2022, Vol. 43
随着我国对城市地下水开采的限制, 水库成为城市的主要供水水源[1], 到目前为止, 水源水库都存在一定程度的水质污染或富营养化问题, 例如: 缓丘地带黄河镇水库[2]、大连碧流河水库[3]、山东周村水库[4]和三峡水库[5], 严重的已经丧失作为供给水源的功能.从而导致水厂处理难度加大、制水成本与水质超标风险大幅提高, 严重威胁到城市的饮用水安全.水库中的沉积物是水生态系统中氮素物质的汇集地[6~8], 对污染物迁移转化发挥重要作用.沉积物中氮素的去除对水库内源污染控制有十分重要的意义.
岗南水库作为石家庄的饮用水源地, 其水库沉积物中富含有大量微生物, 且微生物在水-沉积物的物质循环中起重要作用[9], 因此沉积物中的微生物与内源污染负荷关系紧密.好氧反硝化菌群的出现, 对水源水库氮素的消减和水体功能恢复有指导意义.Robertson等[10]的研究在废水脱硫和反硝化系统中首次分离出1株好氧反硝化菌Thiosphaera pantotropha(脱氮副球菌, Paracoccus denitrificans), 该菌群不仅可以降低氮素含量和去除有机污染物[11], 还可以同时进行硝化和反硝化, 在水体内源污染的控制过程中发挥重要作用.近年来, 国内外学者对好氧反硝化菌群已经进行了大量的研究[11, 12], 其中针对水源水库沉积物中好氧反硝化菌群的研究主要集中在高效菌株的筛选分离[13]和脱氮效率[14], 但实验室培养基驯化的高效菌株不适于实际应用, 很大程度是因为不清楚实际环境中好氧反硝化菌的分布特征以及驱动自然界好氧反硝化群落演变的影响因子.而沉积物是好氧反硝化菌群的聚集地, 目前对水源水库沉积物好氧反硝化微生物时空分布特征分析较少, 因此探明岗南水库沉积物好氧反硝化菌群实际分布特征, 可以为高效好氧反硝化菌的定向筛选提供数据支持, 对污染负荷环境的脱氮以及富营养化控制有十分重要的意义.
本课题组前期基于好氧反硝化功能基因(napA)的高通量测序[15, 16], 研究了好氧反硝化微生物群落特征.本文以岗南水库沉积物为研究对象, 通过好氧反硝化功能基因(napA)的测序技术探究从入库河口到坝前主库区沉积物中好氧反硝化菌群的时空分布特征, 本文应用α-多样性分析、韦恩分析、LEfSe分析和随机森林分析阐明岗南水库沉积物好氧反硝化菌群结构组成、多样性和差异性, 结合微生物网络分析解析好氧反硝化菌群落演变的关键物种, 以期为进一步研究水源水库氮素消除、水质改善和饮用水水质保障提供参考.
1 材料与方法 1.1 研究区概况岗南水库位于河北省平山县滹沱河干流, 是一座防洪灌溉、发电及库区养鱼等综合利用的大型水利枢纽工程.水库于1962年竣工, 总库容15.71亿m3, 控制流域面积15 900 km2, 流域属大陆性气候, 多年平均降雨量在地区分布上相差较大, 且80%以上集中在汛期6~9月, 多年平均气温为12.9~4.1℃, 多年平均蒸发量1 239 mm, 多年平均风速为1.7~9.0 m ·s-1; 多年平均径流量为16.6亿m3.
1.2 样品的采集与测定本研究自入库河口到坝前主库区共选取6个代表性采样点采集沉积物样品, 根据水库空间位置, 将岗南水库划分为3个区域, 分别为入库区、过渡区和主库区.本文选取1号采样点代表入库区, 2号和3号采样点代表过渡区, 4号、5号和6号采样点代表主库区, 采样点位区域如图 1所示.分别于2018年9月(秋季)、2018年12月(冬季)、2019年3月(春季)和2019年6月(夏季)用彼得森采泥器采集表层沉积物(0~2 cm), 来研究岗南水库沉积物好氧反硝化菌群时空分布特征.
