环境科学  2021, Vol. 42 Issue (10): 4998-5009   PDF    
引用本文
曹曼曼, 王飞, 周北海, 陈辉伦, 袁蓉芳. 铁尾矿芦苇根际微生物和根内生菌群落分布及其限制性因子解析[J]. 环境科学, 2021, 42(10): 4998-5009.
CAO Man-man, WANG Fei, ZHOU Bei-hai, CHEN Hui-lun, YUAN Rong-fang. Community Distribution of the Rhizospheric and Endophytic Bacteria of Phragmites australis and Their Limiting Factors in Iron Tailings[J]. Environmental Science, 2021, 42(10): 4998-5009.
铁尾矿芦苇根际微生物和根内生菌群落分布及其限制性因子解析
曹曼曼, 王飞, 周北海, 陈辉伦, 袁蓉芳     
北京科技大学能源与环境工程学院, 北京 100083
收稿日期: 2021-03-06; 修订日期: 2021-03-30
基金项目: 国家自然科学基金优秀青年基金项目（41822706）；北京市自然科学基金项目（8182034）；中央高校基本科研业务费专项（FRF-TP-19-001C1）
作者简介: 曹曼曼(1999~), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为环境污染物的环境行为及生物效应, E-mail: 2324099410@qq.com
通信作者: 王飞, E-mail: wangfei@ustb.edu.cn
摘要: 利用Illumina高通量测序技术研究了北京市怀柔区前安岭铁尾矿库周边春季和夏季芦苇根际土壤微生物和根内生菌的组成.测序结果表明：在门水平共鉴定出40个门类，在各样本中，变形杆菌（Proteobateria）和放线菌（Actinobacteriota）均是优势菌门，在所有样本中二者之和所占比例均大于80%；在属水平，假杆菌属（Pseudarthrobacter）在根际和根内均占优势.α多样性分析表明，根际土壤微生物的物种丰富度（Sobs、Chao）和物种多样性指数（Shannon、PD）均显著高于根内生菌，Sobs、Chao、Shannon和PD指数的最大值和最小值差值分别为1336、1582.24、6.48和81.18.β多样性分析表明，根际土壤微生物和根内生菌的群落组成差异显著，而不同季节的样本之间差异并不明显.另外，各样本中的优势菌种，如假单胞菌属（Pseudomonas）、节杆菌属（Arthrobacter）和链霉菌属（Streptomyces）对重金属具有较强的耐受性.独有和共有微生物分析结果显示，在774个属中，共有250个属在4种类型的样本中同时存在，这表明不同样本的微生物群落组成具有一定的相似性.与土壤基本理化性质的相关性分析表明，Ni、Fe、有效磷、有效硫和有机质与微生物群落显著相关.通过COG功能预测发现，芦苇根际土壤和根内样本中的微生物代谢功能（如能量生产与转换、氨基酸转运与代谢、碳水化合物转运与代谢和无机离子转运与代谢）十分丰富.
关键词: 重金属污染      根际微生物      根内生菌      微生物多样性      高通量测序     
Community Distribution of the Rhizospheric and Endophytic Bacteria of Phragmites australis and Their Limiting Factors in Iron Tailings
CAO Man-man , WANG Fei , ZHOU Bei-hai , CHEN Hui-lun , YUAN Rong-fang     
School of Energy & Environmental Engineering, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China
Abstract: The composition of the rhizospheric and endophytic bacteria Phragmites australis in spring and summer around the Qiananling iron tailings reservoir in the Huairou District of Beijing was studied using Illumina high-throughput sequencing technology. Sequencing identified 40 phyla, and Proteobateria and Actinobacteria were the dominant phyla in all samples, accounting for more than 80% of the sequences in all samples. At the genus level, Pseudoarthrobacter was dominant. α-diversity analysis showed that species richness(Sobs, Chao) and species diversity indexes(Shannon, PD) of the rhizosphere soil microorganisms were significantly higher than those of endophytes. The maximum and minimum differences of the Sobs, Chao, Shannon, PD indexes were 1336, 1582.24, 6.48, and 81.18, respectively. β-diversity analysis indicated that there were significant differences in the community compositions of rhizosphere soil microorganisms and root endophytes, while now notable differences were observed between samples in different seasons. In addition, the dominant strains in each sample(such as Pseudomonas, Arthrobacter, and Streptomyces) were highly resistant to heavy metals. Among the 774 genera, a total of 250 genera coexisted in four types of samples, indicating that the microbial community composition of different samples had some degree of similarity. Correlation analysis between soil physical and chemical properties showed that Ni, Fe, available phosphorus, effective sulphur, and organic matter were significantly related to the microbial communities. Through the prediction of COG function, it was found that the microbial metabolic functions(i.e., energy production and conversion, amino acid transport and metabolism, carbohydrate transport and metabolism, inorganic ion transport, and metabolism) were abundant.
Key words: heavy metal pollution      rhizosphere microorganisms      endophytic bacteria      microbial diversity      high-throughput sequencing     

