2022, Vol. 43
2. 城市生活污水资源化利用技术国家地方联合工程实验室, 苏州 215009
2. National and Local Joint Engineering Laboratory of Municipal Sewage Resource Utilization Technology, Suzhou 215009, China
与传统活性污泥法相比, 部分亚硝化/厌氧氨氧化(PN/A)工艺具有不依赖碳源, 曝气量减少约60%、污泥产量减少90%、脱氮效率高等优势[1, 2].在该体系中, 好氧氨氧化细菌(AOB)或真菌(AOA)首先将进水中的部分氨氮(NH4+-N)氧化成亚硝态氮(NO2--N), 随后, 厌氧氨氧化菌(AMX)在缺氧条件下将剩余NH4+-N和NO2--N转化为氮气(N2), 并生成少量的硝态氮(NO3--N).近年来, PN/A工艺正由处理污泥消化液[3]、印染废水[4]和垃圾滤液[5]等高氨氮废水转向应用于大规模的市政污水处理中, 并被认为是支撑污水厂实现碳中和愿景的关键性技术[6].
有研究表明, AMX普遍存在于市政污水处理系统中, 并实际参与了氮素的转化过程[7].通过采取有效的生物量截留, 提供合适的NH4+-N/NO2--N配比和营造低有机碳的缺氧生境, 可以实现AMX在污泥中的选择性富集[8, 9].相较于悬浮污泥系统, 颗粒污泥更适合用作PN/A反应的载体.功能菌依据生境差异分层分布于颗粒中, 外层的好氧菌消耗溶解氧, 产生NO2--N供给内层厌氧区的AMX生长, 并保护后者不受水力冲刷和低温冲击[10, 11].近期, Liu等[12]的研究利用硝化颗粒污泥在低温(15~20℃)、低氨氮[ρ(NH4+-N) < 40 mg·L-1]条件下, 历时约250 d成功启动了PN/A系统, AMX(Ca. Brocadia属)的相对丰度达到了约30%.与之相比, 通过接种富含AMX的PN/A颗粒污泥, 无疑将大幅缩短反应器的启动时间.李伙生[13]的研究在序批式反应器(SBR)中混合接种亚硝化絮体污泥和厌氧氨氧化颗粒污泥, 仅用53 d就获得了0.43 kg·(m3·d)-1的总氮(TN)去除负荷.类似地, 孙延芳等[14]的研究在SBR反应器中混合接种颗粒状和絮状厌氧氨氧化污泥(20%∶80%)使启动时间显著缩短至35 d.
在实际工程中, 污水厂一旦遭受毒物冲击、设备损坏或污泥流失等情况, 都需要补充一定污泥以恢复或维持系统的稳定性.因此, PN/A系统运行期间产生的剩余污泥一般需要进行低温储存, 以尽可能保留核心功能菌群[15]. Lv等[16]的研究发现, 好氧颗粒污泥在-20℃条件下储存40 d后, 颗粒形态和微生物群落均与储存前差异不大.对于PN/A颗粒污泥而言, 长时间的低温储存是否会显著影响其活化效果仍需要实验验证.为此, 本研究在完全混合流反应器(CSTR)中活化长期冷冻颗粒污泥, 通过逐级提升进水氮负荷(NLR)和水力选择压, 快速启动全自养生物脱氮系统, 并尝试建立污泥外观形态、脱氮活性和菌群结构的响应关系, 以期为解析低温储存污泥的接种功能提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 接种污泥类型接种污泥为在-20℃条件下储存超过120 d的PN/A颗粒污泥, 储存介质为约600 mg·L-1NH4Cl溶液.储存污泥取自一个实验室规模的CSTR反应器中, 其TN去除负荷为7.2 kg·(m3·d)-1, 颗粒整体呈现砖红色, 沉降性能良好[17].
1.2 装置运行方法将低温储存的颗粒污泥接种至一个曝气池容积为1.7 L的CSTR反应器中, 污泥初始浓度(MLSS)为2 100 mg·L-1.进水不含有机物, 以NaHCO3和NH4Cl充当碳、氮源, 投加少量磷酸二氢钾、硫酸镁和微量元素[17], pH控制在7.6~8.0, 运行温度为(30±2)℃.