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图 1 岗南水库沉积物采样点分布示意 Fig. 1 Distribution of sediment sampling sites in Gangnan Reservoir |
沉积物在派森诺生物公司进行微生物群落多样性分析, 基于napA功能基因对24个沉积物样品测序, 用V66F: 5′-TAYTTYYTNHSNAARATHATGTA YGG-3′和V67R: 5′-DATNGGRTGCATYTCNGCCAT RTT-3′对水库的napA基因进行扩增[16].进而分析岗南水库沉积物基于功能基因(napA)的好氧反硝化细菌的群落组成.采用QIIME2对原始数据进行拼接、过滤和去除嵌合体, 得到有效数据, 并将有效序列按照97%的一致性聚类成为OTU, 并采样Nt数据库对OTU进行注释, 用Vsearch进行数据分析.
1.4 测序分析应用Chao1指数、Observed species指数、香农指数(Shannon index)、辛普森指数(Simpson index)、覆盖度(Goods coverage)指数和Pielou指数进行α-多样性分析.在派森诺基因云平台, 根据OTU丰度绘制Venn图[17], 进行物种差异性分析.基于LEfSe分析得到差异物种, 基于随机森林分析筛选标志物种.
1.5 网络分析应用微生物网络可视化分析水源水库沉积物在不同时期好氧反硝化群落演变特征以及筛选出关键物种[18, 19].应用PCoA(Principal co-ordinates analysis)分析关键物种, 研究关键物种组成的相似性和差异性[20].利用置换多因素方差分析(Adonis analysis)研究关键物种在季节和空间分组在统计学上的差异[21].
1.6 数据分析方法使用QIIME2软件对原始数据进行处理.使用ArcGIS软件完成采样图的绘制.数据处理由派森诺基因云平台完成.用Excel软件完成指数相关计算.通过R分析进行微生物网络的构建, 研究物种群落间相互协作关系.
2 结果与分析 2.1 微生物多样性分析 2.1.1 不同季节好氧反硝化细菌群生物多样性分析本研究采用α-多样性来表征好氧反硝化细菌生物多样性.其中Chao1指数和Observed species指数均表征菌群丰富度, 指数越大说明菌群丰度越高.从季节的角度来看(图 2), Chao1指数呈现了一直上升过程, 从春季的2 616.03±164.55上升到夏季的2 623.28±361.52, 上升到秋季的2 690.25±449.72, 继续上升到冬季的2 775.43±211.69. Observed species指数呈现了先下降后上升再下降的过程, 从春季的1 730.05±84.23, 下降到夏季的1 722.18±238.52, 再上升到秋季的1 930.37±259.91, 再下降到冬季的1 885.48±181.76.秋冬季要比春夏季指数高, 表明秋冬季菌群丰富度更高.两个指数均没有显著差异(P>0.05).表征菌群多样性的Shannon指数从季节分布上看, 秋冬季指数高于春夏季, 其中秋季指数最高, 夏季最低, 表明秋季好氧反硝化菌群多样性最多, 夏季最低.Simpson指数在4个季节没有显著差异(P>0.05).说明岗南水库沉积物好氧反硝化菌群在秋季有稳定的生存环境.Goods coverage指数用来评估测序对群落中物种的覆盖度, 4个季节的指数均维持在0.98以上, 表明测序可以很好地覆盖物种信息; Pielou指数表征好氧反硝化菌群的均匀性, 4个季节指数季节差异为: 秋季>冬季>春季>夏季, 说明秋季物种分布最均匀, 反之, 夏季最低.由此可以看出岗南水库好氧反硝化细菌多样性季节演替显著, 且不同库区菌群多样性季节演替存在差异.
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图 2 岗南水库沉积物不同季节好氧反硝化细菌群生物多样性指数 Fig. 2 Microbial community diversity of aerobic denitrification bacteria in different seasons in sediments of Gangnan Reservoir |
水库主库区采样点的Chao1指数变化趋势为: 秋季(2 643.04)>春季(2 624.45)>冬季(2 617.55)>夏季(2 523.19).Observed species指数变化趋势为: 秋季(1 955.27)>冬季(1 742.90)>春季(1 674.47)>夏季(1 640.77).Shannon指数的变化趋势为秋季(7.73)>冬季(7.12)>春季(7.10)>夏季(6.93).Simpson指数变化趋势为秋季>春季>冬季>夏季. Pielou指数显示秋季最高, 夏季最低.说明主库区好氧反硝化菌群在秋季丰富度和多样性均最高, 夏季均最低.主库区的季节演替规律与岗南水库整体季节演替规律有重合点, 都是秋季多样性最高, 夏季最低.