土壤是人类赖以生存和发展的基本条件, 是植物生长的基质, 也是土壤微生物的栖息地.然而, 随着工业化和城市化的飞速发展, 土壤重金属污染成为世界范围内的环境问题, 尤其是矿区土壤重金属污染在近年来备受关注[1].我国尾矿库种类复杂、分布广泛且数量繁多, 2019年重点调查工业企业的尾矿产生量达10.3亿t[2].尾矿中富含重金属和其它有毒化学物质, 易对周边土壤和水体造成污染.矿区土壤重金属以Pb、Hg、Cr、Cd、As、Zn、Mn和Cu等为主要特征[3].尾矿库周边虽然重金属污染严重, 但仍存在耐重金属污染的植物.

芦苇(Phragmites australis Trin)是多年生根茎性禾草, 属禾本科芦苇属, 对土壤的pH适应范围广、耐受性强、生物量大且生长迅速, 近年来发现其对重金属具有较强的耐受及富集能力, 多个研究表明其根系对重金属离子的富集能力最强, 是最为主要的吸收部位[4]. Iannelli等[5]的研究将芦苇暴露于Cd2+浓度为50 mmol·L-1的水体中, 21 d后, 芦苇根部和叶部蓄积的Cd2+含量分别为3.69 mg·g-1和0.08 mg·g-1.董志成等[6]的研究发现芦苇对多种重金属复合的污染也表现出较强的耐受性, 不同部位对不同金属的富集能力不同, 如对Zn、Cu和Cd富集能力: 根 > 叶 > 茎; 对Pb和Cr的富集能力: 根 > 茎 > 叶.总体而言, 芦苇根部对重金属的富集能力最强, 根是其吸收重金属最主要的部位.

根际土壤微生物是植物吸收养分的重要途径, 直接影响着植物的生产能力和土壤生态系统的功能[7].此外, 植物内生菌是植物微生态系统的重要组成部分, 普遍存在于植物组织中, 对促进植物生长、提高植物产量和品质有着重要的作用[8~10].植物内生菌经过与植物的长期共同生长和进化, 往往与植物根际土壤微生物具有相似的群落结构和组成[11].目前研究表明, 根际土壤微生物的群落结构对植物生长有着重要影响.同时, 根际微生物的组成会受到各种因素(如植物种类、土壤类型、季节变化、环境条件和栽培管理制度等)的影响[12].如在重金属胁迫下, 铜尾矿白羊草的根际微生物多样性发生变化, 其中根际土壤中Pb含量是影响根际真菌群落多样性的关键因子[13].因此, 探究根际土壤的微生物群落组成及其与环境因子的关系具有重要意义.另外, 由于温度、湿度及土壤理化性质等均会随季节变化而改变, 大量研究发现土壤微生物群落分布和多样性具有明显的季节动态[14~16].但Siles等[17]的研究表明, 季节变化不是影响土壤微生物群落组成的关键因子.可见, 季节变化对土壤微生物群落分布产生的影响仍存在争议, 有待进一步研究.

北京怀柔前安岭铁尾矿区位于降雨量偏低的华北地区, 属大陆性季风气候, 四季分明, 春季干燥多风, 夏季高温多雨.长期的矿业生产活动使得该尾矿区重金属污染严重, 而生长在该矿区的芦苇对重金属污染及矿砂养分贫瘠等胁迫条件具有较高的耐受性.因此, 本实验选择芦苇为研究对象, 利用Illumina高通量测序技术分析重金属污染环境下春、夏季芦苇根际土壤微生物和根内生菌的组成, 探讨其群落特征及其与环境因子的关系, 阐明芦苇根际土壤微生物和根内生菌在铁尾矿重金属胁迫下的响应, 寻找可能对铁尾矿区生态恢复有重要作用的关键菌种, 以期为矿区植物的种质资源和生态修复提供一定的依据.

