2021, Vol. 42
2. 农业农村部环境保护科研监测所, 天津 300191;
3. 广西壮族自治区农业科学院资源与环境研究所, 南宁 530007
, LIU Yue-min1
, HUANG Yong-chun2 , WANG Chang-rong2 , LIU Bin3 , LIU Zhong-qi2 , HUANG Yi-zong2 , HUANG Yan-fei3 , ZHANG Chang-bo2
2. Agro-Environmental Protection Institute, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Tianjin 300191, China;
3. Agricultural Resources and Environment Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China
随着我国工、农业生产活动的迅猛发展, 耕地土壤重金属污染问题愈加凸显.重金属在土壤中具有不可降解性[1]、生物蓄积性[2, 3]和沿食物链传递性[4], 因此土壤重金属污染给农业生产、食品安全以及人体健康都造成潜在的巨大威胁.在已知的土壤重金属污染物中, 又以镉污染最为突出[5].土壤中的镉具有较强的迁移性, 尤其易于被大宗粮食作物如水稻[6]和小麦[7]吸收并在籽粒中富集.如何修复现有中、轻度重金属污染土壤, 使现有耕地生产出合格农产品已经成为社会各界广泛关注的热点问题.
为使重金属污染耕地土壤发挥出正常的农业生产功能, 现已开发出多种土壤修复技术, 如土壤重金属钝化技术[8]、植物修复技术[9]、种植低积累品种[10]和水肥调控相关农艺调控措施[11]等.在众多修复技术中, 植物修复技术通过采用种植超积累植物来吸收富集土壤中的重金属[12], 此法相比其他物理和化学法, 具有成本低廉、简单高效且兼具美化环境等优点[13].然而由于重金属超积累植物往往存在生长缓慢、生物量较小且重金属在土壤中存在多种不同化学形态等问题, 单独采用植物修复技术效率较低, 为加速植物从土壤中吸收和富集土壤重金属, 提高植物修复效率, 在植物修复过程中往往需要向土壤中添加强化萃取剂如EDTA[14]和柠檬酸[15]等化学强化萃取剂.但是, 这些物质过量添加可能对土壤造成二次污染.在这种背景下, 植物根际促生菌(PRPG)[16]和植物内生菌[17, 18]与超积累植物联合使用提高重金属污染土壤修复效率的研究得到广泛重视.
在长期相互作用下, 植物内生菌与宿主植物间结成了稳定的共生关系.内生菌可通过多种途径定殖于宿主植物中, 植物为其提供营养环境而内生菌则能通过分泌赤霉素[19, 20]和生长素[21]等物质促进植物生长, 此外内生菌还可通过产生铁载体[22]、生物固氮[23, 24]和溶磷[25]等作用为宿主植物提供营养物质, 减轻植物的非生物胁迫.邓平香等[26]通过接种植物内生荧光假单胞菌从而显著增加了东南景天对土壤镉的吸收能力.Li等[27]将1株内生细菌接种到苏丹草中显著提高了苏丹草对铜离子的萃取效率.这种超积累植物和内生菌的联合工艺相比较传统的植物修复技术来说, 有效提高了对重金属污染土壤的修复效率, 而且更加高效、无二次污染且低成本, 具有较好的应用前景.
本课题组从广西桂平市重金属污染稻田水稻根系中分离获得1株编号为R-13植物内生菌, 经鉴定为红苍白草螺菌(Herbaspirillum rubrisubalbicans).本文研究了R-13菌株对重金属镉的耐受性以及产铁载体、分泌吲哚乙酸(IAA)、溶磷和固氮等促生能力, 并通过盆栽试验研究了菌株R-13在龙葵根系定殖的时间动态变化及强化龙葵吸收镉的能力.
1 材料与方法 1.1 材料水稻根系样品：分离植物内生菌的水稻根系样品采集自广西桂平市重金属污染稻田.
固体培养基：LB培养基、Pikovskaya's培养基、CAS培养基和Ashby培养基.
主要试剂：青霉素、链霉素、铬天青、色氨酸、十六烷基三甲基溴化铵和哌嗪二乙醇磺酸购于中国医药集团有限公司.
Biolog GENⅢ微孔板：购于美国BIOLOG中国代理; 龙葵种子(黑悠悠)：购于寿光市嘉运农业科技有限公司; 盆栽土壤：采集自广西壮族自治区桂平市重金属污染稻田.
1.2 菌株分离将采集的水稻样品根部用自来水冲洗干净, 挑选出生长良好且健康的幼根(颜色较浅的根系).用无菌剪刀剪下后放入无菌培养皿中用无菌水反复清洗表面附着的泥沙等杂质.在无菌操作台中将水稻根系样品剪成2~3 cm小段.依次用配制好的70%酒精消毒2 min, 5%的次氯酸钠消毒10 min, 抗生素溶液(0.05%青霉素, 0.05%氨苄青霉素, 0.05%链霉素, 0.05%四环素)消毒15 min.将消毒后的根系样品用无菌水反复清洗5次, 取100 μL最后1次无菌水洗液涂布于LB固体培养基平板表面, 于28℃下恒温培养3 d作为表面消毒的对照(若对照平板无菌落形成则证明表面消毒充分, 后续步骤所分离获得的均为植物内生菌).
将消毒后的根用无菌手术刀切去两端, 切成2~3 mm的小段, 将小段均匀放置在装有LB固体培养基直径9 cm的培养皿表面(每皿放4~6个小段).将样品放入28℃恒温培养箱中培养3~7 d, 挑选培养基表面长出的单菌落, 在LB固体培养基上进行划线传代.传代3次后将菌株保存在25%的甘油管中, 于-20℃下保存[28].
