胺是生物代谢过程中产生的一类化学结构中含有两个及以上氨基的低分子量脂肪族含氮碱, 常见的多胺主要有腐胺、亚精胺和精胺[17].产多胺细菌分泌的多胺能够促进植物生长, 在应对重金属胁迫等方面具有重要的作用[18, 19].在前期研究中, 笔者实验室筛选到1株产多胺重金属固定细菌Bacillus sp. N3(MH715353), 具有阻控生菜吸收Cd和Pb的能力[20].但是关于产多胺细菌对小麦Cd吸收和根际细菌群落结构的影响还不清楚.因此本研究通过盆栽试验, 借助高通量测序技术研究菌株N3的接种对小麦根系细菌群落结构和Cd吸收的影响, 同时对小麦根际土壤中的优势菌株进行功能分类和代谢通路分析, 在细菌群落层面探究菌株N3阻控小麦Cd吸收的机制, 以期为产多胺细菌修复重金属污染农田和保障小麦安全生产提供菌种资源和技术途径.
1 材料与方法 1.1 供试菌株和Cd污染土壤菌株Bacillus sp. N3(MH715353)分离自Cd污染生菜根际土壤中[20].本研究表明菌株N3能够分泌精胺和亚精胺, 对Cd的致死浓度为600 mg·L-1.在ρ(Cd)为3 mg·L-1的溶液中培养菌株N3, 24 h后测定上清液Cd的质量浓度, 发现菌株N3对Cd的吸附率为93.4%.因此菌株N3是1株产多胺重金属固定细菌.采集Cd污染农田土壤, 自然风干, 过80目筛.土壤pH为6.84, ω(总Cd)为2.24 mg·kg-1, ω(有机质)为25.12 g·kg-1, ω(总氮)为1.12 g·kg-1, ω(有效磷)为0.574 g·kg-1, ω(速效钾)为1.11 g·kg-1.
1.2 小麦盆栽试验称取5 kg土壤放入盆中, 为了保证小麦能够正常生长, 每盆土壤另外施加5 g尿素、2.5 g磷酸二氢钾和2.5 g氯化钾.本试验共设置两个处理: 不接菌对照组(CK)和接种N3处理组(N3), 每个处理3个重复.取河南地区常规小麦品种郑7698(Triticum aestivum L.)若干, 用75%的酒精消毒3 min, 再用去离子水清洗3遍, 放在清洁纱布中, 置于25℃的条件下催芽.待小麦种子露白, 从中取出一部分种子放入含有菌株N3的菌悬液(108 CFU·mL-1)中浸泡2 h, 然后将所有种子均匀地撒在盆中的土壤表层, 然后在种子上面铺一层薄土.小麦种子出苗后进行逐步间苗, 最后每盆留下10棵小麦苗.等到小麦到了拔节期, 对N3处理组中的小麦苗再次进行接种.对含有培养基的菌液进行3000 r·min-1离心5 min, 倒去上清液, 加入无菌去离子水, 使D600=1.0×108 CFU·mL-1, 即为接种所用的菌悬液.用镊子沿小麦根部土壤划开一条小沟, 倒入25 mL菌悬液, 最后盖上土壤.按照常规方法进行小麦管理, 小麦于2020年10月28日种植, 2021年5月25日收获.
1.3 植物和土壤样品收获处理小麦成熟后, 分别收集小麦籽粒、秸秆和根, 用去离子水洗干净后烘干和称重, 然后用粉碎机磨碎, 采用电热消解法消解样品, 然后用电感耦合等离子体发射光谱仪(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry, ICP-AES, SHIMADZ ICPE-9820)测定上清液中Cd质量浓度, 进而计算小麦各组织Cd的含量.采用国家标准参比物质(土壤: GBW-07402, 植物: GBW-08501)进行质量控制, 标样测定结果均在允许误差范围内.采集小麦根际土时, 提前1 d在小麦盆中撒些无菌水, 使盆中的土壤保持潮湿但又不粘黏的状态.第2 d收获时, 使整个小麦连根带土从盆中拨出来, 然后用手轻轻剥掉外围的土壤.由于小麦的根长得比较茂密, 根与根之间会包裹住很多土, 采用抖落法去掉大部分的土壤.然后用镊子挑出距离小麦根5 mm以内的土, 收集起来, 即为根际土.快速地收集每个处理的根际土, 装入封口袋, 存放于-80℃超低温冰箱中(每个处理3 g土壤).剩下的根际土进行室温晾干, 进行其他指标测定.称取5.0 g晾干土壤加入25 mL DTPA提取剂, 提取测定DTPA-Cd含量.以1∶2.5的土水比测定小麦根际土壤pH值.采用重铬酸钾容量法测定小麦根际土壤中有机质的含量[21].称取新鲜小麦根际土壤5.0 g放到含有30 mL无菌去离子水的摇瓶内, 150 r·min-1振荡培养3 h, 8000 r·min-1离心10 min.取2 mL上清液, 加入2 mL 10%(体积分数)的高氯酸, 混匀, 置于4℃冰箱中浸提2 h.然后10000 r·min-1 4℃下离心30 min.采用高效液相法测定上清液中腐胺、精胺和亚精胺的含量[22].
