2021, Vol. 42
2. 中国科学院生态环境研究中心水污染控制实验室, 北京 100085
, FU Jia-qi1 , XIA Song1 , YI Qi-zhen1 , GUI Shuang-lin1 , WU Jiu-jiu1 , XIONG Ji-hai1 , WEI Yuan-song1,2
2. Laboratory of Water Pollution Control, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX)作为一种新型自养生物脱氮技术, 相比于传统生物脱氮技术能耗更低且效率更高[1], 在高氨氮废水处理领域具有广阔的应用前景[2], 已成为废水脱氮领域的研究热点.然而, 作为核心功能微生物的厌氧氨氧化菌(AnAOB), 其细胞产率低、生长速率慢且对环境敏感[3~5], 是导致厌氧氨氧化工艺系统启动时间长的主要原因[6], 也被认为是厌氧氨氧化工艺实际工程化应用的主要限制因素[7].厌氧氨氧化系统启动过程, 功能菌群不断富集, 而整个微生物群落则在特定基质环境条件下发生演替.因此, 全面分析厌氧氨氧化工艺系统启动过程微生物群落特征, 进而解析其微生物生态学作用机制, 将有助于调控微生物群落进而缩短工艺系统的启动时间.
高通量测序技术的普及, 使研究人员得以更全面地掌握和认识微生物群落特征.已有研究发现, 厌氧氨氧化系统微生物群落极其复杂, 主要菌门包括变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)和浮霉菌门(Planctomycetes)等[8~10].随着厌氧氨氧化系统的启动, AnAOB逐渐富集, 变形菌门丰度逐步降低, 而浮霉菌门丰度明显提升[11, 12].现有的研究结果为人们认识厌氧氨氧化系统微生物群落及其与脱氮性能的关系提供了基础数据.然而, 当前研究多集中于工艺系统脱氮效率与厌氧氨氧化菌及群落组成关系, 对厌氧氨氧化系统中其他微生物群落及其功能的关注较少, 如其他协同脱氮功能菌、起支撑或保护作用的菌群等.
当前, 得益于分子生物学及生物信息学的快速发展, 人们对厌氧氨氧化系统微生物群落组成及结构有了一定的认识, 但关于微生物群落功能信息的研究仍不足.基于16S rRNA基因高通量测序数据, 利用PICRUSt软件预测细菌的代谢功能, 与宏基因组相比, 成本较低并且具有较高的精确度[13], 为解析微生物功能提供了新途径.然而, PICRUSt软件依赖于Greengene数据库进行物种比对和功能数据输出, 但是Greengene数据库在2013年之后就停止了更新, 这限制了PICRUSt的功能预测范围. PICRUSt2作为PICRUSt的全新升级, 在各方面进行了优化及改进, 精度也得到进一步提升[14]. PICRUSt已广泛地应用于水体微生物和生物反应器的微生物功能预测, 并取得了较好的效果[15~17].然而, 利用PICRUSt对厌氧氨氧化启动过程微生物群落进行功能预测研究, 尚未见报道.
综上, 当前关于厌氧氨氧化系统启动过程微生物群落多样性及功能的研究相对缺乏, 导致厌氧氨氧化工艺系统微生物生态学机制研究仍存在不足.本文基于高通量测序数据, 分析厌氧氨氧化启动过程微生物群落结构及多样性变化特征, 同时, 结合PICRUSt2对细菌功能进行预测, 探讨微生物群落多样性及功能, 从微生物生态学视角深入理解厌氧氨氧化启动过程, 以期为厌氧氨氧化工艺快速启动提供基础数据.
