2021, Vol. 42
2. 清华大学环境学院, 北京 100084
2. School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084, China
随着人工纳米材料(manufactured nanomaterials, MNMs)的广泛使用和产量的不断提高, 其环境暴露不断增加.已有越来越多的证据表明MNMs在水环境中的存在[1, 2], 其环境安全与健康风险难以忽视[3].尽管已有大量针对MNMs的生态毒性研究, 但是考虑到实际环境的复杂性, 分析单一污染物的毒性不足以满足环境风险评估的要求.因此研究MNMs和现存污染物的复合毒性作用已成为评估MNMs环境风险的一个主要内容[4~7].
纳米二氧化钛(nTiO2)作为典型MNMs, 其单独生态毒性以及与现存污染物的联合毒性已获得广泛研究[8, 9].有研究显示nTiO2在不同程度上促进了现存污染物的毒性效应.例如, 单独暴露于2 mg·L-1 nTiO2或2 μg·L-1三丁基锡不会影响鲍鱼(Haliotis diversicolor supertexta)的孵化或畸形率, 而联合暴露能够显著影响鲍鱼的孵化率和变形率, 表现出明显的协同效应[10].类似研究还有添加10 mg·L-1 nTiO2可以促进Cd2+在鲤鱼(Cyprinus carpio)中的积累[11].Yang等[12]的研究指出存在13.2 mg·L-1 nTiO2可以增强2 mg·L-1 Cd2+对四膜虫(Tetrahymena thermophile)生长的抑制作用. 2 mg·L-1 nTiO2的存在增加了Ag对大型蚤(Daphnia magna)的毒性, 其72 h EC50值降低了40%[13].Fan等[14]的研究证明, nTiO2(2 mg·L-1)显著增强了Cu2+对大型蚤(Daphnia magna)的毒性, LC50值从111 μg·L-1降低至42 μg·L-1.以上结果均表明nTiO2与现存污染物存在协同作用.但是需要指出, 在上述研究中nTiO2与现存污染物往往为单一浓度配比, 且nTiO2的浓度高于现存污染物浓度.在真实环境中MNMs的环境浓度较低[15, 16], 相对应的毒性效应甚至可能小于其现存污染物.然而nTiO2在低毒性效应或者与现存污染物等毒性效应下的联合毒性研究仍较少, 且目前仍不清楚nTiO2与现存污染物联合作用下生物的响应机制.
本研究以典型MNMs nTiO2与重金属镉(Cd2+)为研究目标, 以斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)为受试生物(该藻分布广泛、易于实验室培养, 是国内外典型的生态毒理学研究模式生物), 采用经典联合毒性实验方法考察在等效剂量(毒性比1∶1)下不同浓度组合的nTiO2和Cd2+对斜生栅藻的联合毒性作用模式, 并采用转录组学手段分析该联合毒性效应下生物的分子响应机制, 以期为客观评估MNMs与现存污染物的联合毒性作用, 深入理解其复杂的环境健康效应提供重要参考和研究基础.
1 材料与方法 1.1 实验材料nTiO2粉末(平均粒径≤15 nm, ≥99.5%)购买于南京埃普瑞纳米材料有限公司. CdCl2·(5/2)H2O(99.0%)购自天津市光复科技发展有限公司.制备OECD201培养基所需的化合物均购自上海阿拉丁实业有限公司, 纯度均高于99.0%.实验所涉及玻璃仪器在使用前均在HNO3(10%)中浸泡超过24 h, 随后使用自来水与超纯水分别冲洗3次.冲洗结束后高温灭菌(121℃, 15 min), 备用.
1.2 nTiO2在斜生栅藻培养液中的理化性质nTiO2粉末采用超纯水(Billerica, Millipore, 美国)超声处理10 min(功率密度50 W·L-1, 频率40 kHz), 制备nTiO2悬浮液(10 g·L-1).为了鉴定nTiO2在斜生栅藻培养体系中的特性, 使用OECD201培养基稀释nTiO2悬浮液至20 mg·L-1, 并置于摇床上, 设定离心力0.25 g, 保持旋转.定时收集0、24、48和72 h样品, 使用动态光粒度仪(DLS, DelsaNano, Beckman Coulter, 美国)对nTiO2的流体动力学直径、Zeta电位进行表征.用透射电子显微镜(TEM, FEI Tecnai GF30, 美国)对nTiO2进行团聚粒径、状态和形貌特征的检测.