1.4 小麦根际土壤细菌群落测定和数据分析采用土壤DNA提取试剂盒FastDNA® SPIN (MP Biomedicals. Germany)提取各处理小麦根际土壤的总DNA, 16S rRNA的V3-V4片段使用引物5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′和5′-CCTACGGG NGGCWGCAG-3′扩增[23], 扩增产物送上海美吉生物医药科技有限公司, 使用MiSeq PE300测序仪(Illumina Inc, San Diego, CA, USA)完成序列测定.
数据分析在美吉云平台上在线分析(https://login.majorbio.com).其中, 采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析, 并在各个分类水平下统计每个样品的群落组成.基于OTU计算稀释曲线、群落丰富度指数(Chao1、ACE)和群落多样性指数(Shannon、Simpson)等[24].采用STAMP软件不同处理优势属的差异情况.细菌的功能和代谢途径预测采用PICRUSt2软件进行分析, 利用QIIME获得的closed OTU-table与COG、KEGG数据库进行比对, 获得不同的数据库功能预测信息, 具体分析步骤基于在线分析平台(https://github.com/picrust/picrust2)[25].
1.5 数据处理采用SPSS 17.0软件进行数据统计分析, 用Microsoft Excel 2010和AI 2020软件进行绘图.
2 结果与分析 2.1 产多胺细菌N3对小麦Cd吸收和干重的影响与不接菌对照相比, 接种外源产多胺细菌N3能够影响小麦对Cd的吸收(表 1).其中, N3处理中小麦籽粒、秸秆和根部中Cd的含量与CK处理组相比, 分别降低了64.7%、27.6%和50.5%.这表明菌株N3具有阻控小麦各组织对Cd吸收的能力.此外, 与不接菌对照相比, 菌株N3的接种对小麦籽粒的干重无显著影响, 但是提高了小麦根部的干重(58.9%), 这表明菌株N3可能缓解了小麦遭受Cd胁迫的压力, 或者是分泌了一些物质, 促进了小麦根系的生长.但是由于小麦生长周期长, 外部环境影响大, 菌株N3对小麦地上部组织的生物量无显著影响.
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表 1 接种菌株N3对小麦各组织Cd含量和干重的影响1) Table 1 Effects of strain N3 on Cd content and dry weight of wheat tissues |
2.2 产多胺细菌N3对小麦根际土壤pH、DTPA-Cd、有机质和多胺含量的影响
菌株N3能够阻控小麦对Cd的吸收, 首先对小麦根际土壤中有效态Cd含量及其影响因素进行了分析.对照组中小麦根际土壤中ω(DTPA-Cd)为0.42 mg·kg-1, 而菌株N3显著降低了小麦根际土壤中DTPA-Cd的质量分数(50.1%).作物吸收的重金属的量与土壤中重金属的总量关系不大, 而是跟重金属有效态含量密切相关.因此外源菌株N3的接种降低小麦根际土壤中有效态Cd的含量, 进而降低了小麦各组织, 尤其是籽粒中Cd的含量.对照组根际土壤的pH值为6.84, 而N3处理组中的pH值为6.97, 表明菌株N3的接种提高了根际土壤的pH值, 但是对有机质含量无显著影响.此外, 研究发现N3处理组小麦根际土壤中多胺的含量(腐胺、精胺和亚精胺)显著高于对照组中多胺的含量, 可能是因为菌株N3能够分泌多胺的原因, 同时多胺含量的增加也能提高土壤的pH值.