为有效截留污泥量, 反应器在第Ⅰ~Ⅲ阶段采用序批方式运行, 进水NH4+-N浓度略高于100 mg·L-1, 单个周期分为进水(10 min)、曝气、沉淀(30min)和排水(5 min)这4个阶段, 控制排水比为75%.反应器在第Ⅳ~Ⅵ阶段转为连续流操作, 进水ρ(NH4+-N)为200 mg·L-1, 逐级缩短水力停留时间(HRT), 以提高NLR.各阶段运行条件如表 1所示.
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表 1 反应器在不同运行阶段的操作条件 Table 1 Operating conditions of reactor in different operational phases |
1.3 水质指标与形态分析
NH4+-N、NO3--N、NO2--N和TN浓度分别采用纳氏试剂光度法、紫外分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺光度法和过硫酸钾氧化-紫外分光光度法测定, MLSS浓度采用标准重量法测定[18].分别采用便携式pH计(METTLER TOLEDO型)、溶解氧仪(HACH HQ30d型)测定溶液pH和溶解氧(DO)浓度.
污泥形态变化采用带数码相机的光学显微镜(OLYMPUS CX41型)进行观测, 同时, 使用Quanta FEG 250型扫描电子显微镜(SEM)记录颗粒表面菌体外形.预处理方法如下[19]: 取湿污泥10 mL, 以5 000 r·min-1转速离心去除上清液, 再加入5 mL浓度2.5%的戊二醛, 置于4℃冰箱固定4 h.随后, 用1 mol·L-1磷酸缓冲溶液清洗3次, 依次用浓度10%、20%、40%、60%和80%的乙醇溶液进行脱水操作, 再经无水乙醇脱水3次, 每次15 min.完成真空干燥、喷金处理后, 拍摄颗粒表面SEM照片.
NO2--N累积率:
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f值:
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式中, c(NO2--N)为出水中NO2--N浓度(mg·L-1); c(NO3--N)为出水中NO3--N浓度(mg·L-1); Δc(NO3--N)为反应中NO3--N消耗的量(mg·L-1); Δc(NH4+-N)为反应中NH4+-N消耗的量(mg·L-1).
1.4 污泥脱氮活性的测定为评估颗粒污泥的活性变化, 定期从反应器中取出10 mL湿污泥, 经生理盐水清洗后, 置于150 mL锥形瓶与90 mL基质溶液混合.NH4+-N初始浓度控制在100 mg·L-1, pH=7.8.锥形瓶用透气硅胶塞盖好, 置于30℃, 在180 r·min-1转速下振荡反应.依据一定时间段内氮素浓度的变化量, 计算单位质量污泥的NH4+-N和TN的比去除速率(以N/VSS计), 即q(NH4+-N)和q(TN)[9].
1.5 颗粒特征尺寸的分布运行期间, 利用Image pro-plus图像处理软件对颗粒污泥垂直投影面积进行识别和统计分析[20].如图 1所示, 本文中颗粒的特征尺寸指的是颗粒整体投影面积(AG)和砖红色区域投影面积(AR).
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图 1 颗粒污泥的特征尺寸 Fig. 1 Characteristic dimensions of granular sludge |
颗粒污泥面积以0 mm2为最小值, 2 mm2为最大值, 以0.2 mm2为分组组距, 分为10组, 统计AG和AR在各组间的占比为面积分布, 并对其进行log(Normal)函数拟合, 正态分布函数如下:
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式中, y为AG和AR的面积分布, x为一定范围内的AG和AR(mm2), xc为AG和AR的中位数(mm2), σ是标准方差.
1.6 高通量测序分别采集活化前污泥(GC)和活化后污泥(GM)样品, 置于-80℃条件下保存.使用试剂盒(Fast DNA Spin kit for soil, M.P., U.S.)对污泥样品进行DNA提取.选择引物338F (5′-ACTCCTACGGGA GGCAGCA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3′)进行16S rRNA V3-V4区基因扩增.在完成PCR扩增后, 使用AxyPrepTM DNA凝胶提取试剂盒(Axygen Biosciences, Union City, U.S.)对产物进行纯化和定量.污泥样品的高通量测序在Illumina MiSeq测序平台上完成[11].
