湿地是陆地与水域之间的过渡生态系统^[1], 白洋淀(38°43′~39°02′N, 115°38′~116°07′E) 位于河北省中部平原, 淀区平均水深约2.5 m, 东西长39.5 km, 南北宽28.5 km^[2], 是中国北方区域最大的淡水湿地, 其微生物群落具有自身区域特性的复杂性^[3].补水水质和淀区内的人类社会活动是影响白洋淀湿地微生物群落的关键因素, 是白洋淀湿地微生物群落系统演变的主要原因^{[4, 5]}.由于北方干旱少雨, 白洋淀水面蒸发量较大, 淀区常年处于资源性缺水, 历史上入淀河流中仅府河常年接纳上游生活污水和工业给水常年有水, 由于入淀水质较差, 淀区水体自净能力逐渐变低, 水体环境逐渐受到破坏^[6].白洋淀淀区自有人口10多万人, 每年有大量游客入淀旅游, 当地居民的种植、养殖、生活和旅游业的快速发展和沉积物营养盐的释放, 都给白洋淀生态环境带来不利影响^{[7, 8]}. 2016~2019年河北省生态环境厅在白洋淀区域7月和8月监测数据显示, 白洋淀淀区及入淀河流水质为劣Ⅴ类, 属于重度污染, 入淀水体中营养盐含量过高导致淀区水体富营养化严重^[9].白洋淀作为雄安新区核心水系, 其水质状况对京津冀的协同稳步发展起着至关重要的作用^[10].

微生物在湿地水环境系统中占有重要地位, 是多数营养物质的转化和分解者.入淀水质和人类社会活动对白洋淀水质环境的持续影响, 导致湿地水环境中的环境污染物日益增多.微生物通过同化、异化等作用影响湿地水环境中无机盐、有机污染物等物质的分布、迁移和转化^[11].为了阐明白洋淀湿地补水水质与社会活动对湿地生物群落的影响, 根据白洋淀人类社会活动的干扰特征和国家监控断面的分布, 选取了4个典型区域进行采样.本文研究湿地不同区域水质与水体中微生物群落的变化特征, 以期为阐明湿地中污染物质的迁移转化规律提供基础数据支撑, 对湿地系统的污染治理与环境管理具有重要意义.

本研究的样品采集位于白洋淀区域, 2019年7月进行采样, 分为4个采样点采集水样, 分别为接纳入淀城市尾水的府河入淀口(NBB)、人员活动密集区的旅游景点嘎子村(NBD)、居民生活与养殖区圈头(NBX)和村庄稀少区域采蒲台(NBN), 每个点采集3个平行样, 所有采样点距离岸边2 m, 采样深达40 cm, 采集样品充分混合后放入采样瓶, 现场检测pH值和溶解氧, 采样瓶放入0℃采样箱内冷藏保存带回实验室分析.样品一部分进行理化分析, 另一部分送上海美吉公司进行高通量分析.

纳氏试剂分光光度法测定氨氮(NH₄⁺-N)、硝态氮(NO₃^-)的测定用紫外分光光度法、亚态盐(NO₂^-)氮的测定用分光光度法、总氮(TN)的测定用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法, Hydrolab多参数水质检测仪测定pH值以及溶解氧^[12].

利用0.45 μm水系醋酸纤维膜过滤2.5 L水样, 收集滤膜截留物, 采用Fast DNA Spin Kit (MP Biomedicals)试剂盒提取样品中的DNA, 然后采用NanoDrop2000(Thermo Scientific, Wilmington, USA)测定DNA浓度, 提取DNA低温保存送美吉生物进行高通量测序.测序细菌测定引物采用338F/806R^[13], 真菌18S引物为SSU0817F/1196R^[14], 古菌引物为524F10extF/Arch958R_modR^[15], 引物序列如表 1.

表 1 (Table 1)

表 1 不同菌群高通量测序引物信息 Table 1 High-throughput sequencing primer information of different bacterial groups 测序类型 引物名称 引物序列 长度/bp 测序平台 扩增片段 文献 细菌16S rRNA 338F 806R 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′ 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′ 468 PE300 V3-V4 [14] 真菌18S SSU0817F 1196R 5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′ 5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′ 379 PE250 V5-V7 [15] 古菌 524F10extF Arch958R_modR 5′-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3′ 5′-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3′ 434 PE300 V4-V5 [16]

表 1 不同菌群高通量测序引物信息 Table 1 High-throughput sequencing primer information of different bacterial groups

利用表 1引物进行PCR扩增, 使用Illumina MiSeq平台进行测序.根据PE reads之间的overlap关系, 将成对的reads拼接(merge)成一条序列, 同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤, 根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列(优化序列)^[16].