1 材料与方法 1.1 样品采集

2019年4月(春季)和8月(夏季)中旬在北京市怀柔区的前安岭铁尾矿库采集芦苇根系和根际土壤样品.在矿区随机选取相距20 m的3 m×3 m样方, 在每个样方内采集5个子样本, 将这些子样本混合在一起作为该样方内的样本, 以降低土壤异质性的干扰[18].样品编号为Tc1~8、Gc1~8、Tx1~4和Gx1~4, 其中Tc代表春季芦苇根际土壤样品, Gc代表春季芦苇根系样品, Tx代表夏季芦苇根际土壤样品, Gx代表夏季芦苇根系样品, 数字代表样品编号.用75%酒精消毒处理取样过程中使用的工具, 所取土壤混合均匀后分为两份, 用无菌自封袋封装, 一份用于土壤理化性质测定, 一份置于冷却箱中(温度为4℃), 并立即转移到实验室进行进一步分析.

1.2 根际土壤理化性质测定

土壤铵态氮(ammonium nitrogen, AN)和硝态氮(nitrate nitrogen, NN)用2 mol·L-1 KCl溶液浸提鲜土样后, 采用流动分析仪测定.采用YD-L10A型土壤养分分析仪, 根据比尔-朗伯定律对土壤有效磷(available phosphorus, AP)进行分析[19].采用磷酸盐-HOAc浸提-BaSO4比浊法测定有效硫(effective sulphur, ES)[20].有机物(organic matter, OM)的测定采用Walkley和Black湿式氧化法[21].元素[砷(As)、镉(Cd)、钴(Co)、铬(Cr)、铜(Cu)、锰(Mn)、镍(Ni)、铅(Pb)、锌(Zn)和铁(Fe)]的含量通过王水消解提取, 并通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES, ThermoFisher iCAP7000, USA)测定.使用上海Majorbio(中国上海)的E.Z.N.ATM土壤DNA试剂盒从0.5 g样本中提取每个土壤微生物DNA, 然后溶解在50 mL TE缓冲液中, 用分光光度计定量, 并用琼脂糖凝胶电泳检查质量.所有DNA样本在-80℃下储存, 直到进一步分析[22].

1.3 微生物测序

使用515F 5′-GTGCCAGCCG GTAA-3′和907R 5′-CCGTCAATTCTTRACTTT-3′对16S rRNA基因V4区进行PCR扩增.将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物, 利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)进行回收产物纯化, 2%琼脂糖凝胶电泳检测, 并用QuantusTM Fluorometer(Promega, USA)对回收产物进行检测、定量.使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库.利用Illumina公司的MiSeq PE300平台进行测序.

1.4 数据分析

使用Fastp软件对原始测序序列进行质控, 使用Flash软件进行拼接.使用Usearch软件, 根据97%的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体.利用RDPclassifer(http://rdp.cme.msu.edu/)对每条序列与Silva数据库(SSU132)进行比对, 设置比对阈值为70%, 得到物种分类注释结果.以Sobs、Chao、Shannon、PD、Coverage指数表征群落物种多样性(α多样性).至于β多样性, 基于Bray-Curtis距离计算距离矩阵, 使用PCoA进行结果可视化展示, 使用非参数的PERMANOVA分析检测组间差异是否显著, 以及分组因素(样本类型)对组间差异的解释度.使用STAMP软件分析组间物种丰度差异, 使用Venn图分析不同类型样本中独有和共有微生物, 使用相关性Heatmap图对微生物组成与环境因子进行相关性分析, 使用PICRUSt进行COG功能预测.