1.3 菌株特性 1.3.1 菌株R-13对镉的耐受性分别配制含有不同含量Cd2+(氯化镉, 0、30、60、90、120、180、240、300和360 mg·kg-1)的固体LB培养基, 灭菌并冷却至40~50℃后倒入24孔无菌塑料板中, 用接种环挑取少量纯化后的单菌落划线接种于培养基表面, 置于28℃恒温培养箱中, 培养1周后, 观察菌落的生长状况.
1.3.2 菌株R-13产铁载体能力参照文献[29]的方法：将铬天青(CAS)溶于双蒸水中, 并与适量FeC13溶液混匀, 得到溶液a; 将适量十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶于双蒸水中混匀得溶液b; 将a液缓慢加入b液中, 充分混匀即得溶液c.将适量10×MM9盐溶液和哌嗪二乙醇磺酸加入盛有双蒸水的洁净三角瓶中, 混匀后用NaOH溶液调节pH至6.8, 再加入琼脂粉得培养基d.分别量取灭菌后的CaCl2溶液、MgSO4·7H2O、葡萄糖溶液和酪蛋白氨基酸加入培养基d中.再沿瓶壁加入染液c, 充分摇匀, 即得蓝色检测培养基.将菌株点接于检测培养基平板中, 置于生化培养箱中于30℃下培养48 h.观察菌落周围有无黄色晕圈, 出现晕圈时说明有铁载体产生.
1.3.3 菌株R-13的溶磷作用参照文献[30]的方法, 将菌株R-13在LB液体培养基上活化24 h后, 取10 μL菌液点接到Pikovskaya's固体培养基上, 每皿接种两滴, 重复4次. 30℃下培养48 h, 观察菌落周围是否出现明显的亮圈, 如果有亮圈出现即说明该菌株对无机磷化合物有溶解作用.
1.3.4 菌株R-13产IAA能力参照文献[31]的方法, 配制2.5 mg·mL-1的色氨酸溶液, 过滤除菌.将LB液体培养基按每管4 mL分装于试管中, 于121℃灭菌后加入适量无菌色氨酸溶液.接入培养24 h菌液0.1 mL, 培养12 h后, 吸取2 mL菌液并加入4 mL显色液观察.呈粉红颜色者为阳性, 否则为阴性, 通过颜色反应确定该菌株有无产生IAA的能力.
1.3.5 菌株R-13固氮能力参照文献[32]的方法, 用接种环挑取菌落在Ashby琼脂平板上划线, 置于30℃恒温生化培养箱中培养5~7 d, 观察菌株的生长状况.若菌株生长良好, 则表明菌株具有一定的固氮能力.
1.3.6 菌株16S rDNA序列分析16S rDNA序列分析: 按照文献[33]的方法提取R-13菌株基因组DNA并以此为模板进行PCR扩增. 16S rDNA的PCR扩增引物：(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′, 5′-ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3′).PCR扩增条件: 95℃ 5 min; 94℃ 1 min, 56℃ 1 min, 72℃ 3 min, 40个循环.PCR产物测序由北京宝杰罗生物科技有限公司完成, 将所测得16S rDNA序列与GenBank数据库中16S rDNA进行相似性比较, 利用MEGA7软件绘制系统发育树.
1.3.7 菌株生理生化分类测试利用Biolog GENⅢ微孔板进行菌株唯一碳源利用试验[34].利用非苛养非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒(API20NE), 进行菌株氧化还原活性及底物同化试验.
1.4 龙葵盆栽种植 1.4.1 龙葵种子预处理取龙葵种子(黑悠悠)放入烧杯中, 用去离子水反复冲洗3遍, 5%过氧化氢浸泡30 min, 再用去离子水冲洗3遍.清洗后的种子用0.1 g·L-1过氧化氢浸泡20 h, 常温晾干后备用.
1.4.2 盆栽种植将晾干后的龙葵种子分散在铺有经无菌水润湿滤纸的大培养皿中, 放置于恒温培养箱中在28℃下催芽1~2 d.将萌动露白的种子移入蛭石盘中, 每孔放置1~2粒种子, 保持蛭石湿润.待龙葵幼苗长至7~8片叶时, 选取大小相同的幼苗移栽至盛有4 kg稻田镉污染土壤的花盆中.
1.4.3 接种菌液处理将R-13菌株接种于LB液体培养基中, 在28℃下于回旋式摇床上以150 r·min-1培养48 h, 用稀释平板法测得其菌密度6.2×108 CFU·mL-1后备用.待龙葵幼苗在花盆中缓苗10 d后进行接种菌液处理.分别设定根际接种量为20、40、80、100、200和400 mL(菌密度6.2×108 CFU·mL-1)6个处理, 每个处理5次重复, 同时设定接种相同体积LB液体培养基的空白对照处理.待龙葵果实长至紫色后采集全株样品.将采集的植株用剪刀分为根系、茎秆、叶片和果实这4个部分, 常温下晾干备用.
1.4.4 测定R-13定植效果将R-13菌液40 mL(菌密度6.2×108 CFU·mL-1)加入至龙葵盆栽中, 在第1次接种菌液后3、5和7 d时间点取龙葵根部样品, 第7 d取样后进行第2次接种, 施加菌液40 mL(菌密度6.2×108 CFU·mL-1), 在第2次接种后3、5和7 d时间点取龙葵根部样品.所采样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序, 分析其根系内生菌群相对丰度.