1 材料与方法 1.1 实验用水及反应器本实验用水为人工配制合成的模拟废水, 其中NH4+-N和NO2--N分别由NH4Cl和NaNO2按需提供, 其他组分包括：NaHCO3 500 mg·L-1、KH2PO4 25 mg·L-1、MgSO4·7H2O 300 mg·L-1、CaCl2 120 mg·L-1以及微量元素浓缩液Ⅰ、Ⅱ各1 mL·L-1, 微量元素Ⅰ组分(g·L-1)：EDTA 5、FeSO4 5; 微量元素Ⅱ组分(g·L-1)：EDTA 15、ZnSO4·7H2O 0.43、CoCl2·6H2O 0.24、MnCl2·4H2O 0.99、CuSO4·5H2O 0.25、NaMoO4·2H2O 0.22、NiCl2·6H2O 0.19、NaSeO4·10H2O 0.21和H3BO4 0.014.
UASB反应器如图 1所示, 由有机玻璃制成, 柱体内径为10 cm, 外径为15 cm, 反应区高度为80 cm, 有效容积6.3 L, 反应器配有水浴夹套保持反应器温度恒定, 底部设有放空管, 上部设置三相分离器, 设有5个等间隔的取样口, 外部整体包裹铝箔避光.反应器进水由蠕动泵从底部进水口泵入, 反应生成的气体经三相分离器排出, 污泥经三相分离器回到反应区, 出水经出水口溢流流出, 控制反应器温度为(32±1)℃, 控制进水pH为7~8.
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图 1 反应器示意 Fig. 1 Schematic of reactor |
反应器接种污泥为南昌市某污水处理厂A2O工艺好氧池的污泥和实验室稳定运行的SBR反应器厌氧氨氧化污泥, 以体积比2∶1混合接种, 接种污泥量约为3 L, 混合液悬浮固体浓度(MLSS)和混合液挥发性悬浮固体浓度(MLVSS)分别为18.03 g·L-1和10.18 g·L-1, MLVSS/MLSS为56.46%.
启动过程, 取反应器启动时的种泥, 反应器运行第30、60和90 d时反应器内混合均匀的污泥样品, 进行3次重复采样, 共采集12个样品, 污泥样品编号分别记为d0、d30、d60和d90.采集的污泥样品经离心后, 于-80℃冰箱保存待用.取样期间反应器的运行工况及脱氮性能如表 1所示.
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表 1 取样期间反应器的运行工况及脱氮性能 Table 1 Operating conditions and treatment efficiency of the reactor during sampling |
1.3 DNA提取及高通量测序
利用FastDNAⓇ SPIN Kit for soil(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, U.S)DNA提取试剂盒, 根据操作说明进行污泥总DNA提取; 采用琼脂糖凝胶电泳对提取得到的样品总DNA进行定性检测, 同时, 利用SMA4000超微量分光光度计(Merinton, USA)对其浓度、纯度测定后, 将提取的总DNA置于-80℃冰箱中保存待用.
采用通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCC GCGGTAA- 3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWT CTAAT- 3′)对16S rRNA基因V4区进行PCR扩增. PCR反应体系为：10×Ex Taq buffer 4 μL, dNTPs 2 μL, BSA 0.2 μL, 2.5 U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶0.25 μL, 引物各1 μL, DNA模板1 μL, 灭菌超纯水补足体系至25 μL; PCR反应条件为：预变性温度94℃(2 min); 变性温度94℃(30 s), 退火温度53℃(30 s), 延伸温度72℃(45 s), 25次循环后72℃终止延伸10 min. PCR扩增产物经检测、纯化及定量分析后, 构建MiSeq文库, 利用MiSeq PE300测序平台(Illumina Inc, San Diego, CA, USA)进行高通量测序.本研究测序工作由测序公司完成.
1.4 数据处理与统计分析高通量数据经初步质控后, 采用QIIME 2 2020.2[18]完成生物信息学分析.使用q2-demux插件对原始序列数据进行拆分并进行质量过滤, 然后使用DADA2[19]进行去噪; 用mafft[20](q2-alignment)对所有扩增序列变体(ASV)进行比对, 并用fasttree2[21](q2-phylogeny)构建系统发育树; 将样品序列抽平后使用q2-diversity计算α多样性指数[香农(Shannon)多样性指数、Observed OTUs(Sobs)、Faith's系统发育多样性(PD)、辛普森(Simpson)多样性指数和Chao1指数]和β多样性指数(Bray-Curtis dissimilarity); 使用q2-feature-classifier[22]比对Greengenes 13_8 99% OTU参考序列对ASV进行分类.
