2021, Vol. 42
2. 青岛海洋科学与技术国家实验室, 海洋生态与环境科学功能实验室, 青岛 266237;
3. 中国海洋大学环境科学与工程学院, 青岛 266100;
4. 中国海洋大学海洋生命学院, 青岛 266003;
5. 青岛海水稻研究发展中心, 青岛 266041;
6. 九天智慧农业集团, 青岛 266003;
7. 山东理工大学资源与环境工程学院, 淄博 255049
, HE Hui4 , MI Tie-zhu1,2,3 , LIU Yue-teng1,3 , LIU Jia-yin5 , ZHANG Guo-dong6 , LI Ming-yue7 , ZHEN Yu1,2,3
2. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266237, China;
3. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China;
4. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China;
5. Qingdao Salt and Alkali Rice Research and Development Center, Qingdao 266041, China;
6. Jiutian Wisdom Agricultural Group, Qingdao 266003, China;
7. School of Resources and Environmental Engineering, Shandong University of Technology, Zibo 255049, China
甲烷是一种重要的温室气体, 由其导致的温室效应是二氧化碳的28倍[1], 对全球气候变化起着重要作用[2].除人类活动外, 产甲烷菌的代谢活动是大气中甲烷的重要自然来源[3].产甲烷菌在自然界中广泛存在, 研究者从嗜酸到嗜碱、嗜冷到嗜热、淡水环境到嗜盐环境中, 都分离出了产甲烷菌[4, 5].产甲烷菌属于广古菌门, 目前为止已发现其分属于7个目：甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)、甲烷胞菌目(Methanocellales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、马赛球菌目(Methanomassiliicoccales)、甲烷球菌目(Methanococcales)和甲烷火菌目(Methanopyrales)[4], 包括H2/CO2还原型、乙酸发酵型和甲基营养型这3种代谢类型[6].在稻田[7]、湿地[8, 9]、泥炭地[10]、冻土[11, 12]、煤层[13]以及地下水[14]等有机质被大量分解的环境中, 产甲烷菌主要通过H2/CO2还原途径和乙酸发酵途径生成甲烷, 而甲基营养型途径主要发生在海洋沉积物等特定环境中[14, 15].
产甲烷菌是一类厌氧微生物, 稻田淹水条件创造的厌氧环境为其提供了理想的生存场所[16].大气中约有1/5的甲烷来自稻田, 稻田作为甲烷的重要源库[17], 其中产甲烷菌的分布及代谢活动能够影响大气中甲烷含量.近年来, 关于水肥管理模式[18, 19]和环境因子[7, 20]等对稻田土壤产甲烷菌群落结构与多样性的研究已有一定基础.水稻作为盐碱地的改良作物之一, 研究者对其耐盐碱生理机制也展开了大量研究[21, 22].目前, 耐盐碱水稻的研究主要集中在水稻品种的选育及水稻对盐碱地的改良成效[23, 24]等方面, 而耐盐碱水稻土壤中产甲烷菌群落组成、环境影响因素以及甲烷代谢方式尚不明确.
本研究基于产甲烷菌的甲基辅酶M还原酶基因(mcrA), 采用实时荧光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR, qPCR)和Illumina高通量测序技术, 结合环境因子分析, 揭示种植耐盐碱水稻土壤中产甲烷菌的群落特征, 以期为了解产甲烷途径及其在土壤碳循环中发挥的作用提供依据.
1 材料与方法 1.1 样品采集及处理采样地点位于青岛市城阳区上马街道王林庄社区的稻作改良智慧农业产业示范基地, 该基地建于2018年, 此前为荒地, 土壤为易板结黏土, 为轻度滨海盐碱地.耐盐碱水稻试验田供试水稻品种为“YC1703”, 普通水稻试验田供试水稻品种为“临稻10号”, 本试验均为改造后首次种植, 试验田面积均为666.67 m2(约1亩); 对照土壤为试验田邻近未改造荒地.分别在水稻移栽前(4月)、分蘖期(6月)、拔节期(7月)、孕穗期(8月)以及成熟期(9月), 采用梅花取样法采集5~15 cm耕作层土壤, 去除植物根和石块等杂物.按四分法将土壤样品分为两份, 一份风干处理后, 用于土壤理化性质的分析, 另一份保存于-80℃冰箱用于微生物群落特征分析, 样品信息见表 1.