2.3 产多胺细菌N3对小麦根际土壤细菌群落结构和多样性的影响采用高通量测序技术研究外源产多胺细菌的接种是否对小麦根际土壤细菌群落和多样性造成了影响.对各样品多样性指数进行了分析(表 2), N3处理组样品的Simpson指数显著大于CK处理组样品的Simpson指数, 而Shannon、Chao1和Sobs指数均小于CK处理组样品的相应指数, 表明外源菌株N3的接种显著降低了小麦根际细菌群落的多样性.
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表 2 不同处理小麦根际细菌群落α多样性指数1) Table 2 The α diversity index of bacterial community in wheat rhizosphere under different treatments |
基于UPGMA和PCA分析接菌组和对照组的样品细菌群落结构差异.N3处理组的3个重复聚在一个大枝上, 而CK处理组的3个重复聚在另一个大枝上[图 1(a)], 说明N3处理组的细菌群落结构与CK处理组的细菌群落结构不一样, 同时也说明各个处理之间的重复性较好, 结果可信.PCA结果也表明N3处理组的3个重复聚在一起, 与CK处理组的3个重复明显分开[图 1(b)], 进一步表明了菌株N3显著改变了小麦根际土壤细菌的组成结构.在门水平上分析发现, 两个处理组中小麦根际土壤细菌群落主要(相对丰度>1%)由7个门组成[图 2(a)], 其中β-变形菌门(β-Proteobacteria, 36.1%~51.8%)、放线菌门(Actinobacteria, 18.1%~30.5%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 8.9%~11.2%)、绿弯菌门(Chloroflexi, 4.4%~7.5%)、厚壁菌门(Firmicutes, 1.4%~6.3%)和酸杆菌门(Acidobacteria, 1.7%~3.4%)等优势门的总丰度占到了97.4%~98.4%.与对照相比, 菌株N3的接种显著提高了变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度, 显著降低了放线菌门和绿弯菌门的相对丰度.在目水平上分析可知两个处理组中小麦根际土壤细菌的优势目(相对丰度>1%)主要有微球菌目(Micrococcales)、根瘤菌目(Rhizosphere)、β-杆菌目(β-Proteobacteriales)、鞘氨醇单胞菌目(Sphingomonadales)、芽孢杆菌目(Bacillales)和假单胞菌目(Pseudomonadales)[图 2(b)].
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图 1 菌株N3对小麦根际土壤细菌群落多样性的影响 Fig. 1 Effects of strain N3 on the bacterial community diversity in wheat rhizosphere soil |
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(a)门水平分析, (b)目水平分析 图 2 菌株N3对小麦根际土壤细菌群落结构的影响 Fig. 2 Effects of strain N3 on the bacterial community structure in wheat rhizosphere soil |
在土壤中发挥功能的微生物常常分析到属水平, 因此本研究对两个处理的小麦根际土壤细菌属水平的丰度占比前40种群进行分析.同时, 把这些属主要分为重金属固定或者抗性细菌和植物促生细菌.此外, 为了便于分析, 去掉了norank和unclassified的菌属, 最终获得的结果如图 3所示.与对照相比, 接种N3显著提高了根际土壤Bacillus、Arthrobacter、Brevundimonas、Ensifer、Microvirga、Aminobacter、Pedobacter、Rhizobium、Pseudomonas、Enterobacter、Rhodococcus和Serratia的相对丰度, 显著降低了Sphingomonas、Nocardioides、Flavisolibacter和Arenimonas的相对丰度.查阅文献[26~33]可知, Bacillus、Arthrobacter、Brevundimonas、Ensifer、Pedobacter、Rhizobium、Pseudomonas、Enterobacter、Serratia、Geobacter和Lacibacter具有重金属固定或者抗性的特性, 而Brevundimonas、Bacillus、Ensifer、Rhizobium、Enterobacter、Serratia、Pseudomonas、Aminobacter、Pedobacter、Massilia、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、Geobacter和Rubellimicrobiu具有植物促生的特性.这表明菌株N3能够增加小麦根际土壤中具有重金属固定或者抗性以及植物促生细菌的比例的菌属(主要为Bacillus、Arthrobacter、Brevundimonas、Ensifer、Pedobacter、Rhizobium、Pseudomonas、Enterobacter和Serratia), 而这些菌属在钝化土壤重金属和阻控小麦吸收重金属中发挥了重要作用.