QIIME 2导出特征表为biom格式文件, 利用PICRUSt2软件进行16S rRNA基因数据功能预测, 参考KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库, 得到KO(KEGG Orthology)功能的丰度预测表及KEGG代谢途径(KEGG pathway)丰度表.
对不同分组间差异检验采用单因素方差分析; 采用基于Bray-Curtis距离的非度量多维尺度(nonmetric multidimensional scaling, NMDS)分析, 比较不同分组样品间群落β多样性差异, 并用相似性分析(ANOSIM)进行差异检验; 统计分析及作图均基于R(3.5.1)不同程序包实现.
2 结果与分析 2.1 细菌群落特征分析 2.1.1 细菌群落组成高通量测序结果显示, 全部样品共获得701 550条高质量序列, 每个样品40 825~65 939条, 平均58 462条.全部样品共检测到48个门、111个纲、269个目、457个科、840个属和1 497个种.其中, 变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、装甲菌门(Armatimonadetes)、放线菌门(Actinobacteria)、广古菌门(Euryarchaeota)和酸杆菌门(Acidobacteria)占全部序列总和的87.54%~94.53%, 为门水平上的优势菌群[图 2(a)].反应器启动运行过程, 不同运行时间拟杆菌门、绿湾菌门、浮霉菌门、装甲菌门、放线菌门、厚壁菌门(Firmicutes)、匿杆菌门(latescibacteria)、互养菌门(Synergistetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)相对丰度呈现出显著差异(P < 0.05), 其中浮霉菌门相对丰度显著升高(P < 0.05).属水平上norank_f_PHOS-HE36、Denitratisoma、norank_ f_Anaerolineaceae、Candidatus_Brocadia、unclassified_o_Fimbriimonadales、Limnobacter、norank_ f_norank_o_SBR1031、Ignavibacterium、norank_ f_Desulfarculaceae和Blvii28_wastewater-sludg_group为丰度排名前10的属[图 2(b)], 其中Ignavibacterium、norank_f_Desulfarculaceae和norank_ f_PHOS-HE36相对丰度在d30和d60显著高于d0和d90(P < 0.05); Candidatus_Brocadia相对丰度随着启动运行时间呈显著升高的趋势(P < 0.05), 并在运行d90达到8.08%; Candidatus_Kuenenia相对丰度在d60显著高于其它时间; Blvii28_wastewater-sludge_group相对丰度在d0较高, 但随着启动运行时间增加显著降低(P < 0.05).
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图 2 启动过程细菌群落相对丰度 Fig. 2 Relative abundance of the bacterial community during the start-up of ANAMMOX |
选择Sobs、Shannon、Simpson、Chao1和PD指数, 对厌氧氨氧化启动过程细菌群落多样性进行评估.由表 2可知, 启动运行过程细菌群落多样性呈现出先下降后略有升高的趋势, 且多样性指数均为d0显著(P < 0.05)高于d30和d60, 而d30、d60和d90间无显著差异(P>0.05).值得注意的是, 虽然多样性指数在d0和d90间无显著差异, 但是d0均大于d90.
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表 2 厌氧氨氧化启动过程细菌群落多样性指数1) Table 2 Diversity indices of bacterial community during the start-up of ANAMMOX |
2.1.3 细菌群落结构
利用基于Bray-Curtis距离的非度量多维尺度(nonmetric multidimensional scaling, NMDS)排序, 分析厌氧氨氧化启动过程中不同时间细菌群落差异.如图 3所示, 压力值(stress)为0.061小于0.1, 表明NMDS分析结果具有很好地解释意义; 同一分组样品聚集在一起, 且不同分组样本在空间上呈现出显著的分异特征, 说明启动过程中不同时间的微生物群落组间差异远大于组内差异.而微生物群落相似性分析(ANOSIM)结果也表明, 启动过程不同时间微生物群落之间存在显著差异(R=0.846, P=0.001), 微生物群落结构在厌氧氨氧化启动过程发生显著变化.