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表 1 土壤样品信息 Table 1 Information of soil samples |
1.2 环境因子测定
将土壤用蒸馏水浸提(水土比为2.5∶1)后, 用pH计测定土壤pH值, 重铬酸钾外加热法测定有机质, 质量法测定水溶性盐, NaOH熔融-钼锑抗比色法测定全磷, NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定有效磷, NH4OAc浸提-火焰光度法测定速效钾, 碱解扩散法测定碱解氮, 半微量开氏定氮法测定全氮, 电导率多参数测量仪测定电导率, 营养盐自动分析仪测定铵盐和硝酸盐(均采用1 mol·L-1 KCl溶液浸提).以上环境因子测定的具体方法参照文献[25].
1.3 微生物基因组DNA提取土壤样品自然解冻混匀后, 取0.25 g土壤, 用Powersoil® DNA Isolation Kit试剂盒(MOBIO, 美国)提取总DNA, 操作按照说明书进行.采用超微量紫外分光光度计(DeNovix DS-11, 美国)和琼脂糖凝胶电泳检测, 将质检合格的DNA置于-20℃冰箱保存.
1.4 产甲烷菌群落特征分析 1.4.1 产甲烷菌群落丰度分析用引物mlas/mcrA-rev[26]对土壤DNA进行PCR扩增, PCR反应体系为0.3 μmol·L-1正反向引物各1 μL, 去离子水7 μL, DNA模板1 μL, mix 10 μL, 扩增条件为: 98℃ 5 min, 98℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 45 s, 5个循环; 98℃ 30 s, 54.8℃ 30 s, 72℃ 45 s, 25个循环.采用2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物, 纯化目的片段.将目的片段连接到pMD 19-T载体上, 导入Trans5α感受态细胞, 构建基因克隆文库, 选取阳性克隆提取质粒.以梯度稀释的质粒标准品为模板, 进行qPCR反应.扩增条件为: 50℃ 2 min, 94℃ 10 min, 94℃ 15 s, 55℃ 2 min, 40个循环.每个样品进行3个平行试验, 每组反应添加阴性对照, 并添加熔解曲线检测扩增结果.以不同浓度质粒拷贝数的对数值为横坐标, 平均Ct值为纵坐标, 绘制标准曲线.产甲烷菌mcrA基因标准曲线的回归方程为y=-3.45x+42.34(r=-0.995).样品测定时qPCR反应条件与上述步骤相同, 每个样品设置3个平行试验, 同时添加阴性和阳性对照, 通过标准曲线计算土壤产甲烷菌mcrA基因拷贝数.
1.4.2 Illumina高通量测序以基因组DNA为模板, 使用带有测序标签barcode的引物mlas/mcrA-rev对产甲烷菌mcrA基因进行扩增.PCR产物电泳检测合格后, 将目的片段回收, 采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库, 文库质检合格后由上海派森诺生物科技有限公司使用Illumina MiSeq PE300平台进行测序.将本研究所得的mcrA基因序列上传至NCBI Sequence Read Archive(SRA)数据库, 登录号为PRJNA669231.
1.4.3 生物信息学分析下机序列删除barcode和引物序列后, 对双端序列作质量筛查, 利用FLASH(Fast Length Adjustment of Short reads, v1.2.7)软件根据重叠碱基对通过质量初筛的双端序列进行配对连接(重叠碱基长度不小于10 bp, 且不允许碱基错配).运用QIIME软件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology, v1.8.0)对序列进行过滤, 去除PCR扩增过程中产生的嵌合体序列、测序本身产生点突变等错误序列, 得到高质量序列, 用于后续生物信息学分析.通过UCLUST序列比对工具, 对高质量序列按89%的序列相似度进行归并和可操作分类单元(OTU)划分[26], 并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列与NCBI-nt数据库进行比对, 获得各样品在不同分类水平上的物种信息.