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1.重金属固定或者抗性细菌(a. Arthrobacter, b. Brevundimonas, c. Bacillus, e. Ensifer, f. Rhizobium, g. Enterobacter, h. Serratia, i. Pseudomonas, l. Pedobacter, s. Geobacter, t. Lacibacter), 2.植物促生细菌(b. Brevundimonas, c. Bacillus, e. Ensifer, f. Rhizobium, g. Enterobacter, h. Serratia, i. Pseudomonas, k. Aminobacter, l. Pedobacter, m. Massilia, p. Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium, s. Geobacter, w. Rubellimicrobium) 图 3 属水平上菌株N3对小麦根际土壤功能细菌群落结构的影响 Fig. 3 Effects of strain N3 on the functional bacterial community structure in wheat rhizosphere soil at the genus level |
采用PICRUSt软件对不同样品根际细菌功能进行预测分析, 选择第三级功能层生物代谢通路进行分析, 找到差异代谢通路, 同时去掉与土壤环境无关的代谢通路, 结果如图 4所示.共筛选到15个与土壤环境相关的差异代谢通路, 如ABC转运(ABC transporters)、DNA修复与重组(DNA repair and recombination proteins)和精氨酸与脯氨酸代谢(arginine and proline metabolism)等.与对照相比, 菌株N3显著提高了小麦根际土壤中与抗氧化能力[谷胱甘肽代谢(glutathione metabolism)和α-亚麻酸代谢(α-Linolenic acid metabolism)]、激素合成[甜菜碱合成(betalain biosynthesis)、吲哚生物碱合成(indole alkaloid biosynthesis)、精氨酸与脯氨酸代谢(arginine and proline metabolism)、细胞色素P450代谢(metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)]、元素循环[硫代谢(sulfur metabolism)和氮代谢(nitrogen metabolism)]的基因拷贝数, 表明这些代谢途径在土壤Cd固定、提高小麦抗Cd能力和促进小麦生长中发挥着重要作用.与此同时菌株N3处理组中参与能量代谢[柠檬酸盐循环(citrate cycle)、糖酵解与糖异生(glycolysis/gluconeogenesis)和能量代谢(energy metabolism)]相关的基因拷贝数显著降低, 可能是因为外源菌株N3的接入显著降低了土壤中Cd的有效态含量, 缓解了Cd对生物体造成的胁迫, 因此群落微生物消耗的额外能量也就降低了.
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图 4 不同样品细菌PICRUSt功能预测 Fig. 4 PICRUSt metabolic predictions of the bacterial communities from different samples |
为了探究影响土壤中有效态Cd含量的主要因子, 选取小麦根际土壤DTPA-Cd、pH、有机质和多胺含量以及相对丰度前10的细菌种属进行冗余分析(redundancy analysis, RDA), 结果如图 5所示.小麦根际土壤中DTPA-Cd的含量与pH值和多胺含量呈显著负相关, 同时DTPA-Cd的含量也与Bacillus、Arthrobacter、Brevundimonas、Ensifer和Enterobacter的相对丰度呈显著负相关, 而与Sphingomonas、Nocardioides和Flavisolibacter的相对丰度呈显著正相关.以上结果表明菌株N3主要通过提高小麦根际土壤的pH值和多胺含量以及Bacillus、Arthrobacter、Brevundimonas、Ensifer和Enterobacter的相对丰度, 降低Sphingomonas、Nocardioides和Flavisolibacter的相对丰度来降低DTPA-Cd的含量, 进而阻控了小麦对Cd的吸收.