1.3 斜生栅藻的培养实验所用模式生物斜生栅藻(S. obliquus, FACHB-417)获自中国科学院水生生物研究所, 并参照OECD标准方法进行培养[17].培养条件如下: 光暗比12 h∶12 h; 光强45 μmol·(m2·s)-1; 温度: 25℃±1℃; 摇床转速: 150 r·min-1.为使斜生栅藻生长状况稳定, 对其驯化4~5周后用于实验.
1.4 Cd2+和nTiO2对斜生栅藻的单独暴露实验设计遵循OECD标准方法[17].收集处于对数生长期的斜生栅藻, 并在无菌条件下以藻细胞浓度为2×104 cell·L-1的最终密度接种到新制备的培养基中.然后在培养体系中添加等体积的nTiO2或Cd2+测试溶液(用OECD培养基稀释储备液得到, nTiO2或Cd2+浓度为最终浓度的2倍)至设计浓度.每个实验单元的最终体积为100 mL. nTiO2终浓度为: 0.5、1、2.5、5、10、50和100 mg·L-1; Cd2+终浓度为: 0.001、0.002 5、0.005、0.007 5、0.01、0.025和0.05 mg·L-1.此外还准备了一个不含nTiO2或Cd2+的对照组.对照组与每个暴露组均设置3组平行.培养条件与上述相同.在暴露实验期间, 每24 h测量一次藻细胞密度.实验结束时, 根据OECD标准方法计算不同处理条件下藻类在72 h内的生长抑制率和EC50值[17].采用SPSS 20.0对数据进行方差分析(one way ANOVA)及Turkey's test分析, P<0.05表示有显著性差异.采用Origin进行相应图片的绘制.
1.5 Cd2++nTiO2联合暴露及其毒性效应评价方法联合毒性评价将污染物各自的EC50值定义为一个毒性单位(1 TU).本研究结果表明, nTiO2和Cd2+的EC50值分别为28.7 mg·L-1和0.011 mg·L-1, 相当于nTiO2和Cd2+的1 TU.在本实验中, 为考察两者毒性相同, 及毒性比1∶1下Cd2+与nTiO2的联合毒性作用, 依据污染物浓度的高低, 分别设置7个浓度组合(表 1), 考察各浓度组合对斜生栅藻的生长抑制情况, 并计算联合毒性下各污染物EC50值.
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表 1 不同实验组浓度配比/mg·L-1 Table 1 Concentration ratio of different experimental groups/mg·L-1 |
目前, 常用的联合毒性作用类型分为: 简单相加、协同、部分相加、单独和拮抗这5种作用模式[18, 19].本研究使用3种方法对联合毒性作用进行评价, 分别为毒性单位法(TU)、添加指数法(AI)和混合毒性指数法(MTI), 具体计算方法为[20]:
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式中, ci为化合物i的浓度; EC50i为化合物i半抑制浓度.
(1) 毒性单位法(TU)
TU=1, 相加作用; TU>TU0, 拮抗作用; TU<1, 协同作用; TU=TU0, 独立作用; TU0>TU>1, 部分加和作用.
(2) 相加指数法(AI)
当TU≤1.0时, AI=(1/TU)-1; 当TU≥1.0时, AI=1-TU.
当AI>0, 化学物质为大于相加作用, 而AI<0表示小于相加作用, AI=0表示等于相加作用.
(3) 混合毒性指数法(MTI)
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若MTI<0, 拮抗作用; 若MTI=0, 独立作用; 若0<MTI<1, 部分相加作用; 若MTI=1, 浓度相加作用; 若MTI>1, 协同作用.
1.6 转录组测序 1.6.1 样品制备、RNA提取和建库将斜生栅藻分别暴露于Cd2+(0.011 mg·L-1)和Cd2+(0.011 mg·L-1)+nTiO2(28.70 mg·L-1)中72 h, 按照TRIzol试剂盒(Molecular Research Center, 美国)要求进行RNA提取.然后使用RNeasy试剂盒(Qiagen, Valencia, 美国)分离总RNA.使用Agilent Bioanalyzer 2100系统(Agilent Technologies, 美国)分析评估RNA完整性.用带有Oligo(dT)的磁珠对提取的总RNA进行mRNA富集和纯化, 然后加入片段化试剂将mRNA打断成短片段, 以片段化的mRNA为模板合成一链cDNA和二链cDNA, 并使用试剂盒进行纯化回收、粘性末端修复和cDNA3′末端加上碱基“A”并连接接头, 然后进行片段大小选择, 最后进行PCR扩增.并在Agilent Bioanalyzer 2100系统上评估文库质量.在Illumina HiSeqTM 2000平台上进行测序.