1.4.5 镉含量测定将晾干后的龙葵样品在粉碎机上粉碎成粉末.称取0.2 g样品粉末于消解管中, 加入7 mL浓硝酸和1 mL过氧化氢在常温下浸泡隔夜.将消解管放入电热消解仪(Digi Block ED54)进行消解, 110℃加热消解2.5 h后冷却至室温, 加入1 mL过氧化氢摇匀, 110℃继续加热1.5 h, 最后于170℃将消解管内的液体浓缩至0.5 mL以内, 去离子水稀释至10 mL后转移至25 mL容量瓶中并定容, 采用石墨炉-原子吸收法测定样品中的镉含量[35].
2 结果与分析 2.1 植物内生菌R-13对镉的耐受能力利用LB培养基, 从采集的根系样品中共计分离获得36株植物内生细菌.将获得的纯培养菌株接种在含有不同含量Cd2+的LB固体培养基上, 3 d后可清晰地观察到菌株在培养基表面的生长情况, 部分抗性最强菌株生长情况如表 1所示.
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表 1 分离获得的部分内生菌的耐镉性能1) Table 1 Tolerance of screened endophytes to cadmium |
从表 1可知, 分离获得的部分菌株均对Cd2+具有较强的耐受性, 当培养基中添加Cd2+含量达到60 mg·kg-1时, 大部分菌株在培养基表面生长良好.但是当Cd2+含量达到90 mg·kg-1时, 分离到的36株菌株中共有28株菌株生长受到完全抑制, 只有8株菌株在培养基表面可见菌苔出现.当培养基中Cd2+含量进一步上升达到300 mg·kg-1时, 只有编号为R-13的菌株在培养基表面仍有菌苔出现.因此, 下一步试验中继续选用编号为R-13的菌株进一步开展详细研究.
2.2 内生菌R-13显微形态观察及菌株特性在10×100(目镜×物镜)倍光学显微镜下观察到R-13菌株的细胞形态如图 1(a)所示, 菌株R-13细胞形态为长杆状, 革兰氏染色结果显示为阴性.
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图 1 内生菌R-13的菌株特性 Fig. 1 Characteristics of endophyte strain R-13 |
如图 1(b)所示, 与CK对照试管相比, 在接种R-13菌株的试管中可产生鲜艳的粉红色, 说明内生菌R-13具有产吲哚乙酸(IAA)能力.
如图 1(c)所示, 在菌苔周围产生大面积的黄褐色晕圈, 说明内生菌R-13具有产生铁载体的功能.
如图 1(d)所示, 在R-13菌苔周围仅可见一条极微弱透明亮圈, 说明内生菌R-13溶解无机磷化合物的能力较弱.
如图 1(e)和1(f)所示, 与CK对照相比R-13菌株在无氮源添加的Ashby琼脂培养基上仍能生长, 说明内生菌R-13具有一定固氮作用.
2.3 菌株R-13的生理生化分类鉴定利用Biolog GENⅢ微孔板对菌株R-13进行的唯一碳源利用试验结果表明, 菌株R-13可以利用α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖、1% 乳酸钠、D-山梨醇、D-葡糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、D-天冬氨酸、利福霉SV、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、林可霉素、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖酸内酯、D-葡糖酸、D-葡萄糖醛酸、葡糖醛酰胺、奎宁酸、糖质酸、万古霉素、四唑紫、四唑蓝、p-羟基苯乙酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、D-苹果酸、L-苹果酸、萘啶酸、乙酸、甲酸和丁酸钠等作为唯一碳源.
对菌株进行的API20NE测试结果如表 2所示, 菌株R-13具有硝酸盐还原活性、发酵葡萄糖产酸活性、精氨酸二水解酶活性和脲酶活性.同化葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、葡萄糖酸盐、癸酸、己二酸、苹果酸、柠檬酸钠和苯乙酸的活性.
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表 2 菌株R-13的API20NE测试结果1) Table 2 API20NE test results for strain R-13 |
2.4 内生菌R-13的16S rDNA序列分析
以R-13菌株基因组为模板进行PCR扩增, 产物经纯化后进行碱基序列测定.R-13的16S rDNA基因序列全长1 394 bp.将测得的基因序列提交至GenBank与数据库中已有模式菌株进行比对.利用MEGA7软件采用邻位连接法构建菌株与相关模式菌株的16S rDNA系统发育树, 进行1 000次的相似度重复计算, 结果如图 2所示.
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图 2 R-13菌株系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic neighbor-joining tree based on 16S rDNA gene sequences analysis |
如图 2所示, R-13菌株在系统发育树中与草螺属中的Herbaspirillum rubrisubalbicans相似度最高, 相似度可达到85%.综合菌株显微形态学观察、碳源利用试验和16S rDNA测试结果将R-13菌株鉴定为红苍白草螺菌(Herbaspirillum rubrisubalbicans).
2.5 接种R-13对龙葵根部草螺菌属种群相对丰度影响根部接种R-13菌液3 d和5 d后龙葵根部草螺菌属种群变化如图 3和图 4所示, 样品采样时间如表 3所示.