采用(http://www.i-sanger.com/)对测序有效序列进行分析.群落中微生物种类多少代表了群落的复杂程度的高低, 利用Shannon指数对样品微生物群落多样性进行分析^[17].稀释曲线(rarefaction curve)主要利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线, 以此反映各样品在不同测序数量时的微生物多样性, 当曲线趋向平坦时, 说明测序数据量合理, 可以反映样品中绝大多数的微生物多样性信息^[18].该分析选择97%相似度的OTU, 利用mothur计算不同随机抽样下的α多样性指数, 利用R语言工具制作曲线图^[19].

利用Venn图可以统计多组或多个样品中所共有和独有的物种(如OTU)数目, 可以比较直观地表现环境样品的物种(如OTU)数目组成相似性及重叠情况, 重叠程度较高的为核心群落, 常规分析时选用相似水平为97%的OTU^[20].

根据分类学分析结果, 可以得知一个或多个样品在各分类水平上的分类学比对情况.分别构建门水平分类图, 显示微生物群落的变化特征.

每个样品设置3个平行进行理化指标分析, 分析结果取平均值由表 2可以看出, 白洋淀不同区域的水质偏碱性, NBB样品水质质量明显低于其他3个采样点, NBN水质质量最好, 主要由于白洋淀通过府河收纳上游城市污废水, 一些废水排放企业处理水质不达标, 这些废水与上游市区的城市尾水经府河流入淀区, 使淀区入口处水质较差.NBD旅游区人口数量较大, 产生生活污水与废弃物较多, 影响了该区域水质状况.NBX为居民生活区域, 居民各类养殖较多, 养殖废水的排放对周围水域水质产生了影响, 水质整体状况好于NBB和NBD.污废水在流经湿地过程中得到净化, NBN采蒲台区域村庄较少, 人口密度小, 受人为干扰因素少, 水质较好.通过分析可以得出淀区南部采蒲台所在区域水质优于北部, 北部区域由于大量生活污水和工业废水的排入以及旅游养殖业业的快速发展, 水体污染严重, 部分区域表现为富营养化现象, 王珺等^[21]的研究也得出同样的结论.

表 2 (Table 2)

表 2 样品化学特征分析 Table 2 Chemical characteristic analysis of samples 采样点 府河入淀口(NBB) 嘎子村(NBD) 圈头(NBX) 采蒲台(NBN) pH 7.81 8.05 8.22 8.31 COD/mg·L-1 12.35 8.61 7.82 6.9 溶解氧/mg·L-1 4.51 5.87 6.52 7.85 总氮/mg·L-1 10.12 8.67 2.82 1.82 硝态氮/mg·L-1 2.10 0.83 0.76 0.31 氨氮/mg·L-1 7.36 2.68 1.72 1.48 总磷/mg·L-1 0.38 0.22 0.08 0.05

表 2 样品化学特征分析 Table 2 Chemical characteristic analysis of samples

由图 1香农指数(Shannon)可以看出, NBB的Shannon指数为5.86, 样品微生物品种类型较多, NBD与NBX的Shannon指数分别为5.49与5.72, NBN最少为4.78.主要由于府河入淀口处水质较复杂, 含有碳氮有机物较多, 微生物所需养分充足种类增加.NBD与NBX由于湿地作用分解部分氨氮与有机物, 但人类社会活动使含碳氮有机污染物增加, 为水体中细菌提供了养分来源, 细菌的多样性较多, NBN区域人类活动影响较小, 在湿地净化作用下, 水质状况较好, 水体中含有的碳氮污染物较少, 细菌种类减少.