1.6.2 差异表达基因筛选及分析测序得到的原始序列过滤掉低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的序列, 得到待分析数据.采用Trinity软件对待分析数据进行组装, 然后使用Tgicl将组装的转录本进行聚类去冗余得到Unigene.使用FPKM(每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片)值计算出标准化的转录本的数量, 然后将其用于计算每个单基因的相对表达水平.使用edgeR鉴定差异表达基因(DEG, Fold-change>2或<0.5, FDR<0.01, P<0.05).使用KOBAS进行了KEGG途径的富集.
2 结果与讨论 2.1 nTiO2在暴露体系中的动态变化透射电镜观察显示二氧化钛在OECD培养基中发生团聚, 其团聚体呈不规则形状, 长度达数百纳米到微米[图 1(a)].DLS测试也证实了nTiO2的团聚现象.结果表明, 随着暴露时间的延长, nTiO2的水力半径逐渐增大, 平均在3~5 μm之间, 0 h时粒径最小, 48~72 h时最大[图 1(b)].本研究表明, 随着暴露时间的延长, nTiO2在斜生栅藻培养基中聚集形成较大的聚集体.这些聚集体的结合形式相对松散, 边缘仍为纳米级结构. Zeta电位表明nTiO2悬浮液的表面电荷随着暴露时间的延长而增加.Zeta电位分布相对集中, 最高电位为-19.6 mV. nTiO2在不同时间的Zeta电位在-25 mV左右浮动[图 1(b)].由于Zeta电位绝对值较大, nTiO2在培养基中稳定存在.这一结果与类似研究中的文献报道相近[21, 22].
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(a)OECD201培养液中nTiO2的形貌特征, (b)nTiO2于OECD201培养液中平均水力半径和Zeta电位随时间的变化 图 1 nTiO2进入OECD201培养液中的团聚状态 Fig. 1 Agglomeration state of nTiO2 particles entering the OECD201 culture solution |
单独暴露于nTiO2和Cd2+后, 根据OECD标准方法得到毒性剂量方程式, 并计算得到nTiO2和Cd2+对斜生栅藻的72 h EC50值分别为28.7 mg·L-1和0.011 mg·L-1(表 2), 与前人所报道的EC50值相近[23, 24].
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表 2 各实验组对斜生栅藻生长抑制的剂量-效应关系及72 h EC50值 Table 2 Dose-effect relationship and the 72 h EC50 of each experimental group on the growth inhibition of Scenedesmus obliquus |
nTiO2单独暴露时对斜生栅藻的生长抑制具有明显的剂量-效应关系[图 2(a)].培养72 h后与对照组相比, 低浓度(0.5、1、2.5和5 mg·L-1)处理组中斜生栅藻的生长没有显著差异; 但高浓度(50 mg·L-1和100 mg·L-1)nTiO2显著抑制斜生栅藻的生长速率.斜生栅藻对镉的毒性非常敏感, 不同浓度的镉对斜生栅藻的毒性效应见图 2(b).随着镉浓度的增加, 藻细胞密度逐渐减小.镉对斜生栅藻的毒性可能与镉的表面吸附和内部积累有关.斜生栅藻表面带负电荷[25], 由于静电吸附和络合作用, 对镉具有较强的亲和力[26].Cd2+进入藻细胞后可竞争性地取代Ca2+和Mg2+[27], 抑制需要Ca2+或Mg2+的酶, 从而影响代谢活性和光合作用.此外, Cd2+会诱导产生活性氧, 触发氧化应激, 破坏细胞成分[28].
