2021, Vol. 42
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
塑料具有良好的可塑性和耐用性, 并且价格低廉, 因此塑料制品在工农业、商业和日常生活中的得到了广泛使用[1, 2].基于人口密度和经济社会发展的数学模型显示, 世界上192个沿海国家早在2010年就形成了2.75亿t的塑料垃圾, 其中大约1.75%~4.62%的塑料垃圾最终进入了海洋[3].微塑料是一类直径小于5 mm塑料纤维、塑料颗粒或塑料薄膜, 被科学家认为是一种污染物[4, 5].微塑料主要分为原生微塑料(来源于脸部洁面产品和化妆品等)和次生微塑料(来源于尺寸较大塑料的碎化和降解等)[4].有研究显示, 大西洋表层200 m海水存在主要以聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯这3类为主的大量微塑料, 直径尺寸介于32~651 μm, 这些微塑料重量约为1.16~2.11千万t[6].海洋塑料污染和危害造成的海洋生态经济损失每年高达130亿美元[7].在我国, 黄海海域沉积物和海洋生物体的微塑料污染水平较高[8], 南海西沙海域表层海水微塑料主要来源于海洋渔业活动和陆地人类活动释放的塑料垃圾[7], 由于塑料具有相对稳定的化学性质, 这些(微)塑料可能在海洋环境存续数百年[9], 海洋环境的微塑料污染态势非常严峻.
抗生素抗性是指微生物(包括病原微生物)对原本敏感的抗生素产生了高度耐受的特性, 抗生素抗性使得抗生素对细菌感染引发的相关疾病疗效降低, 给人类卫生健康造成了挑战.环境中的塑料与抗生素耐药菌关系密切, 有关研究表明, 海洋里的塑料垃圾等是抗生素耐药菌(antibiotic-resistant bacteria, ARB)和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)存储库和扩散媒介[10, 11].微塑料粒径小, 比表面积大, 能被不同营养级的生物摄入体内, 微塑料及其负载的污染物(重金属和有机污染物等)能在生物体中累积、迁移和传递, 影响生态安全、动物生长繁殖和人类健康[12, 13].水环境中的塑料还能够被微生物等定殖并形成塑料际生物膜[14], 这其中包括有害的条件病原菌[15].目前关于海洋微塑料和抗生素抗性基因复合污染的研究还比较少, 对于不同种类的微塑料对海水抗生素抗性基因的影响特征和驱动因素还缺乏深入认识.因此本研究选择聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)和具有水溶性的聚乙烯醇(PVA)这3种具有乙烯基的不同微塑料, 利用高通量定量PCR(high through-put quantitative PCR, HT-qPCR)技术对海水抗生素抗性基因的多样性和丰度水平变化进行了分析, 探究微塑料对海水抗性基因影响和变化特征, 阐释海洋微塑料和抗性基因复合污染机制, 以期为海洋生态环境质量评估、微塑料污染治理和相关环境政策制定提供科学理论支撑, 具有理论和现实的意义.
1 材料与方法 1.1 海水采集与微塑料添加培养实验本研究中选用的3种微塑料都是具有乙烯基的高聚化合物, 分别为聚乙烯(polyethylene, PE)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)和聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA), 它们的粒径峰值为160~180 μm, 供应商为阿拉丁(Aladdin Industrial Corp, China), 形态如图 1所示(扫描电镜型号为HITACHI S4800, JAPAN).聚乙烯(PE)为乳白色颗粒或粉末, 化学性质稳定, 吸水性小; 聚氯乙烯(PVC)为白色粉末状, 无固定形态结构, 光和热的稳定性较差; 聚乙烯醇(PVA)是一种有机化合物, 是白色片状、絮状或粉末状固体, 能溶于水.
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图 1 选用的3种微塑料扫描电镜 Fig. 1 Characteristics of microplastics, determined by scanning electron microscopy |
采集的海水位于厦门市五缘湾入海口(118.176 3°E, 24.538 7°N), 所在区域海水无异色、异臭和异味.海水的总氮(TN)0.48 mg·L-1, 总有机碳(TOC)为9.52 mg·L-1, 固体悬浮物(suspended solid, SS)为16.3 mg·L-1.采集的海水装在5 L的棕色玻璃瓶中(装满), 共采集了15份平行海水样品(3份海水作为原样, 3份用作空白曝气培养, 9份水样用于分别添加3种微塑料并曝气培养实验).根据《海水水质标准》(GB 3097- 1997)第一类和第二类海水关于悬浮物质人为增加的量不大于10 mg·L-1的规定, 本研究的海水培养体系, 人为添加的微塑料取其上限值为10 mg·L-1.采集的海水分别转移至透明玻璃瓶中, 培养体积全部调整为4 L, 进行1 h曝气- 1 h静置的连续循环曝气方式, 曝气速率为1.5 L·min-1, 总培养时间为49 d(7个星期).
1.2 海水总DNA提取与16S rRNA基因定量PCR海水原水和培养后的海水, 采用负压抽滤的方式(混合纤维素微孔滤膜的尺寸为50 mm, 孔径为0.22 μm), 获得海水中含有微生物的固体悬浮物(包括添加的微塑料).海水样品抽滤结束后, 略微晾干滤膜, 避光冷冻保存.提取海水微生物总DNA之前, 将所得的滤膜适当剪碎(建议形态大小约为1 mm×1 mm, 不宜过大), 选用FastDNA Spin Kit快速提取试剂盒(MP Biomedicals, USA), 根据试剂盒说明书的方法步骤最终每个样品获得100 μL的DNA溶液.然后用Qubit 3(Thermo Fisher Scientific, USA)测定DNA样品的纯度和浓度.将实验样品的部分海水DNA原液, 根据测得的浓度稀释成浓度为50 ng·μL-1, 体积45 μL的高通量qPCR上机实验样品.
将16S rRNA基因标准质粒(此次制备的标准质粒浓度是1.52×1010 copies·L-1)10倍梯度稀释后作为标准工作曲线, 采用Roche 480ⅡPCR仪对DNA样品的16S rRNA基因进行荧光定量qPCR实验(Roche Diagnostics Limited, Switzerland).本实验的qPCR反应体系是20 μL.具体组分为：SYBR® Green Master Mix(10 μL), PCR级超纯水(7 μL), DNA样品模板(1 μL), 16S rRNA基因正反向引物(各1 μL, 正反向引物浓度均为10 μmol·L-1).qPCR设定了40个cycles, 具体的热循环条件参照Wang等[16]的研究.DNA实验样品均进行了3次PCR技术平行, 并进行PCR阴性比照实验.
1.3 高通量定量PCR(HT-qPCR)高通量定量PCR是本研究所采用的主要实验技术.本实验所依托的高通量定量PCR反应平台为SmartChip PCR Systems(TaKaRa Bio Inc, USA), 296对基因引物及基因分类参考Zhu等[17, 18]的相关研究, 其中有285种抗生素耐药基因, 10种可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)和1种细菌16S rRNA基因.选定的这些抗生素耐药基因与可移动遗传元件囊括的种类比较全面, 具备抗生素耐药基因谱集的特点, 代表性较好.SmartChip的PCR通量是5 184个, 单个PCR的体积仅为100 nL, 体系中各试剂的终浓度为：1倍稀释的SYBR® Green ⅠMaster Mix预混试剂(Roche Applied Sciences, USA), 5 ng·μL-1的样品DNA模板, 0.5 μmol·L-1的各基因的正反向引物.高通量定量PCR反应循环条件设定为：时长10 min, 温度95℃的热启动(PCR聚合酶的特性)过程; 时长30 s, 温度95℃的DNA变性解链过程, 时长30 s, 温度60℃的DNA退火延伸过程, 以上两步进行40个cycle.最后, 扩增效率介于1.75~2.25的作为本实验有效扩增数据.
1.4 数据处理与统计分析在对海水原水和培养后的海水进行16S rRNA基因常规定量PCR的基础上, 根据抗生素抗性基因丰度的研究和计算方法[2, 19], 可获得抗性基因和可移动遗传元件的绝对丰度, 然后进行基于丰度的后续各种分析.
高通量定量PCR的原始数据和其它数据采用Excel 2016进行整理计算, 直方图是用OriginPro 9.0软件进行绘制, 采用R 3.3.3软件进行pheatmap热图和聚类分析以及普通最小二乘法分析(ordinary least squares analysis, OLS), 文中相关性和显著性分析用SPSS Statistics 22软件.
2 结果与讨论 2.1 不同微塑料处理的海水ARGs类型与多样性在海水原水和微塑料培养的海水中总共检测到了103种抗生素抗性基因(ARGs).根据抗生素对应的类型, 这些海水中的抗生素抗性基因可以概括为图 2所示的8大类型.此外, 本研究中也检测到有10种可移动遗传元件(MGEs).
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图 2 海水抗生素抗性基因和可移动遗传元件种类数 Fig. 2 Number of ARGs and MGEs detected in seawater |
海水原水(ORI)检测到了74种抗性基因和10种可移动遗传元件.按照1 h曝气- 1h静置的连续循环曝气培养49 d后, 4种不同处理的海水抗性基因和可移动遗传元件的种类数都显著下降, 空白对照海水(BLK)、添加聚乙烯海水(PE)、添加聚氯乙烯海水(PVC)和添加聚乙烯醇海水(PVA)样品检测到的抗性基因种类数分别为20、35、42和64种, 而可移动遗传元件(MGEs)的种类数分别为2、4、2和3种.相关的研究表明, 曝气能直接搅拌混匀水体和增加溶解氧, 进而减少水中的化学需氧量(COD)和铵离子(NH4+-N)的浓度水平, 可能导致微生物多样性的减少[20].周昕原等[2]的研究也显示, 河水在实验室曝气培养后, 水中有机物等碳源和营养元素加快消耗, 抗生素抗性基因种类有所下降.本研究显示, 曝气培养会使得水中抗性基因种类减少, 但相对于空白对照的海水(BLK), 在添加微塑料(PE、PVC或PVA)的海水抗性基因种类显著增加.此外, 微塑料PE和PVC不溶于水, 具有较强的疏水性的特点, 微生物在疏水塑料表面定殖需要较长时间才能形成稳定群落[1, 21], 而聚乙烯醇(PVA)常温下具有较好的吸水性, 能够被特定的微生物所利用[22], 促进了微生物的生长和繁殖.本研究证明微塑料改变了海水抗生素抗性基因的多样性和组成谱, 海水抗生素抗性基因种类显著增加, 微塑料对海水抗生素抗性基因污染的影响需引起更多重视.
2.2 不同微塑料处理的海水ARGs丰度分析海水原水和不同微塑料处理培养的海水抗性基因的丰度有着显著的不同(图 3), 海水原水(ORI)、空白对照海水(BLK)、添加聚乙烯海水(PE)、添加聚氯乙烯海水(PVC)和添加聚乙烯醇海水(PVA)抗生素抗性基因的丰度分别为5.03×107、4.01×106、2.75×107、4.54×107和1.05×108 copies·L-1, 添加微塑料培养组的抗生素抗性基因丰度比空白对照组(BLK)显著增加(P < 0.05).特别是添加聚乙烯醇(PVA)微塑料的海水抗生素抗性基因丰度约是空白对照海水的26倍, 是海水原水的2倍. PVA具有较强吸水性和表面活性[22], 形成大量泡沫, 能够干扰海水微生物过程.有研究表明, 在多种细菌等微生物的作用下, 聚乙烯醇泡棉堆肥3 a后(唯一碳源), PVA1788最高可降解74.99%[23].因此PVA能够提供足够的碳源和能源, 维持海水微生物的丰度和多样性, 并进而增加抗生素抗性基因的丰度.
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图 3 海水抗生素抗性基因和可移动遗传元件的丰度 Fig. 3 Absolute abundance of ARGs and MGEs in seawater |
从可移动遗传元件(MGEs)的丰度分析(图 3), 海水原水(ORI)、空白对照海水(BLK)、添加聚乙烯海水(PE)、添加聚氯乙烯海水(PVC)和添加聚乙烯醇(PVA)海水MGEs的丰度分别是1.71×107、1.16×107、4.17×107、1.78×107和6.13×107 copies·L-1.此外, 空白对照海水(BLK)和添加聚乙烯海水(PE)可移动遗传元件丰度高于抗生素抗性基因.相关研究表明, 添加PVC和PVA微塑料使得入海河口沉积物中抗性基因丰度快速增加, 微塑料对河口-海洋环境抗生素抗性基因污染与传播有重要影响[13].相对于空白对照海水(BLK), 微塑料的存在使得海水抗性基因的丰度明显增高, 说明微塑料(包括来源于PVA等制成的可降解塑料制品)对抗性基因的影响和海洋生态风险值得进一步关注.