利用QIIME软件计算样品的α多样性指数, 包括Chao1和Shannon, 评价不同样品中产甲烷菌群落丰富度和多样性情况.采用Origin 2019软件绘制产甲烷菌丰度图、相对丰度图及代谢类型图, 通过QIIME软件聚类分析反映样本间的群落差异.
1.5 环境因子对产甲烷菌群落结构的影响分析利用R语言(v4.0.2)进行BIOENV分析, 选取最优环境因子组合.通过Canoco5冗余分析(redundancy analysis, RDA)探讨土壤环境因子与产甲烷菌群落结构之间的关系, 并用蒙特卡洛检验进行统计学验证.
2 结果与分析 2.1 土壤理化参数分析对土壤样品进行理化参数测定, 11项指标如表 2所示.经ANOVA分析发现, 3种处理下土壤pH、有机质、铵盐、硝酸盐、碱解氮、全磷和电导率均存在显著性差异(P < 0.05), 而全氮、有效磷、速效钾和水溶性盐差异不显著(P>0.05).总体上耐盐碱水稻的土壤pH明显高于另外两种处理, 而电导率最低.有机质、铵盐、碱解氮、全氮、有效磷、全磷和速效钾在水稻土壤中有较高的含量.硝酸盐和水溶性盐可能受土地利用影响, 两者含量在水稻土壤中均低于对照田.
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表 2 土壤样品理化参数1) Table 2 Environmental parameters of soil samples |
2.2 产甲烷菌丰度分析
种植耐盐碱水稻、普通水稻的土壤以及对照土壤中产甲烷菌mcrA基因拷贝数分别为4.04×103~1.16×104、1.56×104~2.93×104和1.20×103~3.18×103 copies·g-1(图 1).3种处理下土壤中的产甲烷菌丰度存在显著差异(P < 0.01), 产甲烷菌丰度的总趋势为：普通水稻土壤>耐盐碱水稻土壤>对照土壤.两种稻田中产甲烷菌丰度随时间变化均呈现先升高后降低的趋势, 分蘖期(6月)丰度最高, 孕穗期(8月)丰度最低, 在成熟期(9月)又有回升的趋势.不同水稻生育期, 两种稻田中的产甲烷菌丰度均表现出显著性变化(P < 0.01), 说明产甲烷菌丰度受水稻生育期的影响.对照土壤产甲烷菌丰度与两种稻田相比变化幅度较小, 不同月份对照土壤产甲烷菌丰度存在显著性差异(P < 0.01).总体来说, 两种水稻种植下产甲烷菌丰度变化趋势相似, 并明显区别于对照土壤, 因此耐盐碱水稻和普通水稻的种植对土壤产甲烷菌丰度均产生了较大影响, 普通水稻更有利于产甲烷菌的生存.
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图 1 3种处理下土壤产甲烷群落丰度随时间的变化情况 Fig. 1 Methanogen community abundance in different months |
采用Illumina高通量测序技术, 对不同处理下土壤样品中产甲烷菌的群落特征进行分析.15个土壤样品共得到133 023条产甲烷菌序列, 每个样品的序列条数介于54 481~110 932之间.本研究共得到302个OTUs, 每个样品的OTUs介于38~123之间.15个土壤样品的覆盖度均大于99.95%, 表明测序量已足够反映样本所包含的产甲烷菌多样性.耐盐碱水稻土壤产甲烷菌群落的丰富度和多样性最大值出现在拔节期(7月), 普通水稻土壤的这两种指数则在分蘖期(6月)达到峰值(表 3).对照土壤产甲烷菌群落丰富度和多样性显著低于水稻土壤(P < 0.01), 表明水稻的种植能够改善土壤质量, 有利于产甲烷菌的生存.不同水稻生育期内, 稻田土壤产甲烷菌丰富度和多样性均存在显著性差异(P < 0.01).
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表 3 不同类型土壤中产甲烷菌群落多样性指数 Table 3 Diversity index of methanogen community in different samples |
2.3.2 产甲烷菌群落组成分析
本研究在属分类水平对3类土壤产甲烷菌群落结构进行差异分析(图 2).水稻移栽前(4月), 两种稻田的产甲烷优势类群不同, 种植耐盐碱水稻的土壤以Methanocella(76.19%)为主导菌群, 种植普通水稻的土壤中Methanobacterium(29.56%)和Methanofollis(29.44%)最具优势, 而对照土壤中含量最丰富的是Methanosarcina(66.20%).水稻移栽后, 水稻根际分泌物和凋落物为产甲烷菌提供丰富的底物, 增加了产甲烷菌群落物种多样性.在整个水稻生育期内, 耐盐碱水稻土壤中产甲烷菌群落主要由Methanocella(23.49%~76.19%)和Methanosarcina(16.91%~57.67%)组成.普通水稻土壤产甲烷菌的优势类群在不同水稻生育期存在差异, Methanosarcina的相对丰度随水稻生长呈现先升高后降低的趋势, 于拔节期(7月)达到最大值, 其相对丰度在拔节期(7月)和孕穗期(8月)均占比超过50.95%, 成为主导菌群; 分蘖期(6月)以Methanoculleus(37.71%)和Methanosarcina(33.47%)为主; 成熟期(9月)则以Methanococcoides(38.42%)和Methanofollis(22.53%)为主.与两种稻田相比, 对照土壤产甲烷菌群落结构单一, Methanosarcina占绝对优势, 在拔节期其相对丰度最低, 而其它阶段占比均超过66.20%.
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ST表示种植耐盐碱水稻的土壤, PA表示种植普通水稻的土壤,CK表示对照土壤; 4、6、7、8和9分别代表采样月份,下同 图 2 属分类水平上产甲烷菌的相对丰度 Fig. 2 Relative methanogen community abundances in different samples at the genus level |
整体上, 耐盐碱水稻和对照土壤中Methanocella(耐盐碱水稻土壤：46.38%、对照土壤：17.51%)和Methanosarcina(耐盐碱水稻土壤：35.41%、对照土壤：59.92%)占比最高.Methanocella在种植耐盐碱水稻的土壤中含量显著高于另外两种处理(P < 0.01), 可能耐盐碱水稻品种对Methanocella的生存更为有利; 而Methanosarcina在3种不同处理的土壤中不存在显著性差异(P>0.05).普通水稻土壤产甲烷菌第一优势类群为Methanosarcina(36.70%), Methanofollis、Methanoculleus、Methanococcoides、Methanocella和Methanobacterium这5种产甲烷菌含量分布在10.60%~15.02%之间.
迄今为止研究者只发现了两种以乙酸为底物生成甲烷的产甲烷菌, 分别为Methanosarcina和Methanothrix[6].这两种乙酸发酵型产甲烷菌中, Methanosarcina在3种不同处理的土壤中大量存在, 而Methanothrix仅在种植耐盐碱水稻和对照土壤中有少量发现.甲基营养型产甲烷菌仅分布在甲烷八叠球菌目、马赛球菌目以及甲烷杆菌目中[4, 6].本研究共发现3种甲基营养型产甲烷菌, 分别是甲烷八叠球菌目下的Methanococcoides和Methanolobus、马赛球菌目下的Methanomassiliicoccus.Methanococcoides在对照和种植普通水稻土壤中分别于拔节期(7月)和成熟期(9月)占比最高, 在耐盐碱水稻土壤中不同水稻生育期内含量均低于7.42%; 而Methanolobus未在耐盐碱水稻中检测到; Methanomassiliicoccus只在水稻种植的土壤中有少量发现.
按照产甲烷菌的代谢类型将其进行分类发现(图 3), 种植耐盐碱水稻的土壤在水稻移栽前(4月)、拔节期(7月)和成熟期(9月)以H2/CO2还原型产甲烷菌为主, 分别占产甲烷菌82.16%、72.57%、56.27%; 而分蘖期(6月)和孕穗期(8月)兼性营养型相对丰度较高, 分别占比57.67%, 43.43%.种植普通水稻的土壤在水稻移栽前(4月)、分蘖期(6月)和成熟期(9月)以H2/CO2还原型产甲烷菌为主, 分别占72.82%、57.65%、42.16%; 在拔节期(7月)和孕穗期(8月)兼性营养型占优势, 分别占63.37%、50.96%.对照土壤除拔节期(7月)外, 兼性营养型产甲烷菌占绝对优势(66.20%~76.15%), 拔节期以H2/CO2还原型(40.94%)为主.整体上产甲烷菌代谢类型在两种稻田中表现为：H2/CO2还原型>兼性营养型>甲基营养型>乙酸发酵型, 而对照土壤则为：兼性营养型>H2/CO2还原型>甲基营养型>乙酸发酵型.
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图 3 不同代谢类型产甲烷菌的相对丰度 Fig. 3 Relative methanogen abundance by metabolic types |
采用基于Weighted Unifrac距离矩阵的非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)对15个土壤样品中产甲烷菌群落进行聚类分析(图 4).结果表明, 15个样品共分为两支, 种植普通水稻的土壤在水稻移栽前(4月)和成熟期(9月)的两个土壤样品形成一个分支, 其余13个样品形成一个分支.耐盐碱水稻土壤样品聚为一簇, 表明不同生育期耐盐碱水稻土壤产甲烷菌群落结构相似, 且明显区别于其它两种处理, 其中水稻移栽前、拔节期(7月)以及成熟期3种土壤样品, 均以H2/CO2还原型产甲烷菌Methanocella(>47.36%)为优势菌群聚为一支, 分蘖期(6月)和孕穗期(8月)的土壤则以兼性营养型产甲烷菌Methanosarcina(>43.43%)为优势聚为一支.对照土壤除拔节期(7月)外均与普通水稻土壤拔节期、孕穗期的土壤样品聚为一支, 以上6个土壤样本均以兼性营养型的Methanosarcina(>50.96%)作为产甲烷菌的优势菌群.
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图 4 产甲烷菌群落结构聚类分析 Fig. 4 Cluster analysis of methanogen community |
BIOENV分析发现, 有机质、铵盐、有效磷和电导率对种植耐盐碱水稻的土壤产甲烷菌群落结构影响较大; pH、有机质、铵盐和有效磷对种植普通水稻的土壤产甲烷菌群落结构影响较大; 硝酸盐、碱解氮和速效钾对照土壤产甲烷菌群落结构影响较大.在属分类水平上分别对3种不同处理土壤中的产甲烷菌群落与上述最优环境因子组合进行RDA分析.
耐盐碱水稻土壤RDA[图 5(a)]表明第一与第二排序轴的累计解释量为98.16%, 在水稻移栽前(4月)、拔节期(7月)及成熟期(9月), Methanocella、Methanolobus、Methanoregula和Methanofollis与电导率呈正相关; 有机质、有效磷和铵盐与分蘖期(6月)和孕穗期(8月)两种土壤样品中的其它产甲烷菌均呈现正相关关系.蒙特卡洛置换检验显示上述4个环境因子对耐盐碱水稻土壤产甲烷菌群落结构不存在显著影响(P>0.05).普通水稻土壤RDA[图 5(b)]表明第一与第二排序轴的累计解释量为84.04%, 只有分蘖期、拔节期和孕穗期土壤中的Methanosarcina、Methanoculleus、Methanocella和Methanomassiliicoccus与有机质、pH、有效磷及铵盐呈正相关.蒙特卡洛置换检验显示上述4个环境因子对普通水稻土壤产甲烷菌群落结构也不存在显著影响(P>0.05).对照土壤RDA[图 5(c)]表明, 第一与第二排序轴的累计解释量为93.89%, 在拔节期Methanococcoides、Methanogenium、Methanothrix和Methanofollis与硝酸盐呈明显正相关, 而其它阶段土壤中Methanosarcina、Methanocella和Methanobacterium等与碱解氮、铵盐呈正相关.蒙特卡洛置换检验显示上述3个环境因子对对照土壤产甲烷菌群落结构影响不显著(P>0.05).由此表明在3种处理下土壤产甲烷菌群落分布均受到多种环境因素综合影响.
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图 5 产甲烷菌群落与环境因子的RDA分析 Fig. 5 Redundancy analysis of methanogen community and environmental parameters |
种植耐盐碱水稻的土壤中产甲烷菌平均丰度为7.25×103 copies·g-1, 种植普通水稻的土壤为2.24×104 copies·g-1, 对照土壤则为2.66×103 copies·g-1.本研究两种稻田中的产甲烷菌丰度明显低于之前的相关研究[20, 27, 28], 可能与水稻种植年限有关[29].微生物丰度受土地利用、植株生长阶段的影响[30, 31], 本研究发现水稻种植和水稻生育期对土壤中产甲烷菌丰度产生了明显影响.水稻移栽后, 除水稻植物残基和土壤有机质外, 易降解化合物通过水稻根系释放到土壤中[31], 为产甲烷菌的生存提供了新的条件.两种稻田中的产甲烷菌丰度在分蘖期(6月)均显著高于其它生长阶段(P < 0.01), 这与李大明等[32]的研究结果相同.有研究还发现, 甲烷在水稻分蘖期排放量最高[33, 34], 甲烷排放量与产甲烷菌丰度呈正相关关系[35].因此推测分蘖期水稻根系分泌物和脱落物为产甲烷菌提供了更充足的底物来源.本研究两种稻田中的产甲烷菌丰度从分蘖期(6月)到孕穗期(8月)逐渐降低, 推测可能存在种内竞争, 而孕穗期降雨量(588 mm)的迅速增加为产甲烷菌提供了理想的厌氧环境, 因此其丰度在成熟期(9月)又呈现回升趋势.有研究发现产甲烷菌丰度随植被演替发生变化[36], 而葛会敏[37]通过对不同水稻品种根际土壤产甲烷菌进行比较, 发现不同水稻品种对产甲烷菌丰度有显著影响.本研究普通水稻土壤产甲烷菌丰度显著高于耐盐碱水稻土壤(P < 0.01), 因此土壤微生物丰度可能受作物品种差异影响.
此外, 本研究还发现耐盐碱水稻土壤和对照土壤中的环境因子对产甲烷菌丰度均不存在显著影响(P>0.05), 普通水稻土壤中碱解氮(r=0.950, P < 0.05)和全氮(r=0.909, P < 0.05)与产甲烷菌群落丰度显著正相关, 推测氮素可能通过促进水稻生长间接影响产甲烷菌丰度.综上, 土壤产甲烷菌丰度可能受作物品种、作物生长发育和环境因子的综合影响.
3.2 水稻土壤中产甲烷菌代谢类型分析本研究结果表明, 耐盐碱水稻土壤中产甲烷菌的优势类群为Methanocella和Methanosarcina, 与之前稻田土壤产甲烷菌的研究结果一致[7, 20, 38].耐盐碱水稻土壤Methanocella和Methanosarcina总体占比超过81.78%, 表明耐盐碱水稻可能对产甲烷菌有驯化、选择作用, 更适合于以上两种产甲烷菌的生长.其中Methanocella属于H2/CO2还原型产甲烷菌[4], Methanosarcina底物代谢灵活, 可利用氢气、甲醇、甲胺和乙酸生长, 是一种兼性营养型产甲烷菌[6].本研究中, 以上两种产甲烷菌丰度随水稻的生长处于动态变化之中, 表现为此消彼长. 皮尔逊相关分析发现两者存在显著负相关关系(r=-0.959, P < 0.05), 猜测两种产甲烷菌可能存在生态位重叠, 竞争共同的底物氢气.
有研究表明不同植被覆盖下产甲烷菌群落结构有所差异[39, 40], 而同一植物不同品种类型也是影响根际微生物群落结构的重要因子[41].本研究中不同水稻品种对产甲烷菌群落结构存在影响, 与Conrad等[42]的发现相同.种植普通水稻的土壤优势产甲烷菌类群较种植耐盐碱水稻的土壤更为多样, 包括Methanosarcina、Methanofollis、Methanococcoides以及Methanoculleus等, 与以往研究有较大差异[43, 44], 可能与地理位置有关, 有研究表明不同地理位置下气候条件差异也是产甲烷菌群落结构变化的重要因素[45, 46].产甲烷菌优势种随水稻生长发育而改变已有报道[47], 本研究在普通水稻土壤中也有相同发现, H2/CO2还原型产甲烷菌Methanofollis、Methanobacterium在水稻移栽前占优势; H2/CO2还原型Methanoculleus在分蘖期占优势; 兼性营养型Methanosarcina在拔节期和孕穗期占优势; 而甲基营养型Methanococcoides和H2/CO2还原型Methanofollis在成熟期占优势.