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(a)不同浓度nTiO2对斜生栅藻的生长抑制效应, (b)不同浓度Cd2+对斜生栅藻的生长抑制效应, (c)nTiO2与Cd2+毒性比1∶1时不同浓度组合对斜生栅藻的生长抑制效应, A表示斜生栅藻72 h生长曲线下所包围的面积, *表示P < 0.05 图 2 在不同浓度下nTiO2和/或Cd2+对斜生栅藻的生长抑制效应 Fig. 2 Varying concentrations of Cd2+ and/or nTiO2 inhibit the growth of Scenedesmus obliquus |
考察Cd2+与nTiO2在等毒性比1∶1时不同浓度组合对斜生栅藻的生长抑制作用, 并采用TU、AI和MTI这3种经典联合毒性评价方法研究Cd2+与nTiO2的联合毒性作用模式.结果如图 2(c)所示.在两者毒性比1∶1共存时, 各浓度组合依旧呈现出明显的毒性-剂量效应关系, 随着两者浓度的增高, 毒性效应逐渐增强.在浓度组合为(Cd2+∶nTiO2, mg·L-1)0.011∶28.7、0.022∶57.4和0.044∶114.8中斜生栅藻的生长受到显著抑制.通过计算, 得出Cd2++nTiO2不同组合下的72 h EC50值(表 2), 对于Cd2+和nTiO2而言, 72 h EC50值分别为0.019 mg·L-1和49.573 mg·L-1, 均高于单独暴露时所对应的EC50值.
进一步对上述结果采用3种联合毒性评价方法(TU、AI和MTI)评价联合毒性效应. 3种评价方法均显示当Cd2+与nTiO2毒性比1∶1时, 两者对斜生栅藻的联合毒性作用为拮抗效应(表 3).
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表 3 毒性比1∶1时Cd2+与nTiO2对斜生栅藻的联合毒性评价方法相关参数 Table 3 Parameters for evaluating the combined toxicity of Cd2+ and nTiO2 to Scenedesmus obliquus, at a toxicity ratio of 1∶1 |
2.4 转录组分析
为阐明nTiO2+Cd2+等效应剂量下对斜生栅藻呈拮抗效应的生物响应机制, 本文进一步开展了转录组测序和分析.转录组测序3组样品分别为对照、Cd2+和Cd2++nTiO2, 净读数分别为33 854 868、33 017 612和38 037 462 Mb, 并且所有样品的Q20值均高于96.96%, 能定位到参考序列上的测序序列数量在80.2%以上, 表明测序数据合格(表 4).
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表 4 测序数据产出质量情况 Table 4 Quality of sequencing data output |
与对照组相比, 在Cd2+和Cd2++nTiO2的暴露组中, 显著表达基因共428个.其中用Cd2+和Cd2++nTiO2分别与对照相比显著上调12个和312个单基因, 分别显著下调35个和93个基因(Fold-change>2或<0.5, FDR<0.01, P值<0.05, 图 3).此外, 通过比较Cd2+和对照组, 以及Cd2++nTiO2和对照组, 发现共同变化基因24个[图 3(c)], 这些都可能是涉及拮抗作用的关键基因.
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(a)Cd2+单独暴露组与对照组差异表达基因, (b)Cd2++nTiO2联合暴露组与对照组差异表达基因, (c)差异表达基因数量的维恩图 图 3 差异表达基因的分析 Fig. 3 Analysis of differentially expressed genes |
对Cd2+、Cd2++nTiO2和对照之间的24个共同差异基因进行KEGG通路富集分析(表 5).各实验组相较对照组的富集程度如图 4所示.可以将其归类为4个基本生物学功能: 精氨酸与脯氨酸代谢功能、光合作用功能、卟啉与叶绿素代谢功能和淀粉与蔗糖代谢功能.精氨酸与脯氨酸的主要作用是参与藻细胞的抗逆作用, 而光合作用、卟啉与叶绿素代谢和淀粉与蔗糖代谢主要涉及藻细胞的能量循环.