2.3 微塑料对海水ARGs的分布格局分析基于各类抗生素抗性基因、可移动遗传元件(MGEs)和总抗生素抗性基因(ARGs)的绝对丰度进行热图分析(图 4), 能够直观地表征微塑料对海水抗性基因分布格局的影响.图 4可以看出, 海水经过49 d的培养后, 各类基因聚类成了3大簇, A簇主要包含氟喹诺酮类/氯霉素胺酰醇类(FCA)、可移动遗传元件(MGEs)及总抗生素抗性基因(ARGs), 这一簇的各类基因丰度总体较高. B簇则包括磺胺类、大环内酯类/林肯酰胺类/链阳性菌素B类(MLSB)、β-内酰胺类和四环素类抗性基因; B1区域显示, 以上几类抗性基因在空白对照海水(BLK)和添加聚乙烯海水(PE)的丰度处于总体比较低的水平; B簇中, 不同类型的抗生素抗性基因丰度水平差异较大. C簇主要有氨基糖苷类、多重耐药类和万古霉素类抗性基因.
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图 4 海水抗生素抗性基因聚类分布热图 Fig. 4 Patterns of ARGs in seawater |
氟喹诺酮类/氯霉素胺酰醇类(FCA)与海水总抗性基因(ARGs)聚类在A簇, 微塑料使得氟喹诺酮类/氯霉素胺酰醇类(FCA)抗性基因丰度显著增加, 是海水抗生素抗性组最为活跃的组成部分, 对海水总体抗生素抗性基因的贡献最大(图 3和图 4).微塑料复杂的表面结构和较大的比表面积, 对于水中的污染物(特别是抗生素和重金属等)具有不同的吸附-解析能力[24, 25], 直接影响海水和塑料表面的微生物组成, 能够在塑料际(plastisphers)形成微生物膜[1, 14], 因此, 微塑料改变了抗生素抗性基因分布格局, 加速了抗生素抗性基因在海洋环境传播和扩散, 使得海洋生态环境态势变得更加严峻.
2.4 海水ARGs与MGEs和16S rRNA基因的关系相关研究表明, 抗生素抗性基因可以经过水平基因转移机制(horizontal gene transfer, HGT)在微生物中迁移扩散[26], 整合子等加快了抗生素抗性基因在环境中的传播[27, 28].整合子和转座子都是重要的可移动遗传元件, 如图 5所示, 统计了可移动遗传元件(6种转座子和4种整合子)与海水抗生素抗性基因的关系, 普通最小二乘法(OLS)回归分析表明, 在0.95置信度区间条件下, 可移动遗传元件的基因与抗生素抗性基因显著正相关, 暗示可移动遗传元件参与了海水抗生素抗性基因的增殖及转移过程, 加快了抗生素抗性基因在海水环境中的扩散传播.此外, OLS分析还证实, 微生物的丰度也与抗生素抗性基因显著正相关(图 5), 表明微生物对抗生素抗性基因的存续、传播和演变有直接的重要作用.
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图 5 可移动遗传元件和微生物丰度与海水抗生素抗性基因的回归分析 Fig. 5 OLS regression analysis between MGEs, 16S rDNA, and ARGs in seawater |
(1) 微塑料对海水抗生素抗性基因的种类组成产生了显著影响, 空白对照海水(BLK)、添加聚乙烯海水(PE)、添加聚氯乙烯海水(PVC)和添加聚乙烯醇海水(PVA)样品检测到的抗性基因种类数分别为20、35、42和64种, 微塑料使得海水抗生素抗性基因种类显著增加.
(2) 微塑料改变了海水微生物抗生素抗性基因的分布特征, 空白对照海水(BLK)、添加聚乙烯海水(PE)、添加聚氯乙烯海水(PVC)和添加聚乙烯醇海水(PVA)抗生素抗性基因的丰度分别为4.01×106、2.75×107、4.54×107和1.05×108 copies·L-1, 微塑料使得海水抗生素抗性基因丰度显著增高, 特别是可溶性微塑料(PVA)对海水抗生素抗性基因丰度影响最大.
(3) 海水抗生素抗性基因与16S rRNA基因和可移动遗传元件(MGEs)有显著正相关的关联, 说明微生物的丰度(16S rRNA基因)和水平基因转移机制(HGT)都能够影响海水抗生素抗性基因的存续和演变.
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