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图 3 龙葵根系内生菌群组成 Fig. 3 Composition of plant endophytes in Solanum nigrum L. roots |
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图 4 龙葵根系草螺菌属(Herbaspirillum)相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of Herbaspirillum in roots of Solanum nigrum L. |
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表 3 草螺菌属在龙葵根系内的时间动态变化 Table 3 Temporal dynamics of Herbaspirillum in the root of Solanum nigrum L. |
如图 4所示, 接种R-13菌液(菌密度6.2×108 CFU·mL-1)40 mL 1次间隔3 d后龙葵根部草螺菌属的相对丰度显著增加, 与空白对照组(CK)相比增加了201.88%; 接种后5 d草螺菌属的相对丰度相比接种后3 d明显下降了35.75%, 此时相对丰度接近CK但仍高于CK; 随着时间延长至接种后7 d时, 龙葵根系内草螺菌属相对丰度仍高于CK对照98.95%.
接种1次R-13菌液后7 d时进行第2次接种.接种R-13菌液2次相对于接种1次可大幅增加草螺菌属在龙葵根部的相对丰度.第2次接种R-13菌液间隔3 d后可见龙葵根部草螺菌属的相对丰度比CK增加1 182.44%, 间隔5 d后草螺菌属相对丰度相比3 d仍大幅度降低了61.50%, 但仍高于CK对照393.82%; 随着时间延长至接种后7 d时, 龙葵根系内草螺菌属相对丰度仍高于CK对照393.82%.
2.6 接种内生菌R-13对龙葵吸收镉的影响接种植物内生菌R-13对龙葵各器官中镉含量的影响如图 5所示, 接种菌液密度均为6.2×108 CFU·mL-1.如图 5(a)所示, 当R-13的接种量为20 mL·pot-1时, 对龙葵的根、茎、叶和果中镉含量无显著影响.
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不同小写字母表示处理间差异达到5%显著水平(n=5) 图 5 接种R-13菌液对龙葵各器官镉含量的影响 Fig. 5 Effect of R-13 inoculation on cadmium content in different organs of Solanum nigrum L. |
如图 5(b)~5(d)所示, 当R-13的接种量超过40 mL·pot-1时, 显著增加了龙葵的根、茎和叶这3种营养器官中镉含量, 但是对果实中镉含量无显著影响.随着接种量的增加, 龙葵根系中镉含量呈现出逐渐增加的趋势.当接种量达到100 mL·pot-1时, 根系中镉含量达到4 mg·kg-1.在龙葵各营养器官中叶片镉含量最高, 当接种菌液100 mL·pot-1时与对照组相比叶片中镉含量提高了69.92%.
如图 5(e)所示, 当R-13的接种量达到200 mL·pot-1时, 龙葵的根、茎、叶及果实中镉含量均出现显著增加.与对照组相比根、茎、叶和果实中镉含量分别提高84.42%、43.67%、64.06%和20.29%.此时, 营养器官中镉含量也高于各接种处理组[图 5(a)~5(d)]中镉含量, 叶片中镉含量达到12.59 mg·kg-1.
如图 5(f)所示, 持续增加R-13接种量至400 mL·pot-1时并未持续显著增加龙葵的根、茎、叶和果实中镉含量.表明最佳接种量为200 mL·pot-1(菌密度6.2×108 CFU·mL-1).
3 讨论利用超积累植物通过吸收富集来移除土壤重金属是一种重要的土壤修复治理技术, 受到世界各国广泛关注[36].其通过接种植物根际促生菌[16]或植物内生菌[17]与超积累植物产生协同作用, 可显著提高超积累植物的修复效率[37].通常土壤菌群由于结构复杂, 对外来菌群具有较强竞争优势, 一些土壤环境因素[38]如土壤含水量、土壤肥力和土壤温度等对根际促生菌株定殖也有较大影响, 因此如何使接种的根际促生菌高效定殖在植物根系表面一直是困扰学界的难题.相对于根际菌群, 植物内生菌则可定殖在环境较为稳定的植物内部, 而且可以和植物形成互惠互利的共生关系, 从而更加有利于植物内生菌的定殖, 因此采用内生菌联合超积累植物进行重金属污染土壤修复的技术日益受到重视[18].本研究从广西稻田分离获得1株植物内生菌, 编号R-13, 经鉴定为草螺菌属.有研究表明[39], 该类菌株具有促生、固氮和解磷等功能, 在重金属污染土壤植物修复中具有潜在应用前景.
植物内生菌定殖在植物体内后可通过分泌植物生长素来增强植物生长能力, 减轻植物的环境胁迫[7], 还可通过产铁载体[40]、溶磷[25]和生物固氮[8]等作用促进植物生长, 改善植物适应外部环境胁迫的能力.本研究中分离获得的草螺属植物内生菌R-13具有较强的产吲哚乙酸(IAA)、分泌铁载体及生物固氮能力, 但是溶磷能力较微弱.有研究表明, 部分草螺属内生菌具有生物固氮功能[41], 但是也有部分菌株不具备生物固氮能力[42].本研究中分离获得的草螺属内生菌株R-13具有一定的固氮能力表明其具备为共生植物提供额外氮源的潜力.铁载体是一种由微生物产生的高亲和力低分子量的金属螯合剂, 微生物铁载体对三价铁具有极强的络合作用, 一方面供给自身生长所需的铁元素能抑制有害微生物的生长繁殖, 另一方面铁载体在植物根际的大量沉积具有促进植物生长的作用.与此同时, 铁载体也会影响其他金属离子的迁移性, 因此产铁载体能力是筛选植物促生菌的一个重要指标[43].IAA是最常见的植物生长素类物质之一, 它参与了植物体内许多生理生化过程的调控, 可以促进细胞分裂、刺激植物根系发育、增大叶片和果实等, 对于促进植物生长发育具有重要的作用[44].综上可见, 本研究中分离获得的草螺属植物内生菌R-13具有较强的促进植物生长、解除重金属胁迫并促进超累积植物吸收富集土壤重金属的能力.