图 1

Fig. 1

图 1 不同样品细菌多样性分析 Fig. 1 Diversity indices of bacteria in different samples

采用样品抽样序列数与它们所代表的OTU数目构建稀释性曲线.由图 2(a)可以看出, 4个土壤样品的稀释性曲线在reads为30 000条时均趋于平坦, 增加测序reads对发现新的OTU数目贡献较小, 表明测序reads合理, 测序数据可以反映群落特征.图 2(b)中全部样品细菌OTU分布数目为2 552个, 其中4种样品中重叠的OTU分布数目为731个, 占所有样品总OTU的28.6%. NBB、NBD和NBN这3种样品OTU重叠数量为185, NBB、NBD和NBX 3种样品OTU重叠数量为156, NBB、NBN和NBX 3种样品OTU重叠数量为100, NBD、NBN和NBX 3种样品OTU重叠数量为60. NBB府河入淀口处OTU独有分布数目200个, 占全部OTU的7.8%.NBD嘎子村样品中细菌OTU独有分布数目201个, 占全部OTU的7.81%. NBX圈头OTU独有分布数目311个, 数量最多.NBN采蒲台OTU独有分布数目95数量最少.各样品细菌OTU分布数目由多到少依次为：NBX、NBD、NBB和NBN, 表明农业养殖和人类活动对水体中微生物的种类影响是非常明显的.

图 2

Fig. 2

图 2 不同样品中细菌OTU的稀释曲线和分布 Fig. 2 Rarefaction curves and bacteria OTU distribution in different samples

对OTU的代表序列在细菌门与属划分水平上进行分类学分析, 由图 3可以看出, 4个样品中检测出的细菌分为13个门, 主要包括: 变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteriota)、拟杆菌门(Bacteroidota)和放线菌门(Actinobacteriota)等, 各样品共有的主要菌门相对丰度较高, 其中变形菌门所占丰度最高.粘球菌门(Myxococcota)、脱硫细菌门(Desulfobacterota)、弯曲杆菌门(Campilobacterota)和贝氏弧菌门(Bdellovibrionota)相对丰度较低, 具体数值如下：在样品NBB中, Proteobacteria(45.4%)、Chloroflexi(19.4)%、Acidobacteriota(6.4%)、Bacteroidota(4.3%)、Actinobacteriota(10.9%)、Firmicutes(2.4%)和Gemmatimonadota(2.2%).在样品NBD中, Proteobacteria(50.2%)、Chloroflexi(17.7)%、Acidobacteriota(6.4%)、Bacteroidota(2.3%)、Actinobacteriota(7.1%)、Firmicutes(4.3%)和Gemmatimonadota(2.2%); 在样品NBX中, Proteobacteria(50.3%)、Chloroflexi(5.4)%、Acidobacteriota(9.5%)、Bacteroidota(13.5%)、Actinobacteriota(2.4%)、Firmicutes(7.2%)、Gemmatimonadota(2.9%)和Myxococcota(2.9%).在样品NBN中, Proteobacteria(68.8%)、Chloroflexi(8.0)%、Acidobacteriota(3.1%)、Bacteroidota(4.1%)、Actinobacteriota(2.0%)、Firmicutes(3.7%)和Myxococcota(2.9%).结果表明, 4个样点的细菌比较丰富.每个样品的优势菌都是变形菌门(Proteobacteria), NBN变形菌门菌群所占比例最高, 其它菌群在NBN中分布比较均匀, NBB与NBD这2个样品中菌群群落结构比较相似.

图 3

Fig. 3

图 3 不同样品细菌门水平分类 Fig. 3 Bacteria phyla levels in different samples

由图 4可以看出, NBB样品府河入淀口处的Shannon指数为2.14, 样品真菌包含类型最少.NBD多样性指数为2.98, 表明人类活动频繁, 使真菌的种类的多样性增加.NBX的Shannon指数分别与2.82, 表明养殖废水排入影响了真菌的群落结构, 主要由于养殖需要添加部分抗生素影响了真菌的群落结构.NBN的Shannon指数为3.23, 真菌的群落多样性高于其它区域, 原因可能是由于该区域村庄稀少, 四周植被较多, 土壤真菌种群丰富, 暴雨径流冲刷将大量陆地土壤真菌携带至NBN生态系统, 同时该区域细菌种类较少, 种间竞争相对较少, 使该区域真菌群落较丰富.丰富的水体真菌群落结构将在湿地水体自净过程(如有机物生物分解)中发挥重要作用^[22].