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图 3 启动过程细菌群落NMDS排序 Fig. 3 NMDS ordination diagram of the bacterial community during the start-up of ANAMMOX |
基于PICRUSt2软件, 进行菌群功能分析, 得到不同样品细菌的功能预测信息.利用KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库对测序数据进行比对, 所有样品共涉及6类生物代谢通路：有机系统(organismal systems)、代谢(metabolism)、人类疾病(human diseases)、遗传信息处理(genetic information processing)、环境信息处理(environmental information processing)和细胞过程(cellular processes), 见图 4.其中, 有机系统和代谢是主要功能, 丰度分别为78.41%~80.66%和19.17%~21.20%.对启动过程不同时间细菌群落功能预测分析发现, 6个一级功能层预测基因丰度在不同时间均无显著差异(P>0.05).进一步对预测基因二级功能层分析, 共发现碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、转录(transcription)、膜转运(membrane transport)、信号传导(signal transduction)、氨基酸代谢(amino acid metabolism)、细胞生长和死亡(cell growth and death)和能量代谢(energy metabolism)等46个子功能(图 4).由图 4可知, 启动过程不同时间, 二级功能层子功能基因丰度发生变化, 氨基酸代谢(amino acid metabolism)、消化系统(digestive system)、信号分子及交互作用(signaling molecules and interaction)、外源物质的降解与代谢(xenobiotics biodegradation and metabolism)、免疫系统疾病(immune diseases)、运输和代谢(transport and catabolism)等16个功能基因在接种污泥中明显高于其它时期.而能量代谢(energy metabolism)、信号转导(signal transduction)、细胞生长和死亡(cell growth and death)、维他命及辅助因子代谢(metabolism of cofactors and vitamins)和循环系统(circulatory system)等15个功能基因在启动后期相对高于其它时期.
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L1~L6表示一级功能层：L1表示代谢, L2表示遗传信息处理, L3表示环境信息处理, L4表示细胞过程, L5表示人类疾病, L6表示有机系统; d0-1、d0-2和d0-3表示d0的3个重复, 以此类推, 下同 图 4 不同样品PICRUSt2功能预测热图(二级功能层) Fig. 4 Heatmap of PICRUSt2-based predicted function for different samples (hierarchy level 2) |
将PICRUSt2预测的KO结果与KEGG数据库中与氮代谢相关的65个直系同源基因(KEGG orthology)比对, 获得厌氧氨氧化启动过程中样品预测的具有氮代谢功能的相关基因(图 5).预测的KO中包含49个参与氮代谢的相关基因, 展现出丰富的氮代谢功能多样性.其中, 11个KO在d0中明显高于其它时期, 14个KO在d0和d90中相对高于d30和d60, 13个KO在d60和d90较高.进一步分析氮素转化过程的主要功能基因, 其中研究硝化过程常用氨单加氧酶的编码基因pmoA-amoA、pmoB-amoB和pmoC-amoC, 羟胺氧化还原酶的编码基因hao, 亚硝酸盐氧化还原酶的编码基因norA和norB作为主要的功能基因; 厌氧氨氧化过程涉及的主要功能基因包括联氨氧化还原酶基因hzo, 厌氧氨氧化细菌特有的亚硝酸还原酶基因nirS, 联胺合成酶基因hzsA和hzsB; 研究反硝化过程主要涉及的功能基因包括硝酸还原酶的编码基因narG, 亚硝酸还原酶的编码基因nirS和nirK, 一氧化氮还原酶的编码基因norB, 以及氧化亚氮还原酶的编码基因nosZ.同时, 氮素代谢还涉及硝酸盐同化还原酶的编码基因nasA、narB和异化还原酶的编码基因napA、亚硝酸盐同化还原酶的编码基因nirA、nirB和异化还原酶的编码基因nrfA.厌氧氨氧化启动过程, 硝化过程的pmoA-amoA、pmoB-amoB和pmoC-amoC丰度呈增加趋势, 而hao丰度呈现出先增加后降低的趋势; 厌氧氨氧化过程的nirS丰度整体呈现先降低后增加的趋势; 反硝化过程的narG、nirK和norB丰度都展现出先下降后升高的情况, 而nirS和nosZ丰度都展现出先下降后升高又下降的情况.厌氧氨氧化启动过程, 硝酸盐同化还原的nasA及异化还原的napA丰度呈先降低后升高的变化趋势; 硝酸盐同化还原的narB和亚硝酸盐同化还原的nirB丰度都呈现出先下降后升高又下降的变化趋势; 亚硝酸盐异化还原的nrfA呈下降趋势.
