2021, Vol. 42
2. 中国热带农业科学院橡胶研究所, 海口 571101;
3. 东北农业大学资源与环境学院, 哈尔滨 150030;
4. 福建师范大学湿润亚热带山地生态国家重点实验室培育基地, 福州 350007
2. Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China;
3. College of Resources and Environment, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;
4. State Key Laboratory of Subtropical Mountain Ecology, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China
氮是构成生命的基础物质, 是合成蛋白质和核酸的重要元素, 在生命新陈代谢和遗传进化中扮演着重要的角色[1].地球大气组成中约80%是氮, 但大多以不可直接利用的N2的形态存在, 需要固氮作用才能将其转化为活性氮.无论是生物固氮还是非生物固氮, 都需要经微生物作用才能促进氮素的转化[2].因此, 微生物是不同形态的氮素转化的引擎, 其对生态系统结构和功能稳定性的维持起着重要作用[3].
然而人们对微生物驱动的生化反应过程和机制仍缺乏足够的认识, 对微生物群落和生态系统功能之间的关系主要是基于分类学的研究框架, 即通过测量由标记基因方法衍生出的群落组成的变化进行推断[4].但是这种方法并不能说明它们之间的关系, 这主要是因为微生物之间存在水平基因转移, 致使不同的微生物可以执行相同的代谢功能, 其群落通常表现出较高的“功能冗余”.对两者之间关系的研究需要进一步表征微生物在生态系统中的功能作用[5].微生物性状是指与其存活、生长和繁殖密切相关的一系列核心属性, 这些属性恰好体现了它们在生态系统中的功能作用, 将基于微生物性状的功能生态学研究框架应用于土壤微生物有助于增强将微生物群落与生态系统过程联系起来的能力[6].
微生物的基因型性状编码微生物的功能潜力, 而宏基因组测序技术是一种量化微生物基因型性状的方法, 它不依赖于扩增, 直接对环境样品中提取的DNA进行深度测序, 不仅更加全面、真实和精确地反映微生物群落的遗传信息, 也为发现新的微生物或功能酶提供可能[7].采用宏基因组测序技术发掘基因组进化和功能信息阐明氮循环微生物功能基因多样性、相对丰度与土壤氮素循环之间的关系[8], 进而揭示土壤中氮素的循环过程, 成为重新评价土壤质量与功能的新方法.
微生物的群落结构会随各种生物或非生物因素的干扰而发生不同程度的变化, 然而它们对微生物功能的影响却很小[9~12].氮循环对生态系统来说如此重要, 而森林土又是受扰动较少的一类土壤, 那么不同类型森林土壤是否具有相同的氮转化特征？对同一氮转化途径来说, 不同森林土壤的微生物群落结构是否相似？
为了回答上述科学问题, 本研究选取5种我国典型森林土壤, 包括黑土(黑龙江哈尔滨)、暗棕壤(吉林长白山)、黄棕壤(湖北武汉)、红壤(福建福州)和砖红壤(海南乐东), 利用宏基因组测序技术对氮代谢途径的微生物群落进行全面分析, 探究不同类型森林土壤的氮代谢途径特征.本研究有利于增强微观尺度上对5种典型森林土壤氮循环机制的理解.
1 材料与方法 1.1 研究区概况供试土壤样品来自中国5个不同纬度的典型森林土样品, 样点按纬度从高到低排序依次为黑龙江哈尔滨、吉林长白山、湖北武汉、福建福州和海南乐东.
哈尔滨森林土(N45°28′02″、E127°06′41″)采自黑龙江省哈尔滨市阿城区全店村, 该区属中温带大陆性季风气候, 海拔168 m, 年均温度在3.4℃, 年降水量553.2 mm.主要植被类型有水曲柳、黄檗和蒙古栎等纯林与混交林[13].土壤以黑土和草甸黑土为主, 本研究所采集的土壤类型为黑土.
吉林森林土(N41°44′、E127°39′)采自吉林省长白山自然保护区附近, 该区属温带大陆性山地气候, 海拔748 m, 年均温度为4.3℃, 年降水量为745 mm.主要树种为蒙古栎、紫椴和红松等.土壤为由火山灰发育而来的暗棕色土壤[14].