图 4

Fig. 4

图 4 不同样品真菌多样性指数 Fig. 4 Diversity indices of fungus in different samples

由图 5(a)可以看出, 样品的稀释性曲线在reads为20 000条时均趋于平坦, 测序reads为30 000条, 表明测序reads合理, 测序数据可以反映群落特征.由图 5(b)可以看出在97%相似度水平下, OTU总数为481个. NBD的OTU数最高, 为270, 而NBB的OTU数最低, 为186. 4个样品中共有62个相同的OTU样品, 占总数的12.9%. NBB、NBD和NBN 3种样品OTU数量为11, NBB、NBD和NBX 3种样品OTU数量为15, NBB、NBN和NBX 3种样品OTU数量为5, NBD、NBN和NBX 3种样品OTU数量为52.NBB府河入淀口处独有OTU数目76个, 占全部OTU的15.8%.NBD嘎子村样品中细菌OTU分布数目53个, 占全部OTU数目的11%.NBX圈头OTU分布数目57个, NBN采蒲台OTU独有52数目数量最少.各样品真菌OTU分布数目由多到少依次为: NBB、NBX、NBD和NBN, 表明不同水域之间真菌群落在多样性上有差异.

图 5

Fig. 5

图 5 不同样品中真菌OTU的稀释曲线和分布 Fig. 5 Rarefaction curves and fungus OTU distribution in different samples

把序列按照其相似性划分为多个单元, 每个单元对应一个OTU.把相似水平在97%以上的OTU进行生物信息统计分析, 将4个不同样品, 共481个OTU统计到门类别上形成柱状图(图 6), 分类结果表明481个OTU主要属于12个门, 具体结果如图 6所示.NBB府河入淀口处的主要类别如下, 主要菌群为Ascomycota(90.9%)、Basidiomycota(5.7%)和其他未分类菌占(2.3%), 其余菌群所占比例较小.NBD样品中, 菌群分类比NBB增多, Ascomycota(50.1%)、SAR_k_norank (6.1%)、Basidiomycota(24.5%)、norank_d_Eukaryota(1.5%)、Chytridiomycota(5.4%)、Aphelidea(3%)和norank_k_Cryptophyceae(1.6%).NBX样品中Ascomycota(59%)、SAR_k_norank (20.3%)、Basidiomycota(11.7%)、norank_d_Eukaryota(3.5%)和Chytridiomycota(1.3%).NBN样品中真菌分布为Ascomycota(36.3%)、SAR_k_norank (19%)、Basidiomycota(2.0%)、norank_d_Eukaryota(14.1%)、Chytridiomycota(9.8%)、Aphelidea(11.1%)和norank_k_Cryptophyceae(1.7%).Illumina MiSeq高通量测序结果表明, 4个样点的真菌种类都比较丰富.每个样品的优势菌都是子囊菌门(Ascomycota), 其他非优势菌菌群和多样性存在差异.SAR_k_norank在NBB中菌群数量较少, 在其他3个样品中菌群数量较多.

图 6

Fig. 6

图 6 不同样品真菌不同水平分类 Fig. 6 Fungus phyla levels in different samples

由图 7可以看出, NBB、NBD和NBX样品多样性指数均大于3, 分别为3.4、3.6和3.2, NBN的Shannon指数为2.98.主要由于入淀水质与人类频繁社会活动带来大量有机污染物, 有机物分解消耗水体中的氧气, 厌氧或低氧过程有利于多种产甲烷菌的生长, 对水体中古菌群落产生影响, 促使NBB、NBD和NBX样品中古菌种类总量增加, NBN样品附近水域村庄稀疏, 人类社会活动较少, 同时水体在流经湿地过程中的净化作用, 水体中有机污染物减少, 溶解氧逐渐升高, 古菌由于缺乏合适的生长环境, 数量逐渐降低.

图 7

Fig. 7

图 7 不同样品古菌多样性指数 Fig. 7 Diversity indices of archaea in different samples

由图 8(a)可以看出, 样品的稀释性曲线在reads为25 000条时均趋于平坦, 测序reads为30 000条, 表明测序reads合理, 测序数据可以反映群落特征.由图 8(b)可以看出在97%相似度水平下, OTU总数为271个.NBD的OTU数最高, 为214, NBB、NBD和NBN这3种样品OTU数量分别为210、207和205.各样品包含OTU数量差异不大, 4个样品共有160个相同的OTU样品, 占总数的59%, 共有OTU样品较高, 表明4个样品中共有古菌群落较多.NBB、NBX、NBD和NBN样品中独有OTU数量分别为10、16、17和11, 表明社会活动使水体中古菌数量增加, 随着环境的变化以及营养物质的缺乏, 部分新增菌落逐渐消失.