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红色箭头表示主因子, 黑色箭头表示土壤部分理化性质, 蓝色箭头表示土壤细菌菌属 图 5 小麦根际土壤中DTPA-Cd含量与土壤环境变量冗余分析(RDA) Fig. 5 Redundancy analysis(RDA) between DTPA-Cd content and soil environmental variables in wheat rhizosphere soil |
与土壤中的土著微生物相比, 经过筛选的外源重金属固定菌株具有更强的固定重金属和分泌植物促生物质的能力[34, 35].因此, 增强重金属固定的微生物钝化技术已成为一种有前景的修复重金属污染土壤的技术.本研究发现产多胺重金属固定细菌Bacillus sp. N3具有阻控小麦吸收Cd的能力(表 1).多胺被普遍认为是植物生长调节物质, 在促进植物生长、延缓植株衰老和提高种子活力等方面发挥着重要作用[36]. Cd胁迫下, 外源亚精胺处理能够显著增加苎麻维生素E含量, 提高超氧化物歧化酶和过氧化物酶的活性, 增幅达到95%和49%[37].此外, 多胺还有助于植物抵御重金属胁迫.Hsu等[38]的研究发现外源多胺的添加可以提高水稻对重金属抗性.菌株N3能够分泌精胺和亚精胺, 提高小麦根际土壤中多胺的含量, 进而提高了小麦根部对Cd的抗性, 提高了小麦根的干重(表 1).此外, PICRUSt功能预测表明菌株N3的接种显著提高了小麦根际土壤中与抗氧化能力、激素合成(生物碱、精氨酸和亚麻酸)有关的基因拷贝数, 表明菌株N3还能调控小麦根际细菌群落, 提高小麦的抗Cd能力和促进小麦生长.前期研究表明菌株N3分泌的精胺和亚精胺具有螯合Cd, 降低有效态Cd含量的能力[20].本研究中菌株N3也显著提高了小麦根际中多胺的含量, 进而导致DTPA-Cd的含量显著降低.此外, 多胺是一类含氮碱, 呈碱性, 具有提高环境pH的能力.这可能是小麦根际土壤pH升高的主要原因.土壤pH的升高, 能够显著降低土壤总有效态Cd的含量[39].相关性分析也表明小麦根际土壤中DTPA-Cd的含量与pH值和多胺含量呈显著负相关, 说明菌株N3通过提高小麦根际土壤pH值和多胺含量, 降低了DTPA-Cd的含量, 进而阻控了小麦对Cd的吸收和提高对Cd的抗性.
3.2 产多胺细菌调控小麦根际细菌群落阻控小麦Cd吸收重金属固定细菌的有效性取决于其对环境变化的多功能性和适应性以及其在土著微生物群落其他成员中定殖和竞争的能力[40].CK处理组中Bacillus的相对丰度为0.41%, 而N3处理组中Bacillus的相对丰度为4.3%(图 2), 表明Bacillus sp. N3能够很好地定殖在小麦根际土壤中.一些研究人员认为重金属固定细菌或者植物促生细菌之所以成功定殖于作物根际土壤中, 是因为它们具有重金属抗性和促生特性, 例如植物激素生成、固氮和磷酸盐增溶作用, 因此在根际和内层生态位竞争中获得了优势[41].在微生物修复过程中, 外源微生物的接种可能导致土壤-根界面微生物相互作用和高度适应的微生物群落共生模式发生改变, 适应特定环境的微生物往往具有类似的资源利用策略[42].外源产多胺细菌Bacillus sp. N3的接种能够阻控小麦对Cd的吸收, 不仅仅是菌株N3自身的作用, 还跟小麦根际土著微生物群落结构的变化密切相关.菌株N3的接种显著提高了小麦根际土壤中β-Proteobacteria和Firmicutes的相对丰度. β-Proteobacteria中的许多菌属均具有重金属固定或者PGPB的属, 包括Rhizobium、Enterobacter、Pseudomonas、Sinorhizobium、Burkholderia和Serratia等[26, 43].重金属固定或者植物促生细菌的存在会增加与β-Proteobacteria相关的共生关联, 这并不奇怪, 有人建议接种植物促生细菌会增加重金属污染土壤中植物促生细菌的比例, 进而促进植物生长, 提高植物抗性[27].此外, 菌株N3处理组的相对丰富较高的菌属中, Bacillus、Brevundimonas、Ensifer、Rhizobium、Pseudomonas、Enterobacter和Serratia均具有重金属固定和植物促生的能力[28~33].这些均表明菌株N3的接种增加了小麦根际土壤中具有Cd固定或者植物促生能力的菌属的丰度, 进而阻控了小麦对Cd的吸收.
4 结论(1) 产多胺细菌Bacillus sp. N3显著降低小麦籽粒中Cd和根际土壤DTPA-Cd的含量, 提高根际土壤pH值和多胺的含量.
(2) 菌株N3的接种降低了小麦根际土壤细菌群落的多样性, 但是提高了β-Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes的相对丰度.此外, 菌株N3还显著提高了小麦根际土壤中具有重金属固定或者植物促生细菌能力的菌属的相对丰度.
(3) 相关性分析表明菌株N3主要通过提高小麦根际土壤的pH值和多胺含量以及Bacillus、Arthrobacter、Brevundimonas、Ensifer和Enterobacter的相对丰度来降低DTPA-Cd的含量, 进而阻控了小麦对Cd的吸收.
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