根据产甲烷菌的群落结构可以推测稻田中的产甲烷代谢途径.Watanabe等[48]的研究发现, 日本安城和福冈稻田土壤中优势产甲烷菌包括Methanomicrobiales(H2/CO2还原型)、Methanosarcinaceae和Methanosaetaceae, 推测该区域的产甲烷途径主要为H2/CO2还原型和乙酸发酵型; Xu等[49]采用稳定同位素探测技术发现江苏省某稻田以H2/CO2还原型Methanobacteriaceae为主, 说明该地产甲烷菌主要通过H2/CO2还原途径生成甲烷; Hernández等[50]的研究发现Methanobacteriaceae和Methanosarcinaceae是黑龙江三江平原淹水稻田中的优势产甲烷菌, Methanosarcinaceae底物代谢灵活, 因此推测3种产甲烷代谢途径在该稻田中均有可能发生.本研究中, 耐盐碱水稻土壤包括H2/CO2还原型、兼性营养型、甲基营养性和乙酸发酵型4种代谢类型的产甲烷菌, 整个水稻生育期内以H2/CO2还原型产甲烷菌Methanocella最具优势; 而普通水稻土壤包括H2/CO2还原型、兼性营养型和甲基营养性这3种代谢类型的产甲烷菌, 整体上Methanofollis、Methanoculleus、Methanocella和Methanobacterium等H2/CO2还原型产甲烷菌占优势地位.由此推断产甲烷菌在本研究耐盐碱水稻土壤和普通水稻土壤中主导的代谢途径均为H2/CO2还原途径.
3.3 产甲烷菌群落结构变化的影响因素研究表明水稻生育期对土壤微生物群落结构有明显影响[51], 本研究同样发现耐盐碱水稻土壤中Methanosarcina、Methanocella、Methanobacterium和Methanoculleus在不同水稻生育期内差异显著(P < 0.05), 普通水稻土壤中Methanosarcina、Methanocella、Methanofollis和Methanoregula在不同水稻生育期也有显著性差异(P < 0.05), 表明产甲烷菌群落结构会随水稻生长发育发生变化.
袁婧[44]对稻田的研究发现碳氮比是影响产甲烷菌群落结构的最重要因子, 还有研究表明pH、纬度及C/N等也是影响产甲烷菌群落组成的重要环境因子[17, 52], 硝酸盐可以通过抑制产甲烷菌代谢底物氢气、乙酸等的生成进而缓解甲烷的释放[7], 此外产甲烷菌对温度较为敏感, 能够敏感响应温度变化[53].本研究发现, 耐盐碱水稻土壤、普通水稻土壤和对照土壤产甲烷菌群落的环境影响因子存在一定差异.单一的环境因子对产甲烷菌群落结构不存在显著影响, 表明稻田土壤产甲烷菌群落结构和分布可能受多种环境因子的综合影响.
4 结论(1) 产甲烷菌群落丰度：种植普通水稻的土壤>种植耐盐碱水稻的土壤>对照土壤, 产甲烷菌在稻田土壤中的丰富度、多样性均显著高于对照土壤(P < 0.05), 水稻的种植促进了产甲烷菌的生长.
(2) 水稻品种、水稻生育期、环境因子共同影响土壤产甲烷菌的丰度及其群落组成.
(3) 整个水稻生育期内, 种植耐盐碱水稻的土壤和种植普通水稻的土壤均以H2/CO2还原型产甲烷菌占优势地位, 而对照土壤兼性营养型产甲烷菌占绝对优势.由此推测产甲烷菌在耐盐碱水稻土壤和普通水稻土壤中主导的产甲烷途径均为H2/CO2还原型, 对照土壤则为兼性营养型.
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