植物内生菌既可通过自然孔口如叶片气孔进入植物内部也可以通过植物伤口进入植物内部, 因此内生菌的接种方法比根际菌群更加多样化[45], 如采用灌根法使内生菌从根部定殖, 采用伤茎法和涂茎法使菌株从茎部定殖, 采用喷雾法使菌株从叶片进入从而定殖在植物内部.由于植物根际或根系内部同时存在多种共生菌群, 因此对接种菌株的定殖情况进行追踪往往比较困难, 传统方法通常采用抗生素标记法[46]或荧光标记[47]技术对菌株进行追踪, 而这两种方法存在基因漂移风险, 因此在应用范围上存在一定局限性且技术难度较大.本研究采用灌根法接种草螺属植物内生菌R-13并采用高通量测序技术追踪菌株定殖情况, 结果发现草螺菌属在不接种菌液的对照处理根系中相对丰度极低, 仅为0.132 7%, 接种菌液1次后3 d时根系内的草螺菌属相对丰度达到最大值, 此时根系内草螺属相对丰度与CK对照相比增加了201.88%, 说明灌根接种法可使R-13菌株成功定殖在龙葵根系内部, 接种5 d后草螺菌属在龙葵根系的相对丰度出现降低但仍维持在一个高于接种前的水平, 接种7 d后根系内菌株相对丰度与5 d时差异不大.而两次接种更加有利于菌株在根系的定殖, 接种两次菌液后3 d时龙葵根部草螺菌属的相对丰度比CK增加了1 182.44%, 这表明R-13在龙葵根系内的定殖情况在时间上处于动态变化过程中.与之相似的是, 刘涛[48]对1株内生芽孢杆菌在番茄根系内定殖情况的研究也表现出先增后减的时间动态变化趋势, 并于接种后15 d达到最大值.Plociniczak等[49]对1株植物内生假单胞菌在白芥子(Sinapis alba L.)根系定殖的研究也表现出先增加后减少的时间动态变化趋势, 并在接种后10 d达到顶峰.本研究中分离获得的草螺属植物内生菌R-13于接种后3 d在龙葵根系内相对丰度即达最大值, 说明该菌株在龙葵根系内的定殖能力较强, 可以迅速繁殖种群数量, 更加有利于菌株在根系内的定殖.
在本研究中, 当草螺属植物内生菌R-13接种量达到40 mL·pot-1时, 即开始显著增加龙葵的镉富集能力.此时, 龙葵营养器官根、茎和叶中镉含量与对照组相比分别增加52.02%、177.02%和43.75%, 但是对龙葵果实镉含量未产生显著影响, 而且叶片中累积的镉含量最高, 达到8.77mg·kg-1.当R-13接种量增加至200 mL·pot-1时, 叶片中累积的镉含量可达到12.58 mg·kg-1, 与对照组相比显著增加64.06%, 其它器官根、茎和果实中镉含量与对照相比分别显著增加84.42%、43.67%和20.29%.当继续增加R-13接种量达到400 mL·pot-1时, 叶片中镉含量达到13.21 mg·kg-1, 与对照组相比增加了76.06%, 与接种200 mL·pot-1相比并未产生大幅度增加, 其他器官根和茎中镉含量与对照组相比分别增加77.58%和33.64%.综合以上结果表明R-13最佳接种量为200 mL(菌密度6.2×108 CFU·mL-1), 此时可显著增加龙葵富集镉的能力.
4 结论(1) 分离获得的草螺属(H. rubrisubalbicans)植物内生菌R-13具有促进植物生长缓解植物环境胁迫的潜力.
(2) 分离获得的草螺属(H. rubrisubalbicans)植物内生菌R-13可在龙葵根系内迅速定殖.
(3) 接种分离获得的草螺属植物内生菌(H. rubrisubalbicans)R-13可显著增加龙葵各营养器官中镉含量.