2.1.2 不同空间好氧反硝化细菌群生物多样性分析从空间的角度看(图 3), 过渡区采样点的菌群的Chao1指数和Observed species指数均高于入库区和主库区采样点, 入库区的2 709.66±465.68和1 878.20±291.72上升到过渡区的2 770.83±299.11和1 881.94±187.01, 下降到主库区的2 602.06±252.98和1 753.35±197.72, 说明过渡区菌群丰富度最高, 主库区最低.表征菌群多样性的Shannon指数和Simpson指数均呈现先上升后下降的趋势, 过渡区采样点指数均为最高, 主库区最低.说明岗南水库沉积物过渡区好氧反硝化菌群多样性最高, 主库区最低.Goods coverage指数均维持在0.98以上.表征好氧反硝化菌群的均匀性的Pielou指数, 在过渡区最高, 入库区最低.水库的不同空间位置, 沉积物微生物丰富度和多样性也不同.
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图 3 岗南水库沉积物不同空间好氧反硝化细菌群生物多样性指数 Fig. 3 Microbial community diversity of aerobic denitrification bacteria in different areas in sediments of Gangnan Reservoir |
通过物种注释, 水库水体4个季节24个样品共有9 582个OTU, 主要的门类有10个, 分别为变形菌门(Proteobacteria)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、脊索动物门(Chordata)、放线菌(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia).变形菌门(Proteobacteria)和异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)在不同季节的24个采样点都有出现.其中变形菌门(Proteobacteria)均为优势菌门, 所占比例为86.29% ~99.57%(图 4), 与黄小兰等[22]研究的鄱阳湖河交错带水体细菌群落和王欢等[23]、冯亮等[24]研究的碧流河水库优势菌门的结果一致.从空间分布上看, 变形菌门含量从入库区(93.73%)增长到过渡区(94.75%)再增长到主库区(97.66%), 整体呈递增的趋势.从季节分布上来看, 夏季占比最高为98.12%, 春季最低占94.82%.在纲水平, 主要以β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria和δ-Proteobacteria为主. β-Proteobacteria是最大的纲, 所占比例为39.42% ~51.75%, 其中在入库区的点位, 分别在秋季达到最高值, 在冬季达最低值.从入库区到主库区含量变化呈现先降低后增高的趋势, 整体上含量减少, 入库区含量最高, 过渡区最低.在季节分布上β-Proteobacteria春季含量最高, 冬季最低.第二优势纲为γ-Proteobacteria, 所占比例为7.87% ~20.89%. γ-Proteobacteria从入库区到主库区含量变化呈现先增高后降低的趋势, 整体上水流进入主库区含量降低; 在季节分布上, 春季含量最高, 夏季最低.第三优势纲为α-Proteobacteria, 从入库区到主库区含量呈下降趋势, 水流进入主库区含量呈现最低值; 在季节分布上, 秋季含量最高, 夏季含量最低. 不同季节不同空间微生物的组成不同, 这与环境因素密切相关[25].
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图 4 好氧反硝化菌群门、纲水平群落结构及分布 Fig. 4 Community structure and distribution of aerobic denitrifying bacteria at the phylum and class level |
在属水平(图 5), 陶厄氏菌属(Thauera)为第一优势属, 所占比例为7.02% ~18.84%, 水流在进入水库主库区的过程中, 含量逐渐降低; 季节分布上含量变化趋势为: 春季>夏季>冬季>秋季.第二优势属为贪铜菌属(Cupriavidus), 空间上, 从入库区到主库区, 含量呈递减的趋势, 入库区的1号点位在秋季含量偏高, 占23.65%; 季节分布上的趋势为: 秋季>夏季>春季>冬季, 秋季较其他季节含量明显偏高, 占9.41%.第一、二优势属均从属于β-Proteobacteria.第三优势属为Sutterella, 季节分布上含量变化为: 夏季>冬季>春季>秋季.岗南水库沉积物好氧反硝化菌群结构组成在不同季节不同空间菌群含量均存在差异.
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图 5 好氧反硝化菌群属水平群落结构及分布 Fig. 5 Community structure and distribution of aerobic denitrification bacteria at the genus level |
图 6显示同一空间位置不同季节采样点的OTU种类的差异性.入库区所有采样点中, 4个季节共有的OTU种类为482个, 春季、夏季、秋季和冬季独有的OTU种类为544、700、460和812个.过渡区所有采样点中, 4个季节共有的OTU种类为841个, 春季、夏季、秋季和冬季独有的OTU种类为709、621、1 211和817个.主库区所有采样点中, 4个季节共有的OTU种类为1 162个, 春季、夏季、秋季和冬季独有的OTU种类为683、740、1 202和707个.同一空间位置不同季节采样点共有OTU个数从入库区到过渡区再到主库区逐渐增多, 主库区最多.过渡区4个季节独有的OTU个数偏高.秋季独有的OTU种类在过渡区和主库区采样点均为最高, 在入库区为最低.这与多样性分析结果主库区多样性在秋季最高相一致.夏季和秋季独有的OTU个数在过渡区最高, 在入库区最低.说明夏秋季热分层现象对过渡区好氧反硝化菌群的组成影响较大.综上, 说明岗南水库沉积物好氧反硝化菌群同一位置不同季节分布存在显著差异.
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图 6 岗南水库沉积物在同一位置不同季节OTU分布的Venn分析 Fig. 6 Venn analysis in sediment OTU distribution in the same location in different seasons in Gangnan Reservoir |
图 7显示同一季节不同空间位置采样点的OTU种类的差异性, 春季所有采样点中, 3个位置共有的OTU个数为853个, 入库区、过渡区和主库区独有的OTU个数为494、1 002和1 488个.夏季3个位置共有的OTU个数为884个, 入库区、过渡区和主库区独有的OTU种类为606、846和1 480个; 秋季3个位置共有的OTU个数为776个, 入库区、过渡区和主库区独有的OTU种类为414、1 116和1 694个.冬季3个位置共有的OTU个数为944个, 入库区、过渡区和主库区独有的OTU种类为648、1 010和1 416个.每个季节主库区采样点独有的OTU种类个数均为最多, 入库区均为最少.每个季节不同分区共有的OTU数目, 在冬季最多, 秋季最少.综上, 说明岗南水库沉积物好氧反硝化菌群在同一季节不同空间分布存在显著差异.
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图 7 岗南水库沉积物在同一季节不同位置OTU分布的Venn分析 Fig. 7 Venn analysis in sediment OTU distribution at different locations in the same season in Gangnan Reservoir |
用LEfSe分析岗南水库沉积物中不同分组间好氧反硝化菌群差异性, 研究与物种层级关系相一致的差异物种.其中图 8显示样本群落中从门到属(从内圈到外圈)主要分类单元的分类等级关系.表 1从空间角度显示了岗南水库沉积物好氧反硝化细菌的LEfSe分析LDA得分值, LDA值越高说明该分类单元的差异越显著, 即该菌群对组间差异性贡献越大.
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LDA临界值为2 图 8 岗南水库沉积物好氧反硝化细菌的LEfSe分析 Fig. 8 LEfSe analysis of aerobic denitrifying bacteria in sediments of Gangnan Reservoir |
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表 1 岗南水库沉积物好氧反硝化细菌的LEfSe分析LDA得分值 Table 1 LDA score value of LEfSe analysis of aerobic denitrifying bacteria in sediments of Gangnan Reservoir |
在空间分组中, 入库区采样点分组中差异物种在纲水平的菌群为ε-Proteobacteria; 在目水平的菌群有Alteromonadales、Oceanospirillales和Campylo-bacterales; 在科水平的菌群有Chromatiaceae、Camp-ylobacteraceae、Ferrimonadaceae、Thiobacillaceae、Sphingomonadaceae和Rhizobiaceae; 在属水平的菌群有Oceanithermus、Photobacterium、Thiocystis、Sulfurospirillum、Geobacter、Campylobacter、Sulfuritortus、Novosphingobium、Agrobacterium和Ferrimonas.过渡区采样点分组差异物种为γ-Proteobacteria、Gallionellaceae和Sulfuricella. 主库区采样点分组差异物种为门水平的差异性菌群为Proteobacteria; 目水平的菌群有Nitrosomonadales; 科水平的菌群有Budviciaceae、Comamonadaceae、Rhodocyclaceae、Sutterellaceae和Sterolibacteriaceae; 属水平的菌群有Lysobacter、Serratia、Yangia、Comamonas、Azospira和Sutterella.所有差异物种对组间差异性贡献最大的是主库区中的Proteobacteria, 贡献最低的为入库区的Oceanithermus.其中入库区对组间贡献最大的菌群为Alteromonadales、最小的为Oceanithermus.过渡区中对组间贡献最大的菌群为γ-Proteobacteria, 最低的为Sulfuricella.且γ-Proteobacteria在过渡区对数得分值最高.主库区对组间贡献最大的菌群为Proteobacteria, 最小的为Lysobacter.
在季节分组中, 差异物种出现在夏季和秋季.在夏季分组中在科水平的差异物种为Pectobacteriaceae, 在属水平的差异物种为Pectobacterium.在秋季分组中在科水平的差异物种为Yersiniaceae、Burkholderiaceae, 在属水平的差异物种为Cupriavidus、Salmonella、Rhodopseudomonas和Tardiphaga.所有差异物种对组间差异性贡献最大的为秋季分组中Burkholderiaceae和Cupriavidus, 贡献最低的为秋季分组Tardiphaga.其中贡献最大的科为Burkholderiaceae, 最低的科为Yersiniaceae.贡献最大的属为Cupriavidus, 最低的属为Tardiphaga.从空间分布的水平的LEfSe分析的结果比在季节分布水平的差异物种多, 不同季节、空间分析的差异物种不同.
用随机森林分析寻找不同分组下的标志物种, 从目、科和属这3个分类水平列举了重要性排名靠前的菌群.图 9显示在属水平标志物种的重要性排名.从上到下, 物种对分类模型的重要性依次递减, 其中重要性靠前的物种是组间差异的标志物种.
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柱状图横坐标表示物种对分类模型的重要性打分值, 热图显示了物种在各分组的丰度分布 图 9 岗南水库沉积物好氧反硝化细菌的随机森林分析(属水平) Fig. 9 Random forest analysis of aerobic denitrifying bacteria in sediments of Gangnan Reservoir |
在空间分组中, 在目水平, Cellvibrionales贡献程度最高, 在过渡区含量较高.在科水平Chromatiaceae贡献最高, 在入库区含量最多.在属水平, Comamonas贡献最高, 在主库区含量较多.其中Thiocystis、Sulfuricella、Agrobacterium、Saccharo-phagus、Oceanithermus、Campylobacter、Geobacter、Sulfuritortus、Azospirillum、Salmonella、Laribacter、Cupriavidus、Photobacterium和Ferrimonas在入库区和过渡区含量较高, 主库区含量低. Comamonas在所有空间分组采样点贡献程度最高.
在季节分组中, 在目水平Enterobacterales贡献程度最大, 在春夏季含量较高.在科水平中, Shewanellaceae、Pectobacteriaceae、Yersiniaceae和Methylobacteriaceae贡献程度较高, 其中Shewanellaceae贡献程度最大, 在春季丰度较高. Pectobacteriaceae在春夏季丰度较高, Methylobacteriaceae和Yersiniaceae在秋季含量较高.在属水平Pectobacterium、Shewanella、Sinorhizobium、Salmonell、Edwardsiella、Burkholderia和Pluralibacter贡献程度较高, 即差异解释率较大.其中Pectobacterium贡献程度最高, 其在春季和夏季丰度均较高.在空间分组中和季节分组中, 丰度值的变化均比较显著.结果表明随机森林分析的标志物种与LEfSe分析结果的差异物种有交叉相同的物种, 但差异贡献程度最高物种不同.
2.4 微生物网络分析选取物种(OTU)间的斯皮尔曼相关系数r >0.9, 显著性P < 0.001的物种来构建微生物OTU-OTU网络, 研究岗南水库沉积物好氧反硝化菌物种间的关系, 网络分析结果见表 2, 图 10(a)表示物种间网络模块结构, 图 10(b)表示有关节点的物种分类, 图中节点大小与网络节点的度成比例, 节点与节点间边的颜色显示了物种间的作用关系: 红色为正向关系, 绿色为负向关系, 边的宽度与相关系数r成比例.微生物OTU-OTU网络结果表明显示, 正向边占比大于负向边, 说明岗南水库沉积物好氧反硝化菌群物种间合作关系大于竞争关系[16].模块化值高于0.4认为网络具有模块结构[26], 如图 10(a)划分为9个模块, 即有9个相似的生态位[26].其中模块1占比13.47%, 模块2占比11.78%, 模块3占比11.11%, 模块4占比10.10%, 模块5占比8.75%, 模块6占比6.06%, 模块7占比3.03%, 模块8占比2.69%, 模块9占比33.01%.图 10(b)中未分类的菌群占42.76%、β-Proteobacteria占32.66%、γ-Proteobacteria占13.13%、α-Proteobacteria占10.77%、ε-Proteobacteria占0.34%和δ-Proteobacteria占0.34%.
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表 2 微生物OTO-OTU网络分析结果 Table 2 Microbial OTO-OTU network analysis results |
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图 10 岗南水库沉积物好氧反硝化菌群微生物网络 Fig. 10 Network of aerobic denitrification bacteria in sediments of Gangnan Reservoir |
由节点数据可知占比较高的模块中模块9包括未分类菌群(44.90%)、β-Proteobacteria(29.60%)、α-Proteobacteria(15.30%)和γ-Proteobacteria(10.20%); 模块1包括未分类菌群(47.50%)、β-Proteobacteria(27.50%)、α-proteobacteria(12.50%)和γ-Proteobacteria(12.50%).
基于节点度大于5和中介中心值小于1 000的标准[11], 得到47个关键物种OTU, 分布在模块1中的有7个OTU, 分布在模块2中的有13个OTU, 分布在模块3中的有7个OTU, 分布在模块4中的有7个OTU, 分布在模块5中的有6个OTU, 分布在模块6中的有6个OTU, 分布在模块9中的有1个OTU.关键物种OTU如下: 9、13、14、18、27、30、31、41、43、59、82、91、116、131、167、200、209、215、238、306、310、315、335、351、355、427、459、460、509、518、727、732、749、750、764、864、1 012、1 035、1 073、1 141、1 366、1 512、1 564、1 612、2 331、2 473和3 015.其中分为未分类菌群(44.68%)、β-Proteobacteria(36.17%)、γ-Proteobacteria(12.77%)和α-Proteobacteria(6.38%), 主要有13个属, 分别为Thauera、Azoarcus、Azospira、Azospirillum、Citrobacter、Comamonas、Pseudomonas、Shewanella、Sinorhizobium、Sulfuricella、Sulfuritalea、Thioalkalivibrio和unclassified.除去未分类菌群, Thauera含量最多.
应用PCoA分析对关键物种OTU进一步分析, 根据图 11可知岗南水库沉积物好氧反硝化菌群中47个关键物种在时空分布存在一定差异性, PCoA1和PCoA2分别解释了整体46.62%和9.60%, 总共解释整体的56.22%, PCoA1占主体.不同季节采样点基于Adonis分析(R2=0.120 19, P>0.05)显示季节差异性不明显.不同空间采样点基于Adonis分析(R2=0.559 22, P < 0.001)显示空间分布差异性显著.其中入库区采样点主要分布在第一、三象限, 其中春季采样点主要分布在第一象限, 夏秋冬季主要分布在第三象限.过渡区的采样点主要分布在第一、二和三象限, 其中秋季主要分布在第二象限, 春季分布在第一象限, 夏冬季主要分布在第三象限.主库区采样点主要分布在第二四象限, 其中秋季主要分布在第二象限, 春夏冬季主要分布在第四象限.入库区采样点与过渡区采样点较聚集, 说明关键物种在入库区和过渡区菌群结构有相似性, 与主库区的菌群组成差异性明显.春夏冬季的采样点较聚集, 说明春夏冬季菌群结构相似, 秋季采样点较分散表明秋季采样点菌群结构差异性明显.说明不同空间和不同时间对好氧反硝化菌群中的关键物种有一定的选择性[27].
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图 11 关键物种不同时空主成分分析 Fig. 11 Principal component analysis of key species in different time and space |
从岗南水库入库河口到坝前主库区沉积物中好氧反硝化菌群丰富度和多样性呈现先上升后下降的趋势, 过渡区菌群丰富度和多样性最高.黄小兰等[22]的研究发现鄱阳湖河交汇处细菌比湖区内丰富度高.刘晓丹等[28]的研究发现尼洋河沉积物上游、中游和下游不同河段沉积物微生物差异性明显.陈星等[29]的研究发现三峡水库库中生物多样性指数高于库首和库尾.说明微生物的多样性和丰富度与湖库所处的地理环境和空间位置都有关系, 岗南水库不同的空间位置沉积物好氧反硝化菌群的丰富度和多样性均不同.在季节分布上, 好氧反硝化菌群丰富度和多样性在秋季最高, 其中秋季水库存在热分层现象, 上下层水体物质交换受阻, 会进一步影响到沉积物中微生物的分布及多样性[30].后续可深入探究热分层条件下好氧反硝化菌群垂向分布特征, 为热分层时期水库水质改善提供科学依据.谭八梅等[31]的研究指出海刺参养殖池塘水体菌群秋季丰富度和多样性均为最低, 与本研究结果相反.王欢等[23]的研究指出全年碧流河水库细菌多样性秋季最高, 与本研究的结果一致.菌群的多样性与所处的环境密切相关[31], 所以研究结果各不相同.本文单独对主库区的采样点进行研究, 发现主库区采样点水样好氧反硝化菌群演替规律和水库整体演替规律有重合点, 都是秋季多样性最高, 夏季最低.这与秦宇等[32]在三峡库区中段水体中微生物多样性夏季较低的研究结果一致.说明秋季的水力环境可能更有利于好氧反硝化菌群的繁殖[33].综上, 不同季节和空间均会对好氧反硝化菌群的多样性产生影响.
3.2 好氧反硝化菌群组成的时空分布特征岗南水库的好氧反硝化菌群主要以变形菌门为主, 与白洋淀好氧反硝化菌群组成[34]和密云水库入库河流水体反硝化菌群[35]的研究结果一致, 说明可能淡水湖泊中主要好氧反硝化菌群均为变形菌门[24], 且变形菌门可能与沉积物中含氮有机物等营养物质有紧密关系[36~38]. 变形菌门在氮素消除和有机物的降解中发挥重要作用, 且大部分在厌氧条件下可以进行反硝化[39~42], 是水生态系统污染恢复的重要参与者.Romírez等[43]的研究发现墨西哥湾西北部的表层沉积物中变形菌门受深度、距海岸线的距离和温度溶解氧等影响, 且不同细菌在不同位置占优势, δ-Proteobacteria在内陆架、γ-Proteobacteria在上坡沉积物占优势, 菌群分布受环境影响显著.Tang等[44]的研究发现温度和变形菌门的协同作用可能是厌氧/缺氧/好氧(A2O)污水处理中出水有机物季节变化的机制. Ke等[45]的研究发现长期风化的铝土矿渣处置区中pH和电导率的改变对变形菌门的多样性丰度均有影响, 人类可以干预处置区进行生态重建. 已有研究均表明沉积物中好氧反硝化菌组成结构是与环境相适应的结果.
从空间分布上看, 变形菌门(优势菌门)在主库区含量最高, 从季节分布上来看, 夏季占比最高.与多样性的分布特征有明显差异.在纲水平, 主要以β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria和α-Proteobacteria为主.研究表明变形菌纲包含大多数反硝化菌群[46, 47]. β-Proteobacteria是最大的纲, 入库区含量最高.在季节分布上, 春季含量最高.第二和三优势纲为γ-Proteobacteria和α-Proteobacteria, 3种优势纲中存在可以进行异养或自养反硝化的反硝化菌群[48], 将NO3-最终转化为N2, 在氮循环水质净化过程中扮演着很重要的角色.岗南水库沉积物中存在的主要纲类与国内外研究沉积物反硝化菌群结果一致[49~51].优势属为陶厄氏菌属(Thauera), 其反硝化活性较高[52], 能有效地去除氮素[53, 54], 对有机物有较强的降解能力.第二优势属贪铜菌属(Cupriavidus), 空间上入库区含量最高, 季节分布上秋季较其他季节含量明显偏高.第一、二优势属均从属于β-Proteobacteria.第三优势属为Sutterella, 空间上含量变化与贪铜菌属(Cupriavidus)一致, 季节分布上含量变化为夏季含量最高. Aeromonas(气单胞菌属)能引起鱼类得急性传染病, 对水产养殖业有潜在风险[55].贪铜菌属(Cupriavidus)有异养硝化和好氧反硝化的能力, 可高效利用硝态氮和亚硝态氮, 有一定的耐金属特性, 在处理焦化废水中发挥着重要作用[56].其中Pseudomonas(假单胞菌属)春季含量偏高, 有研究表明, 其对硝酸盐氮有较好的去除效果, 是比较大的反硝化细菌的类群[47]. Aeromonas(气单胞菌属)还被鉴定为具有理想性能的关键反硝化聚磷菌[57].岗南水库沉积物好氧反硝化菌群结构组成在不同季节不同空间菌群含量均存在差异, 与OTU水平的韦恩分析相互印证.
3.3 差异物种与关键物种分析不同季节和不同空间基于LEfSe分析的差异物种不同.随机森林分析得到的标志物种与LEfSe分析的差异物种相互印证, 除差异解释率最大的物种外大部分差异物种和标志物种相同. 本研究结果发现Azospira、Azospirillum、Comamonas、Shewanella、Sinorhizobium和Sulfuricella既是差异物种和标志物种又是关键物种.因此这些菌群在岗南水库好氧反硝化菌群中占重要地位, 在今后应加强对这些菌群的研究.其中Azospira sp. KJ可还原高氯酸盐, 有高效脱氯的效果[58]. Azospirillum lipoferum AL-3可以帮助马铃薯植物对抗早疫病, 从而降低环境污染[59]. Sinorhizobium的存在可以提高畜牧饲料的产量和有效地低温固氮[60]. Comamonas可以降解多环芳烃和杂环芳烃等污染物[61], 对邻-甲醛和对-甲酚也有降解特性[62]. 不同的差异物种、标志物种和关键物种对不同的环境因素适应能力不同, 比如一些菌群与光照和温度相关. Saejung等[63]的研究发现, 不同光照条件可以提高Rhodopseudomonas faecalis PA2的生物量和类胡萝卜素等有价值物质产生. Rhodopseudomonas有较高温度的适应性, 生物产氢速率也得到了提高[64].Zhang等[65]的研究发现Pseudomonas sp. Y39-6在低温条件可去除废水中的硝酸盐. Adyasari等[66]的研究发现海底地下水中的Burkholderiaceae主要存在于低盐度样品中.不同环境因素会造成差异物种、标志物种和关键物种的不同. 综上, 不同空间、不同季节和各种环境因素都会引起水库沉积物好氧反硝化菌群组成的改变, 进而对水库水质演变产生影响.基于差异物种和关键物种的解析, 可以为将来研究水库微生物驱动的氮素循环提供必要的数据支持.
4 结论(1) α-多样性分析显示从季节分布上看, 秋冬季菌群丰富度和多样性均较高, 其中秋季好氧反硝化菌群多样性最高; 从空间上看, 过渡区的好氧反硝化菌群丰富度和多样性均为最高.岗南水库好氧反硝化细菌的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria), 所占比例为86.29% ~99.57%.在纲水平, 主要以β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria和α-Proteobacteria为主.第一优势属为陶厄氏菌属(Thauera).
(2) Venn图显示岗南水库沉积物好氧反硝化菌群时空分布存在显著差异.LEfSe分析显示在季节分组中, 差异物种出现在夏季和秋季.所有差异物种对组间差异性贡献最大的为秋季分组中Burkholderiaceae和Cupriavidus, 贡献最低的为秋季分组的Tardiphaga.在空间分组中, 所有差异物种对组间差异性贡献最大的为主库区的Proteobacteria, 贡献最低的为入库区的Oceanithermus.随机森林分析显示在季节分组中, Pectobacterium贡献程度最高, 差异解释率最大, 其在春季和夏季丰度均较高.在空间分组中, Comamonas贡献程度最高, 在主库区丰度较高.
(3) 网络分析显示好氧反硝化菌群物种间合作关系大于竞争关系.得到47个关键物种OTU, 已分类的菌群中Thauera含量最多.应用主成分分析对关键物种进一步分析表明, 关键物种中秋季采样点菌群组成与其他季节差异性明显, 而春季、夏季和冬季菌群组成有一定的相似性.主库区关键物种采样点菌群组成与入库区和过渡区差异性明显.
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