武汉森林土(N30°33′08″、E114°24′28″), 采自武汉磨山地区, 该区域属亚热带季风气候, 海拔58 m, 年均气温15.8℃, 年降水量维持在1 100 mm左右.主要植被类型为常绿阔叶林和落叶阔叶林组成的混交林[15].主要土壤类型有棕壤、黄棕壤, 本研究所采集的土壤类型为黄棕壤.
福州森林土(N25°58′58″、E119°10′06″), 该区属亚热带季风气候, 海拔224 m, 年平均气温为16~20℃, 年平均降水量为900~2 100 mm, 主要树种有马尾松、杉木和榕树等.土壤以红壤、赤红壤和黄壤为主, 呈酸性[16], 本研究所采集的土壤类型为红壤.
海南森林土(N19°11′35″、E69°28′19″), 采自位于海南省乐东尖峰岭国家森林公园, 该区域属热带海洋性季风气候, 光照充足, 热量丰富, 雨量充沛, 轻风无霜, 为湿润气候区, 海拔1 006 m, 年平均温度24℃, 年降水量1 600 mm.主要植被类型有橡胶林、椰子林和桉树林等.土壤类型有砖红壤和滨海沙壤等[17], 本研究所采集的土壤类型为砖红壤.
1.2 土壤样品采集土壤采集于2017年6月, 每个土壤类型随机选择3个面积为25 m2的小区, 每个小区之间至少相隔10 m, 每个小区采取一个样品, 按照梅花形布点方式用直径2.5 cm的土钻分别钻取0~1、9~10和19~20 cm处的土壤, 将所有样品放到含有干冰的盒子中带回实验室.去除采回土样的枯枝落叶等杂物, 一部分土样完全风干后过1 mm筛用于土壤基本理化性质的测定(将每个采样小区3个深度的土壤样品都均匀混合, 即每个土壤类型共3个测定土样, 共15个测定土样); 对5种森林土壤样品进行的16S rRNA测序结果表明, 每种森林土壤3种重复之间微生物群落结构相差不大, 加上以往有研究表明宏基因组测序不做重复也有很好的重现性[18], 此外, 考虑到宏基因组测序的成本问题, 因此未对5种森林土壤样品进行宏基因组重复测序.另一小部分样品放置于-80℃冰箱保存用于后续DNA提取及宏基因组测序(对于每个采样小区, 取0.5 g各深度的样品, 将3个深度的样品均匀混合后取混合后的样品0.5 g, 最后再将3个小区的土壤样品混合后取0.5 g作为该土壤类型最终用于宏基因组测序的样品, 共5个宏基因组测序样品).
1.3 分析测定方法土壤pH值采用梅特勒LE438复合电极(Mettler Toledo, 中国上海)测定(土水比1∶2.5); 总氮和土壤有机质分别采用改进后的克氏法及重铬酸钾氧化容量法(K2Cr2O7-H2SO4法)进行测定[19]; 土壤田间持水量测定方法参照国家农业行业标准测定; 总磷的测定使用消解钼锑抗分光光度法, 土壤全钾采用火焰光度法测定[20].土壤基本理化性质见表 1.
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表 1 实验土壤样品基本理化性质1) Table 1 Basic physical and chemical properties of the soil samples |
1.4 土壤总DNA提取及宏基因组测序
采用FastDNA® SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals, LLC, USA)试剂盒提取土壤微生物总DNA, 具体操作严格按照试剂盒说明进行.对所提取的总DNA进行质量检测: 1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性; 超微量分光光度计NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific, 美国)检测DNA浓度.后续的宏基因组测序和生物信息学部分由上海凌恩生物科技有限公司利用高通量测序仪HiSeq® 2000 System(Illumina, 美国)完成.宏基因组测序原始数据已经提交NCBI的SRA数据库, 登录号待公布.
1.5 数据处理宏基因组测序数据分析从下机原始序列开始, 首先用软件Seqprep和Sickle对下机原始数据进行去接头、质量剪切以及去污染等优化处理, 然后使用拼接软件SOVPdenovo和MetaGene分别对优质序列进行拼接组装和基因预测, 对得到的基因进行物种及功能上的注释以及分类.使用BLASP(BLASTVersion2.2.28 +, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将基因集与NR数据库进行比对(BLAST比对参数设置期望值e-value为1E-05), 并通过NR数据库对应的分类学信息数据库获得N循环微生物物种注释, 然后使用物种对应的基因丰度总和计算物种的相对丰度[21].用Origin 8.6作氮代谢途径的发生频率图; 用SPSS 17.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA); 用R语言的ggplot2包绘制属水平上的微生物群落结构图; 可以按照前人的研究将氮代谢途径分为同化途径和异化途径, 此方法可以较完整地代表整个氮代谢途径[22].这样, 本研究共选择7种氮代谢途径, 氨同化、硝酸盐同化还原和固氮途径可归为同化途径, 而硝酸盐异化还原、硝化、反硝化及厌氧氨氧化可归为异化途径, 并用CorelDRAW 2019绘制氮转化途径, 如图 1所示.
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橙色表示同化途径, 蓝色表示异化途径.括号中的数字表示氮代谢途径所涉及的功能基因种类数, 氨同化途径所涉及的功能基因有: ansB、gdh_k00260、gdh_k00261、gdh_k00262、gdh_k15371、gs_k00264、gs_k00265、gs_k00266、gs_k00284和glnA; 硝酸盐异化还原途径所涉及的功能基因有: napA、napB、napC、narG、narH、narI、narJ、narY、narZ、nirB、nirD、nrfA、nrfC和nrfD; 硝酸盐同化还原途径所涉及的功能基因有: narB、narC、nasA、nasB、nirA和NR; 反硝化途径所涉及的功能基因有: nirK、nirS、norB、norC、nosZ; 硝化途径所涉及的功能基因有: amoA_A、amoB_A、amoB_B、amoC_A、amoC_B、haoh和nxrB; 固氮途径所涉及的功能基因有: nirfD、nirfH和nirfK; 厌氧氨氧化途径所涉及的功能基因有: hzsB和hzsC; 改自文献[22] 图 1 本研究涉及的氮代谢途径 Fig. 1 Nitrogen metabolism pathways considered in this study |
如表 2所示, 经过HiSeq高通量测序, 黑土、暗棕壤、黄棕壤、红壤和砖红壤分别产生大约15、17、15、14和12 Gb的数据量, 原始序列经过滤, 去除低质量序列、模糊序列和嵌合体序列后, 分别得到95 609 856、106 343 106、78 277 612、102 388 778和116 190 398条clean reads.宏基因组测序几乎涵盖了环境样品中的全部微生物, 所有样品的覆盖度基本都在97%以上, 说明结果能够比较全面真实地反映土壤微生物群落组成.
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表 2 土壤基因组DNA测序数据统计 Table 2 Statistics of soil genomic DNA sequencing data |
2.2 氮代谢途径功能基因的检出频率
为了使测序深度标准化, 本研究将每个氮途径的基因丰度报告为其在样品中的检出频率(图 2), 细菌在5种森林土的各氮代谢途径中都被检测到, 其序列在宏基因组文库中占主导位置, 占所有序列的98.02%, 其次是古菌(1.84%)和真菌(0.09%).氨同化是检出频率最高的氮代谢途径, 每百万个带注释的细菌序列平均检测到2 830个功能基因, 相比之下, 固氮和厌氧氨氧化途径是最不常见的途径, 每百万个序列分别只检测到28.3和10.7个功能基因.
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1表示氨同化途径, 2表示硝酸盐异化还原途径, 3表示硝酸盐同化还原途径, 4表示反硝化途径, 5表示硝化途径, 6表示固氮途径, 7表示厌氧氨氧化途径 图 2 细菌、古菌和真菌氮代谢途径功能基因的检出频率 Fig. 2 Detection frequency of functional genes for each nitrogen metabolic pathway in bacteria, archaea, and fungi |
对5种森林土样品所涉及的7种氮代谢途径的功能基因丰度进行单因素方差分析(one-way ANOVA)后得到如图 3所示的结果.从中可知, 氨同化途径功能基因的丰度是最高的, 且显著高于其他氮代谢途径; 而硝化、固氮和厌氧氨氧化途径功能基因的丰度较低, 且显著低于其他氮代谢途径.
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1表示氨同化途径, 2表示硝酸盐同化还原途径, 3表示反硝化途径, 4表示硝酸盐异化还原途径, 5表示硝化途径, 6表示固氮途径, 7表示厌氧氨氧化途径; a、b、c和d为差异显著性标注, 不同小写字母之间差异显著(P＜0.05); 纵坐标值是从每百万个基因序列中检测到的目标功能基因的相对丰度 图 3 氮代谢途径的功能基因丰度 Fig. 3 Functional gene abundance of nitrogen metabolic pathways |
各氮代谢途径中, 每种森林土都有自己独特的微生物群落结构(图 4).氨同化、硝酸盐同化还原、硝酸盐异化还原和及反硝化途径的优势菌门主要有变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和奇古菌门(Thaumarchaeota)等.硝化途径微生物的群落结构在5种森林土壤中差异最为明显, 其中, 黑土和黄棕壤中占比最高的微生物都属于奇古菌门(Thaumarchaeota), 其在黄棕壤中的比例明显高于其他类型土壤, 为77.06%; 暗棕壤和红壤中占比最高的微生物分别属于硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和浮霉菌门(Planctomycetes), 比例明显高于其他类型土壤, 分别为77.97%和51.14%; 砖红壤中占比最高的微生物属于酸杆菌门(Acidobacteria), 其比例是5种森林土中最高的, 为39.94%; 此外, 放线菌门(Actinobacteria)只在红壤中检测到, 比例为3.87%.固氮途径涉及4种门水平上的微生物, 为酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)和Candidate division AD3门, 但黑土和黄棕壤中未检测到变形菌门(Proteobacteria)的微生物.厌氧氨氧化途径只检测到2种门水平上的微生物, 即变形菌门(Proteobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia).
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A表示氨同化途径, B表示硝酸盐同化还原途径, C表示硝酸盐异化还原途径, D表示反硝化途径, E表示硝化途径, F表示固氮途径, G表示厌氧氨氧化途径; 1表示黑土, 2表示暗棕壤, 3表示黄棕壤, 4表示红壤, 5表示砖红壤 图 4 氮代谢途径的微生物群落结构(门水平) Fig. 4 Microbial community structure of nitrogen metabolic pathways at the phylum level |
如图 5所示, 除了固氮和厌氧氨氧化途径, 其他氮代谢途径都检测到了古菌, 而Nitrososphaera和Candidatus Nitrosocosmicus是这些途径共有的古菌. 此外, 氨同化途径还检测到2种古菌, 为Halapricum和Halorhabdus, 后者只存在于红壤中; 红壤未检测到任何与硝酸盐异化还原和硝酸盐同化还原途径有关的古菌, Nitrosoarchaeum只参与黄棕壤的硝酸盐异化还原; 反硝化途径额外检测到的2种古菌, 为Candidatus Methanoperedens和Halopenitus, 5种森林土中都发现了Halopenitus, 而Candidatus Nitrosocosmicus只参与暗棕壤的反硝化; Nitrososphaera和Candidatus Nitrosocosmicus分别不参与砖红壤和红壤的硝化途径.真菌只在硝酸盐异化还原和硝酸盐同化还原途径中被发现, 其中, 只有1种真菌(Lactifluus)参与了硝酸盐同化还原途径; 除了Lactifluus, Tremella也参与了硝酸盐异化还原途径, 但黑土中未发现参与硝酸盐异化还原途径的真菌.
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a表示黑土, b表示暗棕壤, c表示黄棕壤, d表示红壤, e表示砖红壤; 圆圈代表的值是以百万为基准得到的物种相对丰度 图 5 氮代谢途径的微生物群落结构(属水平) Fig. 5 Microbial community structure of nitrogen metabolic pathways at the genus level |
以往对微生物功能方面的研究指标常常是由物种所代表的群落功能群的数量[23], 但这种基于物种水平划分功能群的不足之处在于划分属于一个功能群的物种就不能再划分到另一个功能群中[24], 而属于同一分类群的物种可能同时具有多种功能.正如本研究结果所示(图 4), 变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)的微生物可以同时参与氨同化、硝酸盐异化还原和硝酸盐同化还原等多种氮代谢途径, 体现出氮代谢功能多样性; 而不同功能群的物种也可能具有相同的功能, 如图 4所示, 疣微菌门(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和绿弯菌门(Chloroflexi)的微生物可以同时参与同一氮代谢途径, 如氨同化等.越来越多的研究表明, 功能性状影响着群落构建和生态系统功能[25], 为深入理解微生物群落和生态系统功能之间的关系提供了可能.而本研究正是基于微生物的基因型性状开展的.
总的来说, 5种森林土壤中, 氨同化是检出频率最高的氮代谢途径, 且显著高于其他氮代谢途径, 而固氮和厌氧氨氧化途径的检出频率较低, 这与Nelson等[22]对全球范围内微生物介导的氮代谢途径进行的宏基因组测序结果相似, 表明本研究所涉及的5种森林土有着相同的氮代谢途径特征.
已有的研究发现, 微生物群落的分布并非是均匀的, 而是呈现少量的优势物种和大量的稀有物种的规律, 并且少数常见菌群的丰度较高[26].例如, 孙迎韬[27]对我国森林土壤细菌群落地理分布的研究发现仅有少数细菌丰度较高.Delgado-Baquerizo等[28]的研究对全球范围内土壤细菌群落进行的16S rRNA测序表明只有2%的细菌占优势, 而且这部分细菌的相对丰度占所有细菌的41%.而本研究结果表明(图 5), 介导5种森林土壤各氮代谢途径发生且丰度较高的微生物同样属于那些常见的微生物, 如Bradyrhizobium、Mycobacterium、Actinomadura、Streptomyces和Pseudolabrys等.
对于本研究所涉及的各氮代谢途径, 微生物群落结构在5种森林土壤中各不相同, 这种差异在硝化途径中尤为明显.在硝化途径中, 黑土(图 4中E-1)和黄棕壤(图 4中E-3)中氨氧化古菌比例远高于氨氧化细菌, 黑土中氨氧化古菌数量占所有氨氧化微生物数量的69.75%, 而黄棕壤中这一比例更高, 达到83.24%.大量分子生态学研究表明, 那些广泛分布于海洋、湖泊、土壤等环境中的氨氧化古菌数量通常远远高于氨氧化细菌[29], 进一步预示氨氧化古菌在黑土和暗棕壤的硝化作用中可能起重要作用.此外, 暗棕壤中参与硝化作用的亚硝酸盐氧化细菌与氨氧化细菌的比值达到了9.15, 这意味着全程氨氧化微生物在黑土的硝化作用中占据重要地位.
固氮微生物广泛分布于细菌和古菌域, 但不同地区的优势类群存在显著差异, 如一项对寒旱区湖泊沉积物中固氮微生物的研究表明, 分类水平上属于蓝藻门、厚壁菌门和变形菌门的固氮菌占优势[30]. Chen等[31]对我国南亚热带常绿阔叶林土壤的研究也发现优势固氮菌分布于疣微菌门和变形菌门.本研究也表明, 门水平上的优势固氮菌在5种森林土中也有所差异, 如在黑土(图 4中F-1)中为Candidate division AD3门; 暗棕壤(图 4中F-2)中为酸杆菌门和变形菌门; 黄棕壤(图 4中F-3)中为酸杆菌门; 红壤(图 4中F-4)中为浮霉菌门和变形菌门; 砖红壤(图 4中F-5)中为浮霉菌门和酸杆菌门.由于不同微生物类群对环境变化的响应和适应能力存在差别, 因此优势固氮微生物类群的差异可能是不同森林土生物固氮功能对环境变化作出差别响应的驱动因子.
迄今为止, 伯杰氏手册中收录的厌氧氨氧化细菌都属于浮霉菌门(Planctomycetes), 是一类严格厌氧菌, 广泛存在于海洋和陆地生态系统[32].在陆地生态系统, 其多存在于氧气含量较低的环境如植物根际、水稻土和沉积物等[33~35].对本研究而言, 5种旱地森林土较低的含水量并未造成厌氧的环境, 因此, 未在5种森林土中检测到属于浮霉菌门(Planctomycetes)的厌氧氨氧化菌, 然而本研究结果却显示参与厌氧氨氧化的微生物属于变形菌门和疣微菌门(图 4), 这种现象可用厌氧氨氧化联合体来解释.Zhao等[36]用宏基因组学技术对厌氧氨氧化微生物的研究发现, 装甲菌门(Armatimonadetes)和变形菌门(Proteobacteria)等菌门的微生物可以为厌氧氨氧化细菌提供生长因子或进行厌氧氨氧化代谢物的清除, 以利于其活性和生长.这些对厌氧氨氧化细菌有利的微生物连同厌氧氨氧化细菌共存于一个厌氧氨氧化联合体中, 且绿弯菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿菌门(Chlorobi)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的微生物占厌氧氨氧化联合体的30%~70%.因此, 对本研究而言, 丰度相对较高的变形菌门和疣微菌门的微生物作为厌氧氨氧化联合体的成员而被检测到.
有研究表明, 土壤pH可能是影响氨氧化细菌与古菌分布的主要影响因子, 且低pH土壤中, 氨氧化作用由氨氧化古菌主导[37].而本研究结果显示, 在一些低pH土壤中, 氨氧化古菌在所有氨氧化微生物中的比例并不高, 如红壤(图 4中E-4)为3.73%, 砖红壤(图 4中E-5)为39.51%; 这与于涌杰[38]对中国东南部红壤的氮转化的研究结果类似.土壤是一个复杂的异质体系, 除了pH外, 土壤养分含量、植被等都会对微生物的群落结构造成影响.如叶磊等[39]对白洋淀湖滨湿地岸边带氨氧化古菌与氨氧化细菌分布特性的研究表明, 氨氧化过程并不是完全由氨氧化古菌主导完成, 在氨氮浓度较低的区域确实是氨氧化古菌占主导地位, 而在氨氮水平较高的区域, 氨氧化古菌并非起主要作用.路璐等[40]的研究表明, 植被因素也是影响土壤微生物群落结构的重要因素之一, 不同林分土壤的氨氧化微生物群落结构存在明显的分异特征.
有研究指出微生物的群落构建是基于功能基因而非物种[41].从基于功能基因的性状角度考虑微生物的群落构建, 驱动群落物种之间共存的主要过程是环境过滤和相似性限制, 那么群落构建则是区域物种库中的物种经过多层环境过滤和生物相互作用形成局域物种库的筛选过程[42].环境因子和生物相互作用两个基本驱动力共同形成土壤微生物的群落结构并维持着群落物种多样性, 具体影响因素仍有待进一步探究.
此外, 除了生态过程, 群落内现有的物种组成还是进化过程的结果, 利用系统发育树可以从进化角度深入地分析群落物种的组成现状和原因, 这主要是通过比较群落内物种间的谱系距离与随机模型下的谱系距离是否有显著差异来揭示群落的构建机制[43], 若结果表现为谱系聚集, 则环境过滤占主导地位, 若为谱系发散, 则相似性限制占主导地位.因此, 未来可以整合功能性状和系统发育分析, 以更好地解释群落构建成因.
4 结论(1) 5种森林土虽然相隔甚远, 且土壤理化性质各不相同, 但却有着相同的氮代谢途径特征, 即氨同化过程是检出频率最高的氮转化途径, 而固氮和厌氧氨氧化是检出频率较低的氮代谢途径.
(2) 不同森林土中参与同一氮代谢途径的微生物的群落结构不尽相同.
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