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表 5 显著富集通路与差异表达基因 Table 5 Significantly enriched pathways and differentially expressed genes |
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图 4 不同实验组相较于对照组显著富集的KEGG通路 Fig. 4 Significantly enriched KEGG pathway in each experimental group compared to the control |
藻细胞中的精氨酸主要作为氮素贮藏营养物, 也是生成多胺(PA)和一氧化氮(NO)的主要前体物质.而PA和NO都是生物参与抗逆生理生化过程的主要信使分子[29, 30].脯氨酸是植物蛋白质的重要组分之一, 在逆境胁迫下藻细胞体内会大量积累脯氨酸[31].脯氨酸的抗逆作用主要表现为稳定细胞渗透压、维护生物大分子结构、降低细胞酸性、解除氨毒以及作为能量库调节细胞氧化还原[32].因此精氨酸与脯氨酸的代谢通路在斜生栅藻抗逆作用中显得尤为重要, 并且两者的合成与转化有密切的联系.脯氨酸是由精氨酸通过两种主要途径进行合成, 一条途径是以谷氨酸为底物, 另一条途径是以鸟氨酸为底物.通常在受到胁迫的情况下, 脯氨酸的主要来源是谷氨酸, 相反在生存环境适宜时转向鸟氨酸途径[33].本研究发现藻细胞在受到Cd2+胁迫的时候开启了通过谷氨酸为底物合成脯氨酸的通路, 具体表现为astA作为该途径的关键基因显著上调, 与此同时控制鸟氨酸为底物的合成通路关键基因arg发生显著下调.这是藻细胞在受到Cd2+胁迫时通过调节脯氨酸合成途径适应逆境的表现.当在Cd2+与nTiO2共存时再次分析该转化通路发现astA与arg表达趋势发生对调, 意味着鸟氨酸成为主要底物.此时藻细胞生存状态与抗逆能力逐渐恢复正常(表 5).这表明有nTiO2参与联合暴露对斜生栅藻的胁迫能力低于Cd2+单独暴露, 同时藻细胞自生抗逆能力的调节也发挥了积极的作用.
除了抗逆涉及的精氨酸与脯氨酸代谢通路有显著变化之外, 有nTiO2参与的联合毒性效应比Cd2+单独存在时整体毒性效应降低还有一个重要的原因是, nTiO2联合暴露促进了斜生栅藻细胞的能量代谢, 其中主要包括叶绿素代谢、光合作用和淀粉与蔗糖的代谢这3个通路.在涉及光合作用的通路中发现关键基因psbA在Cd2+单独暴露时显著下调, 在联合暴露时显著上调, 该基因是光合系统Ⅱ(PSII)的主要调控基因[34].这表明nTiO2与Cd2+共存时nTiO2有可能促进了PSII的活性, 提高了光反应效率.而光反应的主要成分叶绿素在整个光合作用与能量循环中同样扮演着举足轻重的角色[34].叶绿素也是PSII反应的中心物质, 主要完成NADPH+的生成、水的光解、电子传递和产生O2, 从而参与藻细胞的能量循环[35].而在本研究中发现与光反应密切相关的叶绿素代谢通路也呈现出了类似的变化趋势.
光合作用主要的反应步骤包括光吸收、碳同化、光合磷酸化和电子传递.光反应与叶绿素的变化主要涉及光吸收、电子传递、光合磷酸化, 而碳同化过程作为光合作用最后的反应阶段, 其产物为以淀粉为主的富能有机物[36].在显著富集的通路中同时发现淀粉与蔗糖的代谢通路中关键基因AGL在联合暴露时表达量转为显著上调.这说明在整个藻细胞的能量循环过程中, 从储能物质的合成到代谢整个过程都在联合暴露下受到不同程度的正向刺激.
总体观察nTiO2与Cd2+的联合毒性低于Cd2+单独毒性, 呈现拮抗效应.其在生物响应层面的主要作用机制在于联合暴露导致藻细胞的能量代谢从光合作用合成富能化合物到该类化合物的代谢均有不同程度的促进.与此同时藻细胞通过调整抗逆机制也在一定程度上使其生长状态得以恢复.通过上述生物功能相互配合, Cd2+和nTiO2对斜生栅藻的等效联合作用表现为拮抗模式.
3 结论本文通过研究nTiO2与Cd2+对斜生栅藻的联合毒性效应并采用3种联合毒性评价方法(TU、AI和MTI)综合评估, 结果均显示两者在等效应剂量下呈现拮抗效应.运用转录组学分析该拮抗效应下的生物响应机制发现, nTiO2和Cd2+联合暴露促进了藻细胞的能量代谢, 具体涉及了光合作用、卟啉与叶绿素代谢和淀粉与蔗糖代谢3个通路.在藻细胞抗逆方面, 作为调节抗逆能力的主要物质精氨酸与脯氨酸的代谢通路富集较显著.从脯氨酸向精氨酸转化的通路变换也表明联合暴露对藻细胞的胁迫能力有所缓解.考虑到真实环境中以nTiO2为代表的MNMs的环境浓度较低, 本研究的结果表明仅单独关注nTiO2毒性或其与现存污染物的高浓度比联合毒性来分析nTiO2的环境风险是不全面的.总体而言, 该研究结果将为现存污染物和MNMs的环境和健康风险评估提供新的参考, 并为今后评估真实环境中纳米材料的生态毒性提供基础.
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