2 结果与分析 2.1 根际土壤理化性质

根际土壤样本的部分理化性质和重金属测定结果, 如表 1和表 2所示.根据中国土壤环境质量标准(GB 15618-2018), 所有根际土壤样品中Cd含量均显著高于农用地土壤污染风险筛选值(约1.92~11.08倍).这表明, 该矿区土壤普遍受到了镉的污染.所有采样点的As、Cr、Cu、Ni、Pb和Zn均低于风险筛查值(单位mg·kg-1), 分别为1.27~3.63(平均2.10)、25.95~82.74(平均54.55)、10.85~61.01(平均41.34)、3.90~28.04(平均16.78)、0~12.05(平均8.07)和1.68~104.60(平均68.91).在所有金属中, Fe的含量最高, 为42 662.5~51 912.5 mg·kg-1(平均47 358.3 mg·kg-1).结果表明, 春季样本中有效硫和有机质的浓度较高, 最大含量分别为186 mg·kg-1和8.78 mg·kg-1.

表 1 根际土壤部分理化性质 Table 1 Physical and chemical properties of rhizosphere soil

表 2 根际土壤重金属含量/mg·kg-1 Table 2 Heavy metal content of rhizosphere soil/mg·kg-1

2.2 细菌群落多样性

质控之后, 在根际和根内的24个样本中, 有效序列为1 565 646条, 有效碱基数为590 869 070个, 通过97%OTU聚类后获得2 793个细菌OTUs.通过α多样性分析发现, 根际土壤微生物的物种丰富度(Sobs、Chao)和物种多样性指数(Shannon、PD)均显著高于根内生菌(P值均小于0.01), Sobs、Chao、Shannon、PD指数的最大值和最小值差值分别为1 336、1 582.24、6.48和81.18, 而根际土壤微生物和根内生菌的种群覆盖度(Coverage指数)则无显著差异, 这说明相对于根际土壤微生物, 根内生菌的物种数较少, 但二者分布都较为均匀(表 3).

表 3 根际土壤微生物和根内生菌α多样性1) Table 3 The α diversity of rhizosphere soil microorganisms and endophytes

另外, 春季根内生菌的物种丰富度(Sobs、Chao)和物种多样性(Shannon、PD)指数平均值均小于夏季样本, 而在根际土壤样本中, 春季样本的α多样性指数(除Shannon指数外)均大于夏季样本(表 3), 这表明微生物多样性在一定程度上会受到季节的影响.如春季根内样本的Sobs指数为15~436, 平均值为267.50, 而夏季根内样本的Sobs指数为565~770, 平均值为638.75, 根系各样本的Sobs指数排序为: Gx1 > Gx3 > Gx4 > Gx2 > Gc1 > Gc6 > Gc5 > Gc3 > Gc7 > Gc2 > Gc4 > Gc8.

至于β多样性, 基于Bray-Curtis距离的PCoA分析表明, 样本类型显著影响样本间的群落分布(PERMANOVA, P < 0.001), PERMANOVA分析揭示, 样本类型能够揭示细菌群落组成总体差异的47.65%[图 1(a)].随后将根际和根内样本分别按照春、夏季节进行划分, PERMANOVA分析揭示, 季节能够解释根际土壤微生物群落结构差异(P < 0.01)的25.99%[图 1(b)], 能够解释根内生菌群落结构差异(P < 0.001)的27.78%[图 1(c)].通过β多样性分析, 进一步发现样本类型(根际和根内)对微生物群落结构的影响较大.

图 1 根际土壤微生物和根内生菌的PCoA分析 Fig. 1 PCoA analysis of rhizosphere soil microorganisms and endophytes

2.3 优势菌种分析

在矿区芦苇根际土壤和根内共鉴别出40个门类, 在各样本中, 变形杆菌(Proteobateria)、放线菌(Actinobacteriota)和拟杆菌(Bacteroidota)均是优势菌门, 变形杆菌(Proteobateria)在各样本中的丰度范围为14.85%~99.95%, 其中在Gc4和Gc7样本中变形杆菌(Proteobateria)的丰度均大于98%, 占绝对优势.除Gc4和Gc7外, 其他样本中放线菌(Actinobacteriota)的丰度范围为6.60%~78.40%.在根际土壤样本中, 变形杆菌(Proteobateria)的平均相对丰度低于根内, 放线菌(Actinobacteriota)的平均相对丰度高于根内[图 2(a)].在属水平上, 在根际土壤样本中, 平均丰度大于5%的菌种有类诺卡氏菌属(Nocardioides)11.00%、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)7.57%、假节杆菌属(Pseudarthrobacter)5.99%; 在根内生菌中平均丰度大于5%的菌种有泛菌属(Pantoea)17.52%、假节杆菌属(Pseudarthrobacter)10.71%、假单胞菌属(Pseudomonas)10.69%、Lechevalieria7.17%和unclassified_f_Enterobacteriaceae 7.24%[图 2(b)].

a1. Proteobacteria, a2. Actinobacteriota, a3. Bacteroidota, a4. Gemmatimonadota, a5. Firmicutes, a6. Chloroflexi, a7. Acidobacteriota, a8. Myxococcota, a9. Nitrospirota, a10. Bdellovibrionota, a11. Verrucomicrobiota, a12. Zixibacteria, a13. Others; b1. Pantoea, b2. Pseudarthrobacter, b3. Pseudomonas, b4. Nocardioides, b5. Lechevalieria, b6. Arthrobacter, b7. Sphingomonas, b8. unclassified_f_Enterobacteriaceae, b9. Streptomyces, b10. Enterobacter, b11. Promicromonospora, b12. Steroidobacter, b13. Rhodococcus, b14. others 图 2 优势菌种在门和属水平上的丰度堆积柱状图 Fig. 2 Accumulation histogram of abundance of dominant species at the phylum and genus levels

对比门和属水平的优势菌种, 能够发现高丰度菌门丰度的变化主要是由几种菌种驱动的, 如放线菌(Actinobacteriota)的丰度与类诺卡氏菌属(Nocardioides)和假节杆菌属(Pseudarthrobacter)总丰度变化一致, 变形杆菌(Proteobateria)的丰度与泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)和unclassified_f_Enterobacteriaceae总丰度变化一致.

2.3.1 根际和根内样本在门和纲水平物种差异分析

在门水平, 根内样本中变形杆菌(Proteobateria)和拟杆菌(Bacteroidota)的相对丰度高于根际样本, 而其他优势菌门的相对丰度均低于根际样本(Welch's t test, P < 0.05, Bonferron校正)[图 3(a)].在纲水平, γ变形菌纲(γ-Proteobacteria)在根内样本中富集, 相对丰度显著高于根际样本(P < 0.01), 而α变形菌纲(α-Proteobacteria)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、酸微菌纲(Acidimicroblia)、芽单胞菌(Gemmatimonadetes)和TK10均显著低于根际样本(P < 0.001)[图 3(b)].

* 0.01 < P≤0.05, ** 0.001 < P≤0.01, *** P ≤0.001 图 3 根际土壤微生物和根内生菌在门和纲水平丰度的差异 Fig. 3 Differences in the abundance of rhizosphere soil microorganisms and endophytes at the phylum and class levels

2.3.2 不同季节的根际样本在门和科水平物种差异分析

在门水平, 变形杆菌(Proteobacteria)和放线菌(Actinobacteriota)在春季和夏季的根际样本中具有显著差异(P < 0.01), 其中变形杆菌(Proteobacteria)在春季和夏季的根际样本中平均丰度分别为35.53%和52.67%, 放线菌(Actinobacteriota)在春季和夏季的根际样本中平均丰度分别为52.10%和33.72%.而芽孢杆菌(Gemmatimonadota)、绿弯菌(Chloroflexi)和酸杆菌(Acidobacteriota)等优势菌门在春、夏季的根际样本中无明显差异[图 4(a)].

* 0.01 < P≤0.05, ** 0.001 < P≤0.01, *** P ≤0.001 图 4 春夏季根际土壤微生物和根内生菌在门和科水平丰度的差异 Fig. 4 Abundance differences of rhizosphere soil microorganisms and endophytes at the phylum level and family level in spring and summer

在科水平, 根际样本中富集的门中, 微球菌科(Micrococcaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)和Gaiellaceae是放线菌(Actinobacteriota)门下的优势科, 鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、亚硝化单胞菌科(Nitrosomonadaceae)、嗜氢菌科(Hydrogenophilaceae)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、Devosiaceae和丛毛单胞菌科(Comamonadaceae) 是变形杆菌(Proteobacteria)门下的优势科.在TOP10的优势科中只有微球菌科(Micrococcaceae)和类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)在春季根内的丰度高于夏季, 其余8种在春季根内的丰度均低于夏季, 而在根内春、夏季样本中具有显著性差异的科有微球菌科(Micrococcaceae)(P < 0.05)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)(P < 0.001)和类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)(P < 0.001)[图 4(b)].