图 8

Fig. 8

图 8 不同样品中古菌OTU的稀释曲线和分布 Fig. 8 Rarefaction curves and archaea OTU distribution in different samples

古菌的门水平群落结构组成如图 9所示, 在4个样品中共获得5门和13属古菌群落组成, 古菌群落组成主要以泉古菌门(Crenarchaeota) 为优势门类, 其次为盐杆菌门(Halobacterota)、嗜热菌门(Thermoplasmatota)、广古菌门(Euryarchaeota).NBB样品中Crenarchaeota(39.0%)、Halobacterota(37.6%)、Thermoplasmatota(15.9%)、Euryarchaeota(4.3%)、unclassified_k_norank_d_Archaea(3.1%).NBD样品中Crenarchaeota、Halobacterota、Thermoplasmatota、Euryarchaeota和unclassified_k_norank_d_Archaea菌群占总数的比例分别为51.9%、24.6%、12.8%、7.5%和3.2%.NBX样品中Crenarchaeota、Halobacterota、Thermoplasmatota、Euryarchaeota和unclassified_k_norank_d_Archaea菌群占总数的比例分别为47.3%、31.2%、7.9%、5.8%和7.5%.NBD样品中Crenarchaeota菌群占总数的30.1%、Halobacterota菌群占总数的38.5%、Thermoplasmatota菌群占总数的25.7%、Euryarchaeota(2.7%)和unclassified_k_norank_Archaea(2.9%).由图 9中样品所占比例可以看出, NBD与NBX样品古菌群落相似度较高, NBN样品中各群落所占比例与其它样品差异较大, Thermoplasmatota菌群出现了显著增加, 该菌群在适宜条件下能把有机污染物快速地转化为CH₄, 减少了有机污染物停留时间.

图 9

Fig. 9

图 9 不同样品古菌门水平分类 Fig. 9 Archaea phyla levels in different samples

由以上结果分析可以看出, NBB总氮和氨氮分别为10.12 mg·L^-1和7.36 mg·L^-1, 表明补给水质状况影响淀区水质, 水体富营养化严重.经过湿地作用后, NBD水质状况有所提高, 总氮和氨氮分别降为8.67 mg·L^-1和2.68 mg·L^-1, 但由于人类旅游等社会活动影响, 水质富营养化现象仍然较重.NBX污染物经过湿地物理和化学作用, 总氮和氨氮含量降低明显分别为2.82 mg·L^-1和1.72 mg·L^-1, 表明淀区养殖业对水质有一定影响, 由于养殖产生废弃物多为容易降解有机物, 湿地系统对该类污染降解效果较好.NBN总氮和氨氮分别为1.82 mg·L^-1和1.48 mg·L^-1, 水质达到地表水Ⅴ类水标准, 水质明显变好.通过分析可以得出补给水质和社会活动是导致水体富营养化的主要原因, 其次为养殖业, 污染水质经过湿地系统后水质明显好转, 湿地处理有机污染污废水效果显著.水体中微生物是水域生态系统的重要组成部分, 在水体生态系统中发挥着重要的生态作用, 不同微生物群落具有其独特的生态功能, 构成了微生物功能多样性^[23].补给水质与人类各类社会活动导致淀区水体出现富营养化, 对淀区微生物群落结构产生明显影响.

在图 3中显示, 变形菌门为主要菌群, 其次为绿弯菌门、酸杆菌门、拟杆菌门和放线菌门等.有研究发现变形菌门菌群(Proteobacteria)是生活污水处理系统系统和废水生物反应系统的主要种群, 包含多种代谢种类, 在降解有机物的同时完成脱氮除磷的功能^[24].绿弯菌门(Chloroflexi)含有叶绿素, 可以进行光合作用, 快速利用水体中有机物及氮磷元素, 是初级生产者.Kragelund等^[25]在对活性污泥中绿弯菌门(Chloroflexi)的种类、丰度和生态生理学的研究中也发现, 绿弯菌门(Chloroflexi)具有较好的生物脱氮、除磷作用.Hill等^[26]的研究发现拟杆菌门(Bacteroidota)具有非常强的营养物质代谢能力, 如复杂有机物、蛋白质和脂类等.王鹏等^[27]对河道水体黑臭前后微生物种群变化研究发现, 厚壁菌门是影响黑臭的关键门, 白洋淀水域生活污水和养殖废水的输入是淀区部分区域水体朝黑臭水体转变的主要原因所在.在图 3中显示NBX和NBD样品中, 厚壁菌门菌群所占比例明显增加, