李家河水库春季分层期<i>nirS</i>型反硝化菌群特征分析

引用本文

梁伟光, 黄廷林, 张海涵, 杨尚业, 刘凯文, 李程遥, 温成成, 李伟涛, 蔡晓春. 李家河水库春季分层期nirS型反硝化菌群特征分析[J]. 环境科学, 2022, 43(1): 306-313.

LIANG Wei-guang, HUANG Ting-lin, ZHANG Hai-han, YANG Shang-ye, LIU Kai-wen, LI Cheng-yao, WEN Cheng-cheng, LI Wei-tao, CAI Xiao-chun. Characteristic Analysis of nirS Denitrifying Bacterial Community in Lijiahe Reservoir During Stratification[J]. Environmental Science, 2022, 43(1): 306-313.

李家河水库春季分层期nirS型反硝化菌群特征分析

梁伟光^1,2, 黄廷林^1,2, 张海涵^1,2, 杨尚业^1,2, 刘凯文^1,2, 李程遥^1,2, 温成成^1,2, 李伟涛³, 蔡晓春³

1. 西安建筑科技大学环境与市政工程学院, 西北水资源与环境生态教育部重点实验室, 西安 710055;
2. 西安建筑科技大学环境与市政工程学院, 陕西省环境工程重点实验室, 西安 710055;
3. 李家河水库管理有限公司, 西安 710016

收稿日期: 2021-04-05; 修订日期: 2021-06-02

基金项目: 国家重点研发计划项目（2019YFD1100101）；国家自然科学基金项目（51979217）；陕西省重点研发计划项目（2019ZDLSF06-01，2019ZDLSF06-02）

作者简介: 梁伟光(1997~), 男, 硕士研究生, 主要研究方向为水源水环境修复与水质改善, E-mail: liangweiguang@xauat.edu.cn

通信作者: 黄廷林, E-mail: huangtinglin@xauat.edu.cn

摘要: 为探究水源水库春季分层期（3~5月）nirS型反硝化细菌群落结构组成及其与水质的关系，以李家河水库为例，采用原位监测耦合Illumina高通量测序技术，分析了水体水质及反硝化细菌群落相对丰度及结构特征.结果表明：①通过高通量测序，鉴定为4门13属，优势菌门为变形菌门（Proteobacteria），相对丰度在52.5%~70.6%，时间尺度总体呈降低趋势（P < 0.05），空间尺度上表层和中层高于底层（P < 0.05），表层与中层无差异（P>0.05）；识别出具有反硝化功能细菌8属，其中优势菌属（相对丰度>1%）为脱氯单胞菌属（Dechloromonas）和假单胞菌属（Pseudomonas），脱氯单胞菌属相对丰度在时间上呈先降低后升高的趋势，假单胞菌属在时间上呈先升高后降低的趋势，此2属在空间上无差异（P>0.05）；细菌多样性及丰富度变化基本一致，时间上呈先升高后减低的趋势，空间上随深度逐渐升高；②本研究期间水库水体ρ（总氮）为2.35~2.91 mg·L^-1，氮素污染较为严重，3月和4月垂向水体总氮基本一致且呈降低趋势，5月ρ（总氮）高于3月和4月且表层最高；③冗余分析（RDA）表明，主要驱动因素为水温、溶解氧、硝氮和氨氮，且氨氮与脱氯单胞菌属呈明显负相关.综上，通过对水源水库nirS型反硝化群落以及其影响因素的研究，有助于解析微污染水源水库反硝化细菌的群落变化特征，可对未来水源水体氮污染生物修复提供理论研究依据.

关键词: 李家河水库氮污染 nirS型反硝化细菌 Illumina高通量测序 RDA分析

Characteristic Analysis of nirS Denitrifying Bacterial Community in Lijiahe Reservoir During Stratification

LIANG Wei-guang^1,2 , HUANG Ting-lin^1,2 , ZHANG Hai-han^1,2 , YANG Shang-ye^1,2 , LIU Kai-wen^1,2 , LI Cheng-yao^1,2 , WEN Cheng-cheng^1,2 , LI Wei-tao³ , CAI Xiao-chun³

1. Key Laboratory of Northwest Water Resource, Environment and Ecology, Ministry of Education, School of Environmental and Municipal Engineering, Xi'an University of Architecture and Technology, Xi'an 710055, China;
2. Shaanxi Key Laboratory of Environmental Engineering, School of Environmental and Municipal Engineering, Xi'an University of Architecture and Technology, Xi'an 710055, China;
3. Lijiahe Reservoir Management Co., Ltd., Xi'an 710016, China

Abstract: To explore the composition of the nirS denitrifying bacterial community during stratification in spring(March to May) in a drinking water reservoir and its relationship with water quality, the water quality and relative abundance and structure of the denitrifying bacterial community were analyzed using in-situ monitoring coupled with Illumina high-throughput sequencing technology in the Lijiahe Reservoir. The results showed that: ① through high-throughput sequencing, 4 phyla and 13 genera were identified. The dominant bacterial phylum was Proteobacteria, and its relative abundance was between 52.5% and 70.6%. The overall trend of the relative abundance of Proteobacteria decreased on the time scale (P < 0.05), and its relative abundance in the surface and middle layers was higher than that of the bottom layer on the spatial scale (P < 0.05). There was no difference in the proportion of Proteobacteria between the surface and middle layers (P>0.05), and the abundance of its bottom layer was relatively stable; eight genera of bacteria with denitrification function were identified, among which the dominant bacterial genera (relative abundance>1%) were Dechloromonas and Pseudomonas. The relative abundance of Dechloromonas showed a trend of first decreasing and then increasing on the time scale, whereas the relative abundance of Pseudomonas showed a trend of increasing first and then decreasing on the time scale. There were no differences on the spatial scale between these two genera (P>0.05); the changes in bacterial diversity and abundance were basically similar, with a trend of first increasing and then decreasing on the time scale. The highest diversity and abundance of the bacterial community gradually increased with increasing depth on the spatial scale. ② ρ(TN) of the reservoir during stratification was 2.35-2.91 mg·L^-1, and the nitrogen pollution was more serious. In March and April, ρ(TN) on the vertical scale was basically similar and showed a decreasing trend. In May, the content of total nitrogen was higher than that in March and April, and the highest value of total nitrogen content occurred in the surface layer. ③ Redundancy analysis showed that water temperature, dissolved oxygen, nitrate, and ammonia nitrogen were the main driving factors, and ammonia nitrogen showed a significantly negative correlation with Dechlormonas. In summary, the study of nirS-type denitrification communities and related influencing factors will contribute to analyzing the characteristics of denitrifying bacterial community changes in a micro-polluted drinking water reservoir and provide a theoretical research basis for the biological remediation of nitrogen pollution in such reservoirs in the future.

Key words: Lijiahe Reservoir nitrogen pollution nirS denitrifying bacteria Illumina high-throughput sequencing RDA analysis

鉴于地下水污染的日趋严重, 水库水体已取代地下水成为我国的主供水水源^[1].然而, 在点源污染得到控制的背景下, 面源污染引起的水体富营养化问题依然突出, 尤其是水库高氮现象普遍^[2].水体高氮可能诱发藻类水华及微生物活性降低, 引发水体生态恶化^[3].因此, 水体水质变化及其相关脱氮反硝化微生物的研究, 对于解析水源水库水体氮代谢相关过程及原位控制具有重要价值.

近年来, 随着高通量测序技术的快速发展及应用, 该研究领域取得了部分进展^{[4, 5]}, 主要的研究方向为反硝化微生物的筛选、反硝化基因的识别、反硝化微生物群落的演替特征及驱动因素分析^[6~8].Zhou等^[9]采用高通量测序研究了周村水库人工强制混合期总氮削减过程中微生物群落结构变化, 结果表明研究期水体细菌多样性显著增强, 识别出反硝化细菌(含nirS基因), 其种群结构主要受温度、总氮和溶解氧等影响.康鹏亮等^[10]对西安典型景观水体nirS型反硝化菌种群结构进行了研究, 结果表明不同水体反硝化细菌种属差异显著, 其种群结构受不同水质指标综合调控.杨文焕等^[11]对南海湖沉积物nirS型反硝化微生物的群落进行研究, 结果发现优势菌属红杆菌属(Rhodobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas)主要受硝氮和亚硝氮影响.综上, 水体反硝化细菌群落的研究主要集中于景观水体及沉积物, 该领域针对水源水库研究较少, 尤其是分层过程该菌群演替及驱动机制鲜见报道.此外, 水源水体菌群演替机制的研究尽管可解析其核心驱动因子, 但菌群功能的识别对于源水型水体水质污染形态转化, 解构水体污染及自净成因显得更为重要, 遗憾的是, 细菌功能分析主要局限于实验室尺度, 原位水体细菌功能的分析报道有限.

李家河水库属于峡谷深水分层型水库, 该水库布设扬水曝气水质改善系统, 属人工干预型水库, 11月~翌年3月为完全混合状态, 6~10月为人工强制混合状态(系统运行), 3~5月为分层形成期, 作为完全混合状态与人工强制混合状态的中间过渡, 该时期由于桃花汛短时高氮输入和水体升温, 可能诱发反硝化菌群的代谢活性发生巨变, 具有重要研究价值.因此, 本文对李家河水库分层期垂向水体水质及微生物开展连续监测, 基于Illumina高通量测序技术识别好氧反硝化菌群, 探究其结构和多样性变化, 通过网络图分析(Network)及冗余分析(RDA)探究菌群间及菌群与环境因子间的关系, 以期为下一步水源水库水体高效反硝化脱氮菌群驯化及原位脱氮提供实验材料和理论依据.

1 材料与方法 1.1 研究区域概况与水样采集

李家河水库坐落于西安市蓝田县境内, 是西安市重要的供水水源之一, 兼具发电和防洪等功能.总库容为5 690万m³, 年平均供水量为7.7×10⁷ m³, 最大水深77 m, 平均水深56 m, 供水设计流量3.2 m³·s^-1^[12].

本研究取样点设置在坝前S1点(图 1), S1采样点为水库最深处且存在明显的季节分层特征(温跃层识别梯度为0.2℃·m^-1^[12], 本研究期间, 3~5月温跃层分别为3.82~8.54、3.17~12.2和4.04~1.65 m), 可反映主库区水质及微生物变化, 具有研究代表性.

图 1 李家河水库采样点位置示意 Fig. 1 Location of sampling site in Lijiahe Reservoir

1.2 水样采集及测定

本研究于2019年3~5月中旬对李家河水库进行采集, 采用2.5 L有机玻璃采样器获得不同深度水样, 即表层(水下0.5 m)、中层(斜温层)和底层(沉积物以上0.5 m)装入经过稀盐酸浸泡且超纯水预清洗的聚乙烯瓶中, 采集完成后立即送回实验室, 测定水质及细菌指标.

现场测定水温、pH、溶解氧(DO)和浊度(Turbidity)等指标(DS5X便携式分析仪, 美国HACH公司)^[13], 总氮(TN)、硝氮(NO₃^--N)、氨氮(NH₄⁺-N)、高锰酸盐指数、总磷(TP)、铁(Fe)和锰(Mn)的测定均参照文献[14]的方法, 溶解性有机碳(DOC)采用日本岛津TOC分析仪测定.此外, 水体取1 000 mL的水样用0.22 μm微孔滤膜过滤, 滤后样品置于无菌离心管, 保存于-20℃冰箱, 便于后续高通量测序.

1.3 水体反硝化细菌群落结构测定 1.3.1 微生物总DNA提取

采用E.Z.N.A.^® soil基因组提取试剂盒(Water DNA Kit, Omega, USA)提取滤膜中DNA.利用1%琼脂糖凝胶电泳对抽取的DNA进行检测, 并用Nano Drop 2000(美国)测定DNA的浓度, 保存在-20℃冰箱待用^[15].

1.3.2 Illumina高通量测序

本研究采用Illumina MiSeq测序技术分析了李家河水库nirS型反硝化细菌群落种群结构的时空分布特征, 将样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量DNA测序.反硝化细菌的nirS功能基因扩增引物为Cd3a F/R3cdR.PCR扩增体系(20 μL)为: DNA模板10 ng、FastPfu缓冲液4 μL、dNTPs 2 μL(2.5mmol·L^-1)、FastPfu聚合酶0.4 μL、Forward Primer引物0.8 μL(5 μmol·L^-1)、Reverse Primer引物0.8 μL(5 μmol·L^-1)、用ddH₂O补充至20 μL. 扩增条件如下: 预变性3 min (95℃), 变性30 s (95℃), 退火30 s (55℃), 延伸45 s(72℃), 循环30次, 终延伸10 min(72℃)^[16].全部样本按照上述实验条件进行, 每个样本3个重复(n=3).

1.4 数据处理

高通量测序完成后, 用Fast QC软件对nirS功能基因测序的原始数据进行质量控制, 去除低质量序列.通过QIIME进行处理得到优质序列的nirS功能基因序列扩增长度^[16].将高质量的扩增序列数据通过(Sequence Read Archive, SRA)数据库对所得数据进行比对, 根据分类注释结果对物种组成分类, 去除丰度小于0.001的数值, 在97%相似水平下归类为操作分类单元(OTUs).然后通过Mothur软件对OTU聚类分析结果解析nirS型反硝化细菌种群多样性指数, 进而进行物种组成和结构分析^[16].

采用Excel 2016进行数据处理, Origin8.0软件进行图形绘制与分析, 利用R语言(4.0.2)和Gephi软件通过共生网络(Network)评估不同菌属间的共生关系及其与环境因子之间的相关性^[13], 利用Canoco5.0软件进行冗余分析(RDA)解析反硝化细菌群落结构与李家河水库不同月份水源水体水质参数之间的相关性^[9].

2 结果与分析 2.1 水体水质参数

表 1为李家河水库水质参数时空变化.从中可知, 李家河水库不同月份水体水质均存在差异, 3、4和5月采样期间, 水温逐渐升高, 垂向呈现差异, 水体分层出现, 总体在4.28~16.08℃之间; ρ(DO)呈降低趋势, 在7.08~12.85 mg·L^-1之间变化, 未出现厌氧现象; pH值变化范围在7.32~8.46之间, 水体基本呈中性.水体ρ(TN)和ρ(NO₃^--N)在研究期间呈先降低后增加的趋势, 3~4月垂向基本一致, 5月为: 中层>底层>表层. 3~5月每月平均ρ(TN)分别为(2.40±0.03)、(2.38±0.17)和(2.44±0.07)mg·L^-1. ρ(NH₄⁺-N)、ρ(高锰酸盐指数)、ρ(TP)和ρ(DOC)在研究期呈降低趋势, 垂向差异不大. ρ(Fe)和ρ(Mn)受降雨径流及分层双重影响, 时空差异大, 浊度变化对此有所印证.综上所述, 李家河水库在3~5月水质均较差, 尤其总氮超过2.0 mg·L^-1.

表 1 李家河水库水质参数时空变化 Table 1 Spatial and temporal variation in water quality parameters in Lijiahe Reservoir

水质参数	3月			4月			5月
水质参数	表层	中层	底层	表层	中层	底层	表层	中层	底层
水温/℃	7.00±0.78	4.59±0.43	4.28±0.08	13.76±1.41	5.69±1.40	5.13±0.04	16.08±1.82	5.84±1.22	5.41±2.14
ρ(DO)/mg·L^-1	12.85±0.24	11.27±0.87	9.26±0.74	12.52±0.72	9.87±0.21	9.30±0.25	10.13±2.06	7.08±0.48	7.09±1.48
pH	8.03±0.30	7.47±0.07	7.32±0.04	8.27±0.12	7.90±0.11	7.77±0.01	8.46±0.54	7.73±0.14	7.74±0.01
ρ(TN)/mg·L^-1	2.42±0.07	2.40±0.09	2.37±0.06	2.40±0.08	2.38±0.13	2.35±0.09	2.91±0.08	2.52±0.012	2.42±0.09
ρ(NO₃^--N)/mg·L^-1	2.27±0.00	2.27±0.01	2.27±0.00	2.17±0.01	2.16±0.02	2.14±0.00	2.71±0.02	2.42±0.08	2.3±0.07
ρ(NH₄⁺-N)/mg·L^-1	0.04±0.00	0.05±0.01	0.04±0.00	0.03±0.00	0.05±0.01	0.05±0.00	0.02±0.00	0.02±0.00	0.03±0.01
ρ(高锰酸盐指数)/mg·L^-1	2.74±0.18	2.21±0.11	2.86±0.09	2.47±0.17	2.56±0.04	2.72±0.08	2.12±0.16	2.04±0.14	2.20±0.12
ρ(TP)/mg·L^-1	0.06±0.02	0.05±0.01	0.07±0.03	0.03±0.01	0.03±0.00	0.03±0.00	0.02±0.00	0.02±0.00	0.05±0.01
ρ(DOC)/mg·L^-1	3.02±0.15	3.19±0.09	2.84±0.00	2.79±0.08	3.15±0.13	2.9±0.06	1.16±0.04	1.17±0.15	1.34±0.09
浊度/NTU	11.90±0.26	10.79±0.49	12.45±0.35	3.88±0.13	4.16±0.36	7.10±0.85	2.67±0.12	4.36±1.52	8.65±0.00
ρ(Fe)/mg·L^-1	0.01±0.01	0.01±0.00	0.01±0.00	0.01±0.01	0.02±0.01	0.01±0.00	0.03±0.07	0.04±0.08	0.04±0.09
ρ(Mn)/mg·L^-1	0.01±0.00	0.01±0.01	0.01±0.00	0.01±0.00	0.01±0.00	0.01±0.00	0.01±0.08	0.01±0.09	0.05±0.10

表 1 李家河水库水质参数时空变化 Table 1 Spatial and temporal variation in water quality parameters in Lijiahe Reservoir

2.2 水体反硝化细菌群落多样性及结构变化 2.2.1 水体反硝化细菌群落多样性

表 2为李家河水库水体反硝化菌群多样性指数变化.从中可知, 高通量覆盖率高于99%, 可有效反映反硝化菌群测序深度.春季分层期间, OTUs数目时间尺度上变化较明显, 呈先升高后降低的趋势(4月＞5月＞3月), 垂向上底层最高, 表层最低; 多样性指数(Shannon指数和Simpson指数)时空变化趋势同OTUs一致, 即: 4月＞5月＞3月, 垂向底层>中层>表层; 丰富度指数(Ace指数和Chao1指数)进一步印证了OTUs及多样性研究结果.

表 2 李家河水库水体反硝化菌群多样性指数解析¹⁾ Table 2 Analysis of the denitrifying community diversity index in Lijiahe Reservoir

月份	水深	OTUs	Shannon指数	Simpson指数	Ace指数	Chao1指数	覆盖率/%
3	表层	617	4.42(4.42, 4.39, 4.45)	0.24(0.24, 0.24, 0.24)	653(650, 637, 671)	664(659, 640, 696)	99.64
	中层	748	4.64(4.64, 4.61, 4.67)	0.19(0.19, 0.19, 0.19)	783(781, 768, 801)	781(777, 763, 802)	99.67
	底层	953	5.72(5.72, 5.70, 5.74)	0.11(0.11, 0.11, 0.11)	1 009(989, 1 006, 1 032)	1 021(1 016, 992, 1 055)	99.39
4	表层	922	5.76(5.76, 5.74, 5.78)	0.12(0.12, 0.12, 0.12)	986 (983, 964, 1 011)	991(987, 963, 1 025)	99.17
	中层	923	5.78(5.78, 5.76, 5.81)	0.12(0.12, 0.12, 0.12)	1 002(999, 977, 1 031)	1 024(1 019, 985, 1 070)	99.11
	底层	1012	5.84(5.84, 5.82, 5.86)	0.08(0.08, 0.08, 0.08)	1 080(1 078, 1 058, 1 106)	1 093(1 088, 1 060, 1 131)	99.29
5	表层	640	5.58(5.58, 5.56, 5.60)	0.23(0.23, 0.23, 0.22)	666(663, 653, 681)	680(675, 657, 709)	99.65
	中层	1020	5.92(5.92, 5.90, 5.94)	0.08(0.08, 0.08, 0.09)	1 073(1 071, 1 054, 1 095)	1 077(1 073, 1 052, 1 106)	99.43
	底层	1015	5.75(5.75, 5.73, 5.78)	0.08(0.07, 0.08, 0.08)	1 214(1 210, 1 166, 1 266)	1 230(1 266, 1 223, 1 165)	99.05
1)括号内为平行样数据(n=3)

表 2 李家河水库水体反硝化菌群多样性指数解析¹⁾ Table 2 Analysis of the denitrifying community diversity index in Lijiahe Reservoir

2.2.2 李家河水库水体nirS型反硝化细菌群落组成

图 2为李家河水库水体门水平nirS型反硝化群落组成.从中可知, 共获得4门, 除未分类菌门(unclassified)外, 主要为变形菌门(Proteobacteria), 不同月份水体的nirS型反硝化细菌种群结构具有相似性.本研究期间, 变形菌门占绝对优势, 表层水体随着时间变化优势作用逐渐降低, 在3月和5月分别占70.57%和52.06%, 中层呈先降低后缓慢上升趋势, 底部变化平缓.

(a)所有菌门相对丰度; (b)candidate division NC10门相对丰度的局部放大图图 2 李家河水库水体nirS型反硝化群落门水平结构组成 Fig. 2 Composition of nirS denitrifying community at the phylum level in Lijiahe Reservoir

热图(Heatmap)反映出不同月份水体nirS型反硝化细菌群落属水平细菌的组成和差异, 如图 3所示, 反硝化细菌主要归为13个属, 除未分类菌属(unclassified)外, 主要包括脱氯单胞菌属(Dechloromonas)和假单胞菌属(Pseudomonas)等. 3月和4月脱氯单胞菌属(Dechloromonas)均在表层水体占优势, 分别为10.70%和5.75%, 于5月中层水体占比最高, 为7.74%, 不同月份丰度变化较为明显, 但不同月份各层水体其丰度均较高. 4月假单胞菌属(Pseudomonas)丰度[(1.69±0.27)%]较3月[(0.21±0.15)%]显著升高.

图 3 李家河水库水体优势反硝化菌群热图 Fig. 3 Heatmap of dominant denitrifying communities in Lijiahe Reservoir

此外, 春季分层期李家河水库不同深度水体的反硝化细菌种群结构存在显著差异. 3、4和5月在水体中分别发现了红杆菌属(Rhodobacter)、陶厄氏菌属(Thauera)和红长命菌属(Rubrivivax)的存在.另外, unclassified占比较高, 可能具有反硝化功能, 需进一步研究.

为评估水库水体中的反硝化群落属水平细菌间直接或间接作用, 通过共生网络分析推断微生物共生模式, 表 3为共生网络分析计算参数, 图 4为共生网络分析.通过共生网络关系发现, 水库3~5月的群落组成网络分析共11点(属), 被划分为4个模块, 由4种不同的颜色表示.模块Ⅱ、模块Ⅲ和模块Ⅳ中各菌属之间均呈正相关; 模块Ⅰ中脱氯单胞菌属(Dechloromonas)与假单胞菌属(Pseudomonas)有很强的负相关, 其他菌属均呈较强的正相关.以上结果表明, 李家河水库水体nirS型反硝化落群存在不同层次上的共生现象.

表 3 水体反硝化细菌菌属网络分析参数 Table 3 Network analysis calculation parameters of the denitrifying bacterial genera in Lijiahe Reservoir

图 4 基于Spearman相关显著性分析反硝化菌属共生网络分析 Fig. 4 Network of co-occurring denitrifying bacterial genera based on Spearman's correlation significance analysis

2.3 菌属与环境因子关系分析

如图 5所示, 选取反硝化细菌群落与主要水质参数开展RDA分析, 前两主轴可以解释李家河水库反硝化细菌群落总变异的89.08%, 轴1(RDA1)和轴2(RDA2)解释率分别为68.90%和20.18%, 该模型有效反映水质与好氧反硝化菌群的关系.从中可知, 水温、DO、DOC和pH是驱动nirS型反硝化菌群演替的主要环境因子, 其次为NH₄⁺-N和TN等.此外, 脱氯单胞菌属(Dechloromonas)与TN和NO₃^--N呈负相关, 与TP和NH₄⁺-N呈正相关; 水温、pH和DO是红杆菌属(Rhodobacter)及假单胞菌属(Pseudomonas)的主影响因子. 3月中层和底层反硝化种群结构相似度较高, 主要受浊度和TP的调控, 与表层反硝化种群结构差异较大. 4月表层和中层反硝化种群结构受水温、pH和DO的显著影响.另外, TN、水温和pH对5月表层反硝化种群结构影响较大.

图 5 李家河水库反硝化细菌种群的RDA分析 Fig. 5 RDA analysis of decertifying bacterial communities in Lijiahe Reservoir

3 讨论 3.1 反硝化菌群的识别及功能分析

目前, 对好氧硝化菌群的研究多集中于实验室的筛选.Zhang等^[17]的研究分离筛选出1株好氧反硝化菌Paracoccus versutus KS293, 对TN的去除率为82%, 无亚硝氮的积累.李思琦等^[18]的研究在垃圾渗滤液中成功分离筛选出好氧反硝化菌Achromobacter sp. L16属, 在碳氮比为20 ∶1条件下, NH₄⁺-N和TN的去除率分别为61.94%和98.40%.目前被识别的好氧反硝化菌有50余属, 130余种, 其中包括普遍存在的假单胞菌属(Pseudomonas)和副球菌属(Paracoccus)等^[19].

本研究对属水平下细菌进行功能性分析, 结果见表 4.从中可知, 已知具有反硝化功能细菌共8属, 优势菌属脱氯单胞菌属(Dechloromonas, 隶属变形菌门)和红杆菌属(Rhodobacter, 隶属变形菌门)呈先降低后升高的趋势, 假单胞菌属(Pseudomonas)呈先升高后降低的趋势.好氧反硝化菌属通过亚硝酸盐还原酶基因(nirS)实现亚硝酸盐的还原(好氧反硝化过程的制约步骤), 有效提高了好氧反硝化脱氮效率^[10].假单胞菌属(Pseudomonas)^[11]、红杆菌属(Rhodobacter)^[20]和红长命菌属(Rubrivivax)^[10]是典型的反硝化脱氮细菌, 其余菌属占比虽然不高, 对水体反硝化脱氮也发挥着不可替代的作用^[21], 但其驱动机制需进一步分析.

表 4 水体nirS型细菌功能性分析 Table 4 Functional analysis of nirS bacteria in Lijiahe Reservoir

菌属	主要功能	所占比例/%
		3月			4月			5月
		表层	中层	底层	表层	中层	底层	表层	中层	底层
Dechloromonas(脱氯单胞菌属)	反硝化和有机物降解^[22]	10.72±0.75	8.96±0.96	8.99±0.82	5.83±1.23	5.76±1.14	4.53±0.81	6.96±1.29	7.74±1.03	7.64±0.58
Pseudomonas(假单胞菌属)	反硝化^[11]	0.07±0.03	0.06±0.03	0.51±0.11	1.44±0.57	1.63±0.48	1.99±0.82	1.22±0.73	0.19±0.05	0.12±0.04
Rhodobacter(红杆菌属)	反硝化和有机物降解^[20]	0.74±0.05	0.15±0.07	0.25±0.14	0.17±0.09	0.04±0.02	0.08±0.04	0.66±0.11	0.34±0.07	0.08±0.03
Rhodanobacter(产黄杆菌属)	有机物降解^[23]	0.17±0.04	0.21±0.08	0.08±0.02	0.02±0.01	0.03±0.01	0.06±0.01	0.32±0.11	0.13±0.03	0.19±0.06
Magnetospirillum(磁螺菌属)	有机物降解^[24]	0.05±0.03	0.06±0.01	0.06±0.01	0.11±0.05	0.06±0.01	0.16±0.13	0.11±0.01	0.26±0.10	0.09±0.02
Simplicispira(简单螺旋形菌属)	反硝化^[25]	0.00±0.00	0.00±0.00	0.05±0.01	0.00±0.00	0.00±0.00	0.01±0.02	0.00±0.00	0.00±0.00	0.02±0.01
Candidatus Accumulibacter属	反硝化除磷^[26]	0.00±0.00	0.02±0.01	0.02±0.00	0.00±0.00	0.00±0.00	0.01±0.01	0.00±0.00	0.00±0.00	0.00±0.00
Candidatus Methylomirabilis属	厌氧氨氧化^[27]	0.01±0.00	0.00±0.00	0.00±0.00	0.01±0.00	0.00±0.00	0.03±0.01	0.01±0.01	0.03±0.01	0.00±0.00
Rubrivivax(红长命菌属)	反硝化^[10]	0.00±0.00	0.02±0.01	0.02±0.01	0.05±0.02	0.00±0.00	0.02±0.01	0.54±0.16	0.49±0.11	0.04±0.01
Thauera(陶厄氏属)	反硝化^[28]	0.03±0.01	0.00±0.00	0.00±0.00	0.03±0.01	0.01±0.01	0.02±0.01	0.02±0.01	0.00±0.00	0.00±0.00
Brachymonas(短单胞杆菌属)	反硝化^[25]	0.00±0.00	0.00±0.00	0.00±0.00	0.02±0.01	0.00±0.00	0.00±0.00	0.00±0.00	0.00±0.00	0.02±0.01

表 4 水体nirS型细菌功能性分析 Table 4 Functional analysis of nirS bacteria in Lijiahe Reservoir

3.2 反硝化菌群的演替机制

好氧反硝化菌群演替的驱动因子主要包括温度、DO、氮类营养盐和有机质等^[29].温度主要通过影响微生物酶的活性控制微生物生长和代谢; ρ(DO)主要通过3个方面影响反硝化细菌的脱氮: ①和硝酸盐竞争电子; ②抑制反硝化过程酶的合成; ③抑制硝酸盐的还原^[30].现有的研究中, Liu等^[31]的研究发现中性或偏碱性条件有利于反硝化细菌的增值. 鲍林林等^[32]的研究发现北运河沉积物中温度、NO₃^--N和pH是反硝化菌群的主要影响因子. Zhou等^[2]对周村水库春季好氧反硝化菌群的研究发现, 温度、DO和NO₃^--N是氮循环细菌组成的重要影响因素.与上述研究基本一致, 本研究发现温度、DO和氮类营养盐(尤其是NO₃^--N和NH₄⁺-N)塑造了好氧反硝化菌群结构及多样性.

本研究中, 优势菌门为变形菌门, 含脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、红杆菌属(Rhodobacter)和红长命菌属(Rubrivivax)等, 均具有好氧反硝化功能.水温是变形菌门变化的首要驱动因子^[33], 本研究对此有所印证, 即随表层水温的增加, 变形菌门优势作用降低; 因底部水温变化缓慢, 其相对丰度基本无差异(图 2), RDA显示了水温对红长命菌属(Rubrivivax)的重要影响(图 5), 同样的现象在北海湖微生物群落演替特征研究中得到证实^[33].DO是好氧反硝化过程重要的电子供体, 表层DO高于中下层, 红杆菌属(Rhodobacter)相对丰度与其变化趋势基本一致, RDA分析证实了DO与红杆菌属(Rhodobacter)呈现高的相关性(图 5), 这与钊珍芳^[34]的研究结果一致.其次, 李家河水库TN主要来源于NO₃^--N和NH₄⁺-N, 其为好氧反硝化菌属代谢生长提供了氮类营养盐, 如脱氯单胞菌属(Dechloromonas)总体上表层高于底层, 随时间呈降低趋势, 其与NH₄⁺-N变化趋势一致, 呈现正相关(图 5); 红长命菌属(Rubrivivax)与NH₄⁺-N呈负相关, 与NO₃^--N呈正相关关系(图 5), 康鹏亮等^[10]和张艺冉等^[16]对水体nirS型反硝化菌群结构报道证实了以上分析.

多样性是菌群结构演替的映射, 本研究发现底层水体好氧反硝化多样性高于表层水体, Yang等^[35]对金盆水库微生物菌群结构研究中发现, 等温层水体反硝化细菌多样性明显高于变温层, 底部ρ(DO)低于表层, 这是因为低ρ(DO)更有利于反硝化的进行. 3~5月, 菌群多样性呈升高趋势(表 2), 暗示该时期水温的升高是多样性的主要驱动因素, Zhang等^[15]的研究也报道了水温对反硝化菌群多样性的重要影响.

综上所述, 李家河水库分层形成期不同深度水体好氧反硝化菌群有明显差异, 菌群演替特征与水温、DO和氮类营养盐等因素紧密相关, 本研究仅讨论了已识别功能菌属与环境因子的重要关系, 遗憾的是, 尚有诸多未分类菌属, 其功能有待研究, 这可能为解析水体氮类变化和丰富好氧反硝化研究提供重要思路, 有待深化.

4 结论

(1) 春季分层期间, 李家河水库不同月份水体水质均存在显著性差异, 水温逐渐升高, 水体分层出现; ρ(TN)呈先降低后增加的趋势; ρ(DOC)、ρ(NH₄⁺-N)和ρ(TP)在研究期总体呈降低趋势, 垂向差异不大.

(2) 通过高通量测序, 本研究共获得4门13属细菌, 优势菌门为变形菌门; 已识别8属具有好氧反硝化功能, 主要含脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)和红杆菌属(Rhodobacter)等, 且多隶属变形菌门; 菌群多样性呈现时空变化, 即随分层过程持续, 时间尺度上多样性呈升高趋势, 空间上底层高于表层.

(3) 水温、DO和氮类营养盐(NO₃^--N和NH₄⁺-N)是好氧反硝化菌属结构和多样性塑造的主要驱动因子.反硝化菌群多样性和红杆菌属(Rhodobacter)的时空变化主要受DO影响, 脱氯单胞菌属(Dechloromonas)与NH₄⁺-N呈正相关; 水温、NO₃^--N和NH₄⁺-N对红长命菌属(Rubrivivax)影响显著.

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