| [1] |
刘立华, 杨正池, 赵露. 重金属吸附材料的研究进展[J]. 中国材料进展, 2018, 37(2): 100-108. Liu L H, Yang Z C, Zhao L. Research progress in adsorption materials for heavy metals[J]. Materials China, 2018, 37(2): 100-108. |
| [2] |
仝双梅, 侯文娟, 杨琴, 等. 六盘水市不同功能区土壤重金属蓄积特征及人群健康风险评估[J]. 环境与健康杂志, 2019, 36(3): 214-219. Tong S M, Hou W J, Yang Q, et al. Accumulation characteristic and health risk assessment of soil heavy metals in different functional areas in Liupanshui[J]. Journal of Environment and Health, 2019, 36(3): 214-219. |
| [3] |
李萌竹, 何作顺, 谷仕艳. 表观遗传学在镉毒性中的研究进展[J]. 现代预防医学, 2020, 47(1): 119-122. Li M Z, He Z S, Gu S Y. Advances on epigenetic regulation in the cadmium toxicity[J]. Modern Preventive Medicine, 2020, 47(1): 119-122. |
| [4] |
杜森, 周岩岩, 张黎. 应用碳氮同位素技术研究重金属在大亚湾食物网中的累积[J]. 应用生态学报, 2017, 28(7): 2327-2338. Du S, Zhou Y Y, Zhang L. Application of stable isotopes (δ13C and δ15N) in studies on heavy metals bioaccumulation in Daya Bay food web[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2017, 28(7): 2327-2338. |
| [5] |
于靖靖, 师华定, 王明浩, 等. 湘江子流域重点污染企业影响区土壤重金属镉污染源识别[J]. 环境科学研究, 2020, 33(4): 1013-1020. Yu J J, Shi H D, Wang M H, et al. Identification of soil cadmium pollution sources in affected areas of key pollution enterprises in Xiangjiang sub-Basin[J]. Research of Environmental Sciences, 2020, 33(4): 1013-1020. |
| [6] | Chen H P, Tang Z, Wang P, et al. Geographical variations of cadmium and arsenic concentrations and arsenic speciation in Chinese rice[J]. Environmental Pollution, 2018, 238: 482-490. DOI:10.1016/j.envpol.2018.03.048 |
| [7] |
杨玉敏, 陈春秀, 雷建容, 等. 四川推广小麦品种在镉胁迫下籽粒镉积累和生长响应[J]. 西南农业学报, 2018, 31(9): 1796-1801. Yang Y M, Chen C X, Lei J R, et al. Cadmium accumulation and growth of different Sichuan wheat varieties under cadmium stress[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2018, 31(9): 1796-1801. |
| [8] |
刘顺翱, 吴昊, 胡钧铭, 等. 农田重金属土壤健康钝化技术研究及应用趋势[J]. 农学学报, 2020, 10(3): 6-11. Liu S A, Wu H, Hu J M, et al. Heavy metal passivation technology for farmland soil health: research and application trend[J]. Journal of Agriculture, 2020, 10(3): 6-11. |
| [9] | Sumiahadi A, Acar R. A review of phytoremediation technology: heavy metals uptake by plants[J]. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, 2018, 142. DOI:10.1088/1755-1315/142/1/012023 |
| [10] |
林园园, 陈慧茹, 刘斌美, 等. 12C6+离子束诱变水稻籽粒Cd低积累突变体的研究[J]. 原子核物理评论, 2016, 33(4): 488-493. Lin Y Y, Chen H R, Liu B M, et al. Study on low-cadmium rice mutants induced by 12C6+ ion beam[J]. Nuclear Physics Review, 2016, 33(4): 488-493. |
| [11] |
冯英, 马璐瑶, 王琼, 等. 我国土壤-蔬菜作物系统重金属污染及其安全生产综合农艺调控技术[J]. 农业环境科学学报, 2018, 37(11): 2359-2370. Feng Y, Ma L Y, Wang Q, et al. Heavy-metal pollution and safety production technologies of soil-vegetable crop systems in China[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2018, 37(11): 2359-2370. DOI:10.11654/jaes.2018-0787 |
| [12] |
李燕, 马瑜, 朱海云, 等. 重金属污染土壤植物及其联合修复的研究进展[J]. 环境科学与技术, 2016, 39(S2): 299-303. Li Y, Ma Y, Zhu H Y, et al. Research progress on phytoremediation and its combination technology of heavy metal cotaminated soil[J]. Environmental Science & Technology, 2016, 39(S2): 299-303. |
| [13] | Patra D K, Pradhan C, Patra H K. Toxic metal decontamination by phytoremediation approach: concept, challenges, opportunities and future perspectives[J]. Environmental Technology & Innovation, 2020, 18. DOI:10.1016/j.eti.2020.100672 |
| [14] |
韩廿, 黄益宗, 魏祥东, 等. 螯合剂对油葵修复镉砷复合污染土壤的影响[J]. 农业环境科学学报, 2019, 38(8): 1891-1900. Han N, Huang Y Z, Wei X D, et al. Effect of chelating agents on remediation of cadmium and arsenic complex contaminated soil using oil sunflower[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2019, 38(8): 1891-1900. |
| [15] |
沈莉萍, 宗良纲, 蒋培, 等. 螯合剂和泥炭对苎麻吸收土壤镉的影响[J]. 环境科学, 2009, 30(9): 2767-2772. Shen L P, Zong L G, Jiang P, et al. Extraction of Cd by ramie from soils as affected by applications of chelators and peat[J]. Environmental Science, 2009, 30(9): 2767-2772. |
| [16] | Khan N, Bano A. Modulation of phytoremediation and plant growth by the treatment with PGPR, Ag nanoparticle and untreated municipal wastewater[J]. International Journal of Phytoremediation, 2016, 18(12): 1258-1269. DOI:10.1080/15226514.2016.1203287 |
| [17] |
古添源, 余黄, 曾伟民, 等. 功能内生菌强化超积累植物修复重金属污染土壤的研究进展[J]. 生命科学, 2018, 30(11): 1228-1235. Gu T Y, Yu H, Zeng W M, et al. Progress on the endophyte of hyperaccumulators and their beneficial role in heavy metal phytoremediation[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2018, 30(11): 1228-1235. |
| [18] | Ma Y, Rajkumar M, Moreno A, et al. Serpentine endophytic bacterium Pseudomonas azotoformans ASS1 accelerates phytoremediation of soil metals under drought stress[J]. Chemosphere, 2017, 185: 75-85. DOI:10.1016/j.chemosphere.2017.06.135 |
| [19] |
李冠军, 刘鑫铭, 梁安洁, 等. 两株木麻黄内生真菌代谢产物对NaCl胁迫的响应[J]. 应用与环境生物学报, 2019, 25(4): 902-908. Li G J, Liu X M, Liang A J, et al. Effects of NaCl stress on metabolites of two endophytic fungi of Casuarina equisetifolia[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2019, 25(4): 902-908. |
| [20] | Bilal L, Asaf S, Hamayun M, et al. Plant growth promoting endophytic fungi Asprgillus fumigatus TS1 and Fusarium proliferatum BRL1 produce gibberellins and regulates plant endogenous hormones[J]. Symbiosis, 2018, 76(2): 117-127. DOI:10.1007/s13199-018-0545-4 |
| [21] | Zerrouk I Z, Rahmoune B, Auer S, et al. Growth and aluminum tolerance of maize roots mediated by auxin-and cytokinin-producing Bacillus toyonensis requires polar auxin transport[J]. Environmental and Experimental Botany, 2020, 176. DOI:10.1016/j.envexpbot.2020.104064 |
| [22] |
雷平, 黄军, 黄彬彬, 等. 1株产铁载体辣椒内生细菌的分离鉴定及其促生长作用[J]. 激光生物学报, 2020, 29(4): 379-384. Lei P, Huang J, Huang B B, et al. Isolation, identification and growth promoting effect of a siderophore-producing endophytic bacterium from capscium[J]. Acta Laser Biology Sinica, 2020, 29(4): 379-384. DOI:10.3969/j.issn.1007-7146.2020.04.012 |
| [23] | Puri A, Padda K P, Chanway C P. Can naturally-occurring endophytic nitrogen-fixing bacteria of hybrid white spruce sustain boreal forest tree growth on extremely nutrient-poor soils?[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2020, 140. DOI:10.1016/j.soilbio.2019.107642 |
| [24] | Rai A, Kumar S, Bauddh K, et al. Improvement in growth and alkaloid content of Rauwolfia serpentina on application of organic matrix entrapped biofertilizers (Azotobacter chroococcum, Azospirillum brasilense and Pseudomonas putida)[J]. Journal of Plant Nutrition, 2017, 40(16): 2237-2247. DOI:10.1080/01904167.2016.1222419 |
| [25] | Zega A, Suryanto D, Yurnaliza. An ability of endophytic bacteria from nutgrass (Cyperus rotundus) from lafau beach of north nias in producing indole acetic acid and in solubilizing phosphate[J]. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, 2018, 130. DOI:10.1088/1755-1315/130/1/012007 |
| [26] |
邓平香, 张馨, 龙新宪. 产酸内生菌荧光假单胞菌R1对东南景天生长和吸收、积累土壤中重金属锌镉的影响[J]. 环境工程学报, 2016, 10(9): 5245-5254. Deng P X, Zhang X, Long X X. Effects of acid producing endophytic bacteria Pseudomonas fluorescens R1 on the growth responses, Zn and Cd accumulation in Sedum alfredii[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2016, 10(9): 5245-5254. |
| [27] | Li Y, Wang Q, Wang L, et al. Increased growth and root Cu accumulation of Sorghum sudanense by endophytic Enterobacter sp. K3-2:Implications for Sorghum sudanense biomass production and phytostabilization[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2016, 124: 163-168. DOI:10.1016/j.ecoenv.2015.10.012 |
| [28] | Ahlich K, Sieber T N. The profusion of dark septate endophytic fungi in non-ectomycorrhizal fine roots of forest trees and shrubs[J]. New Phytologist, 1996, 132(2): 259-270. DOI:10.1111/j.1469-8137.1996.tb01845.x |
| [29] |
王东升, 王立立, 李取生, 等. 产铁载体菌对龙葵修复土壤Cd污染的促进效应[J]. 环境工程学报, 2018, 12(8): 2311-2319. Wang D S, Wang L L, Li Q S, et al. Enhancing effect of siderophore-producting bacteria on remediation of cadmium-contaminated soil by Solanum nigrum L[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2018, 12(8): 2311-2319. |
| [30] |
李章雷, 刘爽, 王艳宇, 等. 5株耐盐碱促生细菌的筛选鉴定及其对红小豆的促生作用[J]. 微生物学通报, 2021, 48(5): 1580-1592. Li Z L, Liu S, Wang Y N, et al. Screening and identification of five Saline-alkali tolerant growth-promoting bacterial strains and its promoting effect on red adzuki bean[J]. Microbiology China, 2021, 48(5): 1580-1592. |
| [31] | Mehmood A, Khan N, Irshad M, et al. IAA producing endopytic fungus Fusariun oxysporum wlw colonize maize roots and promoted maize growth under hydroponic condition[J]. European Journal of Experimental Biology, 2018, 8(4). DOI:10.21767/2248-9215.100065 |
| [32] |
陆依琳, 赵晴雨, 彭学. 2株固氮菌的分离与鉴定[J]. 江苏农业科学, 2020, 48(16): 298-302. Lu Y L, Zhao Q Y, Peng X. Isolation and identification of 2 strains of nitrogen-fixing bacteria[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2020, 48(16): 298-302. |
| [33] |
陈佩, 岳巧云, 刘德星, 等. 适用于二代测序技术的细菌DNA提取方法的比较研究[J]. 检验检疫学刊, 2018, 28(2): 55-60, 29. Chen P, Yue Q Y, Liu D X, et al. Comparative study on bacterial DNA extraction methods for NGS technique[J]. Journal of Inspection and Quarantine, 2018, 28(2): 55-60, 29. |
| [34] | Wragg P, Randall L, Whatmore A M. Comparison of Biolog GEN Ⅲ MicroStation semi-automated bacterial identification system with matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry and 16S ribosomal RNA gene sequencing for the identification of bacteria of veterinary interest[J]. Journal of Microbiological Methods, 2014, 105: 16-21. DOI:10.1016/j.mimet.2014.07.003 |
| [35] | Liu Y, Zhang C B, Zhao Y L, et al. Effects of growing seasons and genotypes on the accumulation of cadmium and mineral nutrients in rice grown in cadmium contaminated soil[J]. Science of the Total Environment, 2017, 579: 1282-1288. DOI:10.1016/j.scitotenv.2016.11.115 |
| [36] |
魏树和, 周启星, 王新. 超积累植物龙葵及其对镉的富集特征[J]. 环境科学, 2005, 26(3): 167-171. Wei S H, Zhou Q X, Wang X. Cadmium-hyperaccumulator Solanum nigrum L. and its accumulating characteristics[J]. Environmental Science, 2005, 26(3): 167-171. DOI:10.3321/j.issn:0250-3301.2005.03.034 |
| [37] |
陈可, 胡南, 陈威, 等. 两种植物根际促生菌对博落回抗干旱及富集铀性能的增强作用研究[J]. 环境科学学报, 2018, 38(10): 4142-4149. Chen K, Hu N, Chen W, et al. Effects of two plant growth promoting rhizobacteria on drought resistance and uranium bioaccumulation abilities by Macleaya cordata[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2018, 38(10): 4142-4149. |
| [38] |
王媛. 生物炭配施植物根际促生菌(PGPR)对作物生长及土壤理化和生物性状的影响[D]. 泰安: 山东农业大学, 2019. 1-4. Wang Y. Effects of biochar combined with plant growth promoting rhizobacteria(PGPR) on crop growth and soil physical, chemical and biological properties[D]. Taian: Shandong Agricultural University, 2019. 1-4. |
| [39] | Andreozzi A, Prieto P, Mercado-Blanco J, et al. Efficient colonization of the endophytes Herbaspirillum huttiense RCA24 and Enterobacter cloacae RCA25 influences the physiological parameters of Oryza sativa L. cv. Baldo rice[J]. Environmental Microbiology, 2019, 21(9): 3489-3504. DOI:10.1111/1462-2920.14688 |
| [40] |
韩辉, 王晓宇, 蔡红, 等. 重金属固定植物促生细菌的筛选及其阻控小麦富集重金属效应[J]. 环境科学, 2019, 40(7): 3339-3346. Han H, Wang X Y, Cai H, et al. Isolation of heavy metal immobilizing and plant growth-promoting bacteria and its effects on reducing heavy metal accumulation in wheat[J]. Environmental Science, 2019, 40(7): 3339-3346. |
| [41] |
林标声, 范锦琳, 宋昭昭, 等. 巨菌草不同生长时期的内生固氮菌群组成分析[J]. 微生物学通报, 2018, 45(7): 1479-1490. Lin B S, Fan J L, Song Z Z, et al. Endophytic diazotrophs composition of Pennisetum sp. at different growth stages[J]. Microbiology China, 2018, 45(7): 1479-1490. |
| [42] |
刘伟林, 占桂婷, 王婷, 等. 草螺菌Herbaspirillum sp. WT00F的生理生化性质和促生作用研究[J]. 湖北大学学报(自然科学版), 2017, 39(3): 291-298, 304. Liu W L, Zhan G T, Wang T, et al. Physiochemical properties and growth-promoting effects of Herbaspirillum sp. WT00F[J]. Journal of Hubei University (Natural Science), 2017, 39(3): 291-298, 304. DOI:10.3969/j.issn.1000-2375.2017.03.014 |
| [43] | Dahlheimer S R, Neal C R, Fein J B. Potential mobilization of platinum-group elements by siderophores in surface environments[J]. Environmental Science & Technology, 2007, 41(3): 870-875. |
| [44] | Liu Y, Shi Z Q, Yao L X, et al. Effect of IAA produced by Klebsiella oxytoca Rs-5 on cotton growth under salt stress[J]. Journal of General and Applied Microbiology, 2013, 59(1): 59-65. DOI:10.2323/jgam.59.59 |
| [45] |
王吉永, 郭龙妹, 高林怡, 等. 植物内生菌的侵染定殖研究概况[J]. 江苏农业科学, 2019, 47(14): 36-39. Wang J Y, Guo L M, Gao L Y, et al. Study overview on infection and colonization of plant endophytes[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2019, 47(14): 36-39. |
| [46] | 程杰杰, 殷超凡, 萨尔山别克·热阿合曼, 等. 固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A对玉米和水稻的促生作用及其根际定殖动态[J]. 江苏农业科学, 2018, 46(2): 33-37. |
| [47] |
刘雨晴, 许奕涵, 刘选明, 等. 内生白色链霉菌OsiSh-10对拟南芥根系结构的影响[J]. 基因组学与应用生物学, 2018, 37(8): 3503-3509. Liu Y Q, Xu Y H, Liu X M, et al. Effects of endophytic Streptomyces albus OsiSh-10 on Arabidopsis thaliana root architecture[J]. Genomics and Applied Biology, 2018, 37(8): 3503-3509. |
| [48] |
刘涛. 西宁地区番茄内生芽孢杆菌定殖规律及促生效应的研究[D]. 西宁: 青海师范大学, 2010. 46-53. Liu T. A study on the colonization and promoting plant growth of tomato endophytic bacillus in Xining area[D]. Xi'ning: Qinghai Normal University, 2010. 46-53. |
| [49] | Płociniczak T, Chodór M, Pacwa-Płociniczak M, et al. Metal-tolerant endophytic bacteria associated with Silene vulgaris support the Cd and Zn phytoextraction in non-host plants[J]. Chemosphere, 2019, 219: 250-260. DOI:10.1016/j.chemosphere.2018.12.018 |