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图 5 氮代谢相关KO基因拷贝数热图 Fig. 5 Heatmap of nitrogen metabolism-related KO based on predicted gene copy |
本研究基于高通量测序技术分析了厌氧氨氧化启动过程中细菌群落组成、多样性及结构, 门水平上共检测到48个门, 其中变形菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、浮霉菌门、装甲菌门、放线菌门、广古菌门和酸杆菌门为优势菌群(图 2), 这与已有研究的结果一致[8, 12, 23~26].变形菌门作为厌氧生物反应器内的常见菌门[27], 甚至在厌氧氨氧化系统内其相对丰度往往大于浮霉菌门[28], 有研究认为变形菌门能起到调节微生物群落的作用[29].本研究结果显示, 变形菌门在厌氧氨氧化启动过程不同时间内都占比较高(21.09%~29.68%), 且相对丰度无显著变化(P>0.05), 说明变形菌门中具备氮素转化功能的氨氧化细菌、亚硝酸盐氧化菌和反硝化菌等[30], 在厌氧氨氧化系统脱氮上发挥重要作用, 这也是反应器启动初期总氮去除率达到41.32%的主要原因.反应器启动运行过程中, 随反应器脱氮性能的逐步提高, 拟杆菌门、绿弯菌门、浮霉菌门和装甲菌门相对丰度呈现显著差异(P < 0.05).厌氧氨氧化菌所属的浮霉菌门相对丰度显著升高(P < 0.05), 使反应器取得较好的脱氮效果.绿弯菌门作为厌氧氨氧化系统内的主要伴生菌[31], 一方面, 支撑着整个污泥体系, 同时被认为是厌氧氨氧化颗粒形成过程的重要载体[32]; 另一方面, 其会参与到有机物的降解过程, 在厌氧氨氧化反应器内去除衰亡的菌体及胞外聚合物[33].有研究发现, 拟杆菌门也参与降解有机物、反硝化和固氮等过程, 并且在促进颗粒污泥形态稳定方面发挥作用[34].基于宏基因组分析发现, 厌氧氨氧化系统内的装甲菌门可以贡献次生代谢产物钼辅因子和叶酸, 有益于厌氧氨氧化菌活性并促进其生长[35].属水平上, 本研究中检测到厌氧氨氧化菌属为Candidatus_Brocadia和Candidatus_Kuenenia, 它们被认为是实验室反应器中的主要厌氧氨氧化菌[8, 36~38].Candidatus_Brocadia相对丰度随着启动运行时间呈显著升高的趋势(P < 0.05), 并在运行d90达到8.08%; 而Candidatus_Kuenenia相对丰度则在d60显著高于其它时间, 这可能是由于二者对基质不同的适应力所致[39].启动过程, 氨氮浓度由47.13 mg·L-1逐步提高到115.56 mg·L-1, 亚硝氮浓度由49.37 mg·L-1逐步提高到149.72 mg·L-1, Candidatus_Brocadia对基质亲和力弱但繁殖力强, 而Candidatus_Kuenenia则能利用低浓度亚硝态氮而且对亚硝态氮的抑制更耐受[40, 41].norank_f_norank_o_SBR1031和norank_f_Anaerolineaceae菌属是厌氧消化的核心微生物种群[42], Anaerolineaceae在反应器内发挥微生物残体降解的作用[43]; Denitratisoma和Ignavibacterium具有反硝化功能[34, 44]; Limnobacter具有缓解外界环境对厌氧氨氧化菌影响的作用[32].厌氧氨氧化系统启动过程中, 反应器内存在大量的伴生菌群, 它们在系统启动过程中发挥了重要作用, 一方面为厌氧氨氧化菌创造了适宜环境促进其生长繁殖, 另一方面有助于提升系统脱氮效果.
基于Sobs、Shannon、Simpson、Chao1和PD指数对厌氧氨氧化启动过程中细菌群落多样性进行了研究, 其中Sobs和Chao1指数经常被用来评估物种丰富度; Shannon和Simpson指数用来反映微生物群落多样性; PD指数是谱系多样性常用于微生物群落研究, 其同时考虑了物种丰度及进化距离.结果表明, 厌氧氨氧化系统启动过程, 细菌群落多样性下降.这与已有的研究结果一致[8, 45], 可能是启动过程基质浓度和脱氮负荷不断提高, 接种污泥中所携带的某些微生物类群无法适应反应器内的环境被淘汰.有研究发现, 随着厌氧氨氧化反应器稳定运行, 微生物群落多样性增加[8, 26].然而, 本课题组前期研究发现, 一体式厌氧氨氧化系统脱氮效果恶化及恢复过程中, 微生物群落多样性指数先增大后减小[46]; Chu等[47]的研究显示, 一体式亚硝化厌氧氨氧化系统启动过程中微生物群落多样性下降.可见厌氧氨氧化系统启动及运行过程中微生物群落多样性发生变化, 但不同研究得到的结果不一致. NMDS分析结果表明, 厌氧氨氧化系统启动过程中, 微生物群落存在明显的空间分异特征.说明厌氧氨氧化启动过程中, 微生物群落结构发生了显著变化.这与前文微生物群落组成结果相互印证, 随着厌氧氨氧化系统启动完成进入稳定运行阶段, 微生物群落结构会趋于稳定[8, 47].当前, 已有的关于厌氧氨氧化系统微生物群落的研究, 结果不尽相同.结合已有研究结果和本研究结果认为, 启动过程多样性发生显著变化, 且随着系统进入稳定运行阶段, 微生物群落结构趋于稳定; 亦或者由于微生物群落多样性及群落结构逐步适应反应器内部环境趋于稳定, 进而使得系统脱氮效率进入稳定运行阶段.因此, 后续应开展长期实验, 探究系统内细菌群落多样性与系统稳定状况及脱氮性能间的关系.
3.2 厌氧氨氧化启动过程细菌群落功能预测分析利用PICRUSt2对厌氧氨氧化系统启动过程细菌群落功能进行预测, 结果显示, 启动过程不同时间细菌群落共涉及有机系统和代谢等6类生物代谢通路, 碳水化合物代谢、转录、膜转运、信号传导、氨基酸代谢、细胞生长与死亡和能量代谢等46个子功能, 展现出丰富的功能多样性.厌氧氨氧化启动过程不同时间, 一级功能层基因丰度无显著差异, 且主要功能基因均为有机系统及代谢相关功能, 说明有机系统和代谢在厌氧氨氧化启动过程起着极其重要的作用.此外, 厌氧氨氧化启动过程不同时间, 二级功能层的功能基因丰度存在差异.已有研究表明, 厌氧氨氧化启动过程, 系统容积负荷不断升高, 系统内微生物群落组成、结构及多样性发生变化[12, 36, 45], 这可能进一步导致细菌群落功能组成产生差异.在接种污泥中, 氨基酸代谢、外源物质的降解与代谢、信号分子及交互作用和消化系统等功能基因丰度较高, 其中, 氨基酸代谢主要作用是将蛋白质分解转化为铵态氮, 城市污水处理系统中有多达20多种氨基酸代谢途径[48], 说明在有机氮存在的情况下氨基酸代谢较为活跃; 启动后期, 能量代谢、信号转导、细胞生长和死亡等功能基因丰度升高, 其中, 能量代谢主要涉及氮代谢, 这也解释了厌氧氨氧化系统启动过程氮去除率逐渐升高的现象.本研究中, 厌氧氨氧化启动过程主要为人工配水, 提供无机氮源和碳源, 且整个过程主要是厌氧氨氧化菌及其相关功能菌的富集过程, 其它菌群被淘汰或者活性处于较低水平, 这可能是上述功能基因丰度变化的原因之一.