2 结果与讨论 2.1 反应器的快速启动在第Ⅰ阶段, 反应器采用序批次运行, NLR仅为0.23 kg·(m3·d)-1, 通过限制曝气强度使ρ(DO)≤1 mg·L-1.通常认为, 基质浓度的周期变化有利于提升污泥活性, 促进胞外聚合物(EPS)的分泌[21], 同时, 较长的沉降时间可有效截留从颗粒表面剥离的絮状污泥, 防止生物量大幅降低.如图 2所示, 在前7 d内, 反应器的NH4+-N去除负荷由0.12 kg·(m3·d)-1升至0.22 kg·(m3·d)-1, 出水NAP达到83.3%, TN去除率约为42.9%.当单周期剩余的ρ(NH4+-N) < 10 mg·L-1时, 需增加单日周期数, 提高NLR.在第Ⅲ阶段(第12~16 d), 反应器NLR为0.90 kg·(m3·d)-1, 反应器对NH4+-N和TN的去除负荷分别达到0.88 kg·(m3·d)-1和0.71 kg·(m3·d)-1.
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图 2 活性恢复期间PN/A反应器脱氮性能的变化 Fig. 2 Changes in nitrogen removal performance of PN/A reactor during activity recovery |
与序批式相比, 连续流运行具有反应器操作简单和容积利用率高等特点, 更适合用于大规模污水处理.为此, 反应器从第17 d转为连续进出水, 并通过逐级缩短HRT, 使NLR由1.07 kg·(m3·d)-1提高至1.54 kg·(m3·d)-1.期间, 颗粒污泥表现出良好的沉降性能, 运行至第34 d时, TN去除率约为83.3%, NO3--N产生量与NH4+-N去除量之比(f值)约为0.12, 接近PN/A反应的计量学理论值0.11[22].在第Ⅵ阶段(第35~72 d), 反应器NLR控制在2.00 kg·(m3·d)-1, NH4+-N和TN去除率分别为(96.5±4.3)%和(82.5±2.1)%.有研究表明, 当接种活性污泥启动PN/A工艺时, 通常采用严格限氧、优化基质配比和提升进水负荷等调控策略, 需要较长时间才能完成异养菌淘洗和自养菌富集过程[23, 24].相比之下, 低温储存的颗粒污泥能够在短期内适应高负荷和高水力选择压的运行条件, 实现全自养脱氮系统的高效运行.
2.2 污泥形态与活性变化反应器运行期间, 污泥形态和粒径分布变化如图 3所示.在启动初期, 接种污泥在曝气剪切力作用下, 出现了明显的破碎现象, 污泥呈橙黄色.颗粒整体投影面积(AG)和砖红色区域面积(AR)均服从对数正态分布, 数值集中在0.2~0.8 mm2范围内, AR/AG值约为0.75(表 2).随着反应器脱氮性能的持续提高, AR和AG均呈现增大趋势, 且分布更加均匀, AR/AG值在第Ⅵ阶段达到0.87.众所周知, 活性较高的AMX污泥由于富含亚铁血红素c而呈现血红色.这是因为亚铁血红素c是亚硝酸还原酶(NirS)、联氨氧化酶(HZS)和联氨脱氢酶(HDH)等AMX代谢功能酶的重要辅酶, 其含量的高低可以在一定程度上反映污泥的脱氮活性[25].Tang等[26]的研究发现, 随着反应器进水氮负荷的提高, AMX颗粒污泥的表面颜色明显由黑变为红.Kang等[27]的研究采用CIE L*a*b色彩空间法进一步证明了, AMX污泥的红色色差与其比脱氮速率存在良好的正相关性, R2 > 0.97.图 4对各阶段颗粒污泥的q值与AR进行了线性拟合, 结果显示两者的相关度很高, R2 > 0.98.实际上, 颗粒内砖红色区域对应于AMX密集分布的缺氧区, AR的增大不仅说明了AMX代谢活性的提高, 也是颗粒密实度得到改善的重要体现.由于AR的测量较q值更为简便快速, 因此, 这为PN/A系统的运行维护提供了一种简单的污泥活性评估方法.
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照片为颗粒污泥形态 图 3 不同阶段AG与AR的对数正态分布拟合曲线 Fig. 3 Fitting curves of lognormal distribution of AG and AR at different stages |
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表 2 颗粒特征投影面积的对数正态分布拟合参数 Table 2 Fitting-related parameters of projected area of granules |
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图 4 污泥脱氮活性与砖红色区域投影面积的线性拟合关系 Fig. 4 Linear fitting of specific nitrogen removal rates to projected area of erythrine zone in the granules |
另外, 使用SEM对活化前后颗粒污泥表面形貌进行观测, 结果如图 5所示.对于接种污泥而言[图 5(a)], 颗粒表面密集生长有球状和椭球状菌体, 整体被胞外聚合物裹夹.经过较长期运行(76 d)后, 颗粒表面菌体呈现多样化[图 5(b)], 短杆菌数量明显增多, 这说明外部基质与运行条件对污泥菌群结构产生了显著影响.
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图 5 活化前后颗粒污泥表面的SEM照片 Fig. 5 SEM images of the outer layers of granules before and after the activation |
使用MiSeq高通量测序技术对接种污泥(GC)和成熟PN/A颗粒污泥(GM)的菌群结构进行了分析.如表 3所示, GM的运算分类单位(OTU)数量较GC组多出62个, 另有248个OTU在两组中均能找到, 分别占到GC和GM总数的79.74%和66.49%.另外, GM的菌群多样性(高Shannon指数、低Simpson指数)和丰度(Ace指数、Chao指数更大)均高于GC的情形, 这意味着污泥活化过程对微生物群落结构有明显影响.
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表 3 反应器启动前后, 颗粒污泥中微生物多样性的对比结果 Table 3 The α diversity indices of PN/A granular sludges before and after the start-up of reactor |
图 6给出了两类污泥样品中细菌在门水平上的分布情况.与先前报道类似[28~30], 浮霉菌门(Planctomycetes)和变形菌(Proteobacteria)是PN/A污泥中的优势菌门.两者在GC中的相对丰度分别为38.8%和25.3%, 但在GM中分别降低了0.62%和10.68%.与之相反, 污泥活化过程使得绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的占比分别提高了0.6、2.4和10倍, 并替代绿菌门(Chlorobi)成为主要异养菌.有研究显示[31], AMX的群体效应受到喹诺酮信号分子的调控, 其脱氮活性的提高会促使EPS的大量分泌. EPS不仅有利于强化AMX的聚集性生长, 还为共生异养菌提供了生长碳源[12, 32]. 有研究认为, Chloroflexi的生长与颗粒粒径的增大密切相关[33], 而Acidobacteria和Bacteroidetes的大幅增殖则反映了颗粒表面不同生境的有效恢复[34, 35].
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图 6 两组污泥样品中丰度前20的细菌组成差异分析(门水平) Fig. 6 Statistical analyses of top 20 taxa in two sample groups on the phylum level |
进一步对颗粒中菌属分布的变化进行分析, 结果如图 7所示.污泥活化期间, NOB的生长得到了有效抑制, GM中NOB占比低于1%, 这主要得益于严格的限氧策略和AMX菌对亚硝态氮的竞争优势[11, 36].对于接种污泥而言, Denitratisoma和Haliangium的相对丰度分别达到了10.27%和7.35%, 这可能是由于污泥在储存过程中仍存在大分子有机物的水解现象, 维持了异养菌的生长代谢[37].反应器启动后, 基质类型的改变和较强的水力淘洗促使AOB(Nitrosomonas属)的占比由0.22%增长至2.10%, 这与图 5(b)中颗粒表面新生长的短杆菌一致[28].尽管GC和GM在颗粒形态和脱氮活性上均存在显著差异, 但AMX菌属Candidatus_Kuenenia始终处于优势地位, 相对丰度分别为38.3%和34.2%.在本研究中, PN/A反应器的快速启动是通过重塑共生菌群和优化颗粒形态, 驱动AMX菌属活化的过程.
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图 7 PN/A颗粒污泥中主要功能菌的系统发育树(属水平) Fig. 7 Bacterial phylogenetic tree of PN/A granules on the genus level |
(1) 采用高负荷和高水力选择压的调控策略, 在34 d内成功活化了低温储存PN/A颗粒污泥, NH4+-N和TN去除率分别达到98.4%和83.4%, CSTR反应器对TN去除负荷稳定在1.67kg·(m3·d)-1.
(2) 在污泥活化过程中, 污泥的AR/AG值由0.75增长至0.87, 这反映了颗粒密实度和AMX活性的同步提升.颗粒污泥的AR值与其比TN去除速率呈现良好正相关性, 因此, 颗粒内砖红色区域的大小可以用于指示污泥活性的高低.
(3) 由SEM观测和MiSeq高通量测序的结果表明, 活化后的PN/A颗粒污泥较接种污泥具有更高的微生物多样性和菌群丰度.随着Denitratisoma和Haliangium等异养菌的有效淘洗, AOB(Nitrosomonas属)与AMX(Candidatus_Kuenenia属)的丰度比值在活化期内提高了约10倍.微生物间协同作用增强, 颗粒结构改善是污泥能够快速活化的重要原因.
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