2.3.3 不同季节的根内样本在门和科水平物种差异分析

在门水平, 与根际样本相同, 在春季的根内样本中放线菌(Actinobacteriota)相对丰度高于夏季, 而变形杆菌(Proteobacteria)相对丰度低于夏季.与根际样本不同的是, 根内样本中各优势门在不同季节的丰度无显著性差异, 即季节的影响并不显著[图 4(c)].

在科水平, 链霉菌科(Streptomycetaceae)(P < 0.001)和伯克氏菌科(Burkholaeriaceae)(P < 0.01)在春、夏季的根内样品中具有显著差异.另外, 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)在夏季根内样品中富集, 而欧文菌科(Erwiniaceae)和微球菌科(Micrococcaceae)在春季根内样品中富集[图 4(d)].

2.4 根际土壤微生物和根内生菌独有和共有微生物分析

在属水平, 对不同样本类型的微生物群落组成进行比较, 用于揭示不同影响因素对微生物多样性的影响.结果显示, 132个属是根内生菌独有的, 占所有菌属的17.05%, 170个属是根际土壤微生物独有的, 占所有菌属的21.96%, 而有472个属是二者共有的, 占60.98%.结果表明, 根际土壤微生物和根内生菌的微生物群落相似, 且与根内样本相比, 根际土壤独有的微生物多样性较高(图 5).

图 5 属水平的Venn图 Fig. 5 Venn graph of genus level

从图 5同样可以看出, 春季样本和夏季样本中共有微生物(581个属)比根际和根内样本中共有微生物(472个属)更多, 这说明季节的变化对微生物多样性的影响较小.另外, 共有250个属在4种类型样本中均存在, 说明所有样本中的微生物群落具有一定的相似性.

在2 793个OTUs中, 发现有407个OTUs在4种类型样本中均存在, 占所有OTUs的14.57%.将这407个OTUs分类到属水平, 发现这些核心微生物组由250个属组成, 其中占比大于1%的属有13个.在核心微生物组中的优势菌属为泛菌(Pantoea)11.81%、拟杆菌(Pseudarthrobacter)9.61%、假单胞菌(Pseudomonas)8.25%和类诺卡氏菌(Nocardioides)5.99%.

2.5 环境因子关联分析

对所选的环境因子(As、Cd、Co、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Zn、Fe、AN、NN、AP、ES和OM)进行筛选, 保留方差膨胀因子(variance inflation fact, VIF)小于10的环境因子, 用于后续分析.通过筛选, VIF < 10的环境因子有As、Ni、Fe、AN、NN、AP、ES和OM.通过冗余分析(RDA)来识别微生物群落结构和环境因子之间的联系(图 6), 结果发现62.01%的微生物变化可以用土壤性质来解释, RDA图的轴1解释了大约52.01%的变异, 轴2解释了10.00%的变异.RDA分析揭示, Ni、OM、ES、AP和Fe是微生物群落的主要控制因子, 同时可以看出除AP外, 其他环境因子之间均呈正相关, 而AP与Fe、ES、AN、Ni、OM和AS均表现为负相关.另外, 土壤理化特性随季节变化.土壤养分(AN、NN、ES和OM)在夏季显著高于春季, AP在春季较高.

符号表示采样点, 箭头表示环境因子, 箭头长短表示环境因子对微生物群落的影响程度 图 6 属水平的RDA分析 Fig. 6 RDA analysis of genus level

图 7表明, 根际土壤微生物和根内生菌的群落结构及物种丰度均会在一定程度上受到土壤理化性质的影响.

a1. Abditibacteriota, a2. Acidobacteriota, a3. Actinobacteriota, a4. AncK6, a5. Armatimonadota, a6. Bacteroidota, a7. Bdellovibrionota, a8. Chloroflexi, a9. Cyanobacteria, a10. Dadabacteria, a11. Deinococcota, a12. Dependentiae, a13. Desulfobacterota, a14. DTB120, a15. Elusimicrobiota, a16. Entotheonellaeota, a17. FCPU426, a18. Fibrobacterota, a19. Firmicutes, a20. FWlI3, a21. Gemmatimonadota, a22. Hydrogenedentes, a23. Latescibacterota, a24. MBNTI5, a25. Methylomirabilota, a26. Myxococcota, a27. NBI-j, a28. Nitrospirota, a29. Patescibacteria, a30. PAUC34f, a31. Planctomycetota, a32. Proteobacteria, a33. RCP2-54, a34. SAR324_cldeMarine_group_B, a35. TXIA-33, a36. unclassified_k_norank _d_Bacteria, a37. Verrucomicrobiota, a38. Zixibacteria; * 0.01 < P≤0.05, ** 0.001 < P≤0.01, *** P≤0.001 图 7 微生物与土壤理化性质的相关性热力图 Fig. 7 Thermogram of the correlations between microorganisms and soil physical and chemical properties

大部分菌群与有效磷呈显著负相关, 与硝态氮、铵态氮、有效硫和有机质呈显著正相关, 这表明微生物群落结构与土壤肥力息息相关.Deinococcota、纤维杆菌(Fibrobacterota)、厚壁菌(Firmicutes)、浮酶状菌(Planctomycetota)和TX1A-33与Ni、Fe、硝态氮、有效硫及有机质呈正相关.其中Deinococcota与Cr、Cu、Mn、Ni、Zn、铵态氮、硝态氮、有效硫和有机质呈显著正相关, r值分别为0.62、0.60、0.63、0.71、0.63、0.59、0.66和0.88.由此可以发现, 土壤理化性质会对芦苇根际土壤微生物和根内生菌的群落结构和物种丰度产生一定的影响.

2.6 功能预测分析

使用PICRUSt进行COG功能预测, 发现不同类型样本的COG功能组成较为相似(图 8).不管是春季与夏季比较, 还是根际土壤微生物与根内生菌比较, 都未发现较大不同.在4种类型样本中, 微生物主要的COG功能包括: 能量生产与转换、氨基酸转运与代谢、碳水化合物转运与代谢、无机离子转运与代谢、转录和信号传导机制.该分析结果表明, 芦苇根际土壤和根内样本中的微生物代谢功能非常丰富.

A: RNA加工和修饰, B: 染色质的结构和动力学, C: 能量产生和转化, D: 细胞周期控制、细胞分裂和染色体分区, E: 氨基酸转运和代谢, F: 核苷酸转运和代谢, G: 碳水化合物转运和代谢, H: 辅酶转运和代谢, I: 脂质转运和代谢, J: 翻译, 核糖体结构和生物发生, K: 转录, L: 复制、重组和修复, M: 细胞壁/膜/包膜生物发生, N: 细胞运动, O: 翻译后修饰、蛋白质更新和分子伴侣, P: 无机离子运输和代谢, Q: 次生代谢产物的生物合成、运输和分解代谢, R: 仅一般功能预测, S: 功能未知, T: 信号转导机制, U: 细胞内运输、分泌和囊泡运输, V: 防御机制, W: 细胞外结构, Z: 细胞骨架 图 8 COG功能分类统计柱状图 Fig. 8 Statistical histogram of COG function classification

3 讨论

α与β多样性分析揭示, 根际土壤微生物和根内生菌的多样性具有显著差异, 且受季节影响.冯玮娜等[11]的研究发现, 四川牡丹根际微生物和种子内生菌的组成具有显著差异.Jia等[23]研究了黄土高原某铜尾矿库微生物群落随季节的变化及驱动因素, 结果发现季节对铜尾矿土壤中的优势菌种具有显著影响.对比以上结论, 根际微生物和根内生菌的群落组成和多样性具有显著差异, 不同季节的微生物群落组成和多样性也不同.利用Illumina高通量测序技术研究了芦苇根际土壤微生物和根内生菌的组成, 发现变形杆菌(Proteobateria)、放线菌(Actinobacteriota)和拟杆菌(Bacteroidota)是芦苇根际和根内最为主要的菌门.滕泽栋等[24]的研究同样发现芦苇根际和非根际土壤微生物中的优势菌门均为变形杆菌(Proteobacteria)、酸杆菌(Acidobacteria)、绿弯菌(Chloroflexi)和放线菌(Actinobacteria).在属水平上, 根际土壤微生物和根内生菌的差异较大, 但仍有部分菌种在两类样本中都是优势菌种, 如假节杆菌属(Pseudarthrobacter).属水平根际土壤中的优势菌种为类诺卡氏菌属(Nocardioides)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)和假节杆菌属(Pseudarthrobacter); 根内生菌中的优势菌种为泛菌属(Pantoea)、假节杆菌属(Pseudarthrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Lechevalieria和unclassified_f_Enterobacteriaceae.有研究表明, 以上优势菌种几乎都对重金属具有较强的耐受性, 其中假单胞菌(Pseudomonas)、节杆菌(Arthrobacter)和链霉菌(Streptomyces)为典型的重金属耐受性微生物[25~30].有研究表明, 假单胞菌(Pseudomonas)具有耐受多种重金属(如Cd2+、Cr6+、As3+、Zn2+、Cu2+、Mn2+和Ni2+)的能力, 对Cd2+耐受浓度达到10 mmol·L-1[25~28].链霉菌(Streptomyces)对Zn2+的耐受浓度达到150 mmol·L-1[29], 节杆菌(Arthrobacter)对Cr6+的吸附量为175.87 mg·g-1[30].阮迪申等[31]的研究表明, 部分微生物在长期协同进化的过程中对重金属产生了耐受性和解毒机制.一方面, 微生物可降低植物体内重金属胁迫程度; 另一方面, 微生物会对植物的表型产生影响, 从而提高植物本身对重金属的耐受能力.有研究表明, 泛菌属(Pantoea)、假节杆菌属(Pseudarthrobacter)和假单胞菌(Pseudomonas)等菌群能够通过分泌吲哚乙酸(IAA)、1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶、溶磷、固氮和产铁载体等作用而促进植物生长, 并提高植物对重金属的耐受能力[32~34].

通过物种Venn图分析, 发现根际土壤微生物和根内生菌之间存在紧密联系, 二者相互影响, 共同进化与成长, 具有高度的相似性.一方面, 根系的分泌物会吸引根际特定的菌种富集; 另一方面, 外部的土壤环境也会影响植物内生菌的组成.Lundberg等[35]证实了拟南芥根际微生物和根内生菌的组成受土壤类型和发育阶段的影响显著, 为这一解释做了辅证.

土壤基本理化性质对根际微生物和根内生菌均会产生影响, 但其作用效果并不相同.Ni、OM、ES、AP和Fe与微生物群落显著相关, 大部分菌群与有效磷呈显著负相关, 与硝态氮、铵态氮、有效硫、有机质呈负相关.另外, 土壤理化特性随季节变化.不同季节的温度和湿度水平及养分可利用性均不相同.一般微生物活性和物种丰富度随温度升高而升高, 夏季微生物总体活性最高, 可能由于夏季植物光合作用最强.宋贤冲等[36]的研究也表明土壤有机质、全磷、全钾和速效磷含量等土壤理化性质与微生物群落多样性密切相关, 土壤理化性质是造成不同季节土壤微生物群落多样性差异的主要原因.与土壤理化性质显著相关的菌群大多属于变形杆菌(Proteobateria)和放线菌(Actinobacteriota), 原因可能是这两种菌门菌种种类众多, 属优势菌门.其一, 菌种种类多, 代谢途径复杂, 因而与多种环境因素具有显著的相关性; 另外, 变形杆菌(Proteobateria)和放线菌(Actinobacteriota)在各样本中均占绝对优势, 属于优势菌门, 其他菌种与环境间的各种反馈机制可能会受到优势菌种的影响, 使得其与环境因素的相关性更难发现.COG功能预测结果表明, 芦苇根际微生物和根内生菌的代谢功能十分丰富, 可能正是由于其代谢功能丰富, 增强了其对重金属的耐受性.

4 结论

(1) 芦苇根际微生物和根内生菌的群落结构具有显著差异, 且受季节的影响.根际微生物多样性: 春季＜夏季; 根内生菌多样性: 春季＞夏季.

(2) 芦苇根际微生物和根内生菌的优势菌门均为变形杆菌(Proteobateria)、放线菌(Actinobacteriota)和拟杆菌(Bacteroidota); 优势菌属中的泛菌属(Pantoea)、假节杆菌属(Pseudarthrobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas)均对重金属具有耐性.

(3) 芦苇根际微生物和根内生菌受土壤基本理化性质的影响, Ni、OM、ES、AP和Fe为主要的控制因子, 且春夏季与环境因子的相关性不同, 土壤养分(AN、NN、ES和OM)在夏季显著高于春季, AP在春季较高.

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