进一步研究厌氧氨氧化启动过程细菌参与氮素代谢的相关功能基因, 共49个KO注释为氮代谢, 这涵盖了绝大多数的氮代谢通路.本研究中, 厌氧氨氧化启动种泥中含有AnAOB, 而启动过程中其它菌群的竞争导致AnAOB活性开始降低, 随着启动过程AnAOB大量富集且活性提高[11, 12, 26], 因此相关功能基因nirS丰度呈现先降低后升高.启动初期, 种泥带入的有机物为反硝化菌提供了营养, 而随着启动过程深入, 可供利用的有机物减少, 后期有机物主要来自系统内菌体死亡分解[33].因此, 反硝化菌群也发生分化, 部分菌群存活, 如厌氧氨氧化系统中常见的反硝化菌Denitratisoma和Ignavibacterium, 故反硝化相关的功能基因丰度整体先降低后升高.已有研究认为, 硝酸盐可能是异化硝酸盐还原酶活性的限制因子, 同时对异化硝酸盐还原酶合成具有诱导作用[49].厌氧氨氧化启动成功的重要标志是生成一定比例的NO3--N[50], 这可能是硝酸盐同化还原和异化还原相关基因丰度变化的重要原因.研究氮素代谢功能基因有助于深入理解厌氧氨氧化启动过程微生物群落结构、功能与脱氮效率的关系, 本研究基于PICRUSt2初步解析了微生物群落功能及氮代谢相关基因, 考虑到PICRUSt2的局限性, 后续应结合宏基因组测序技术深入研究厌氧氨氧化启动及稳定运行过程中微生物群落功能.
4 结论(1) 基于高通量测序技术分析了厌氧氨氧化启动过程细菌群落组成, 共检测到48个门840个属; 启动过程, 门水平上拟杆菌门、绿湾菌门、浮霉菌门、装甲菌门、放线菌门、厚壁菌门、匿杆菌门、互养菌门和疣微菌门相对丰度呈现出显著差异(P < 0.05), 属水平相对丰度排名前10的属中lgnavibacterium、norank_ f_Desulfarculaceae、norank_ f_PHOS-HE36、Candidatus_Brocadia、Candidatus_Kuenenia和Blvii28_wastewater-sludge_group相对丰度存在显著差异(P < 0.05).
(2) 厌氧氨氧化启动过程不同时间, 细菌群落多样性指数存在显著差异(P < 0.05); 微生物群落结构在厌氧氨氧化启动过程呈现空间分异特征, 且存在显著差异(ANOSIM：R=0.846, P=0.001).
(3) 厌氧氨氧化启动过程, 细菌群落功能较为丰富, 且不同时间阶段细菌群落一级功能层在有机系统和代谢方面较为活跃; 二级功能层子功能基因丰度在厌氧氨氧化启动过程发生明显变化.
(4) 厌氧氨氧化启动过程, 细菌群落含有49个参与氮素代谢的相关功能基因, 且不同时间阶段参与硝化、反硝化、厌氧氨氧化、硝酸盐同化/异化还原和亚硝酸盐同化/异化还原过程的相关功能基因丰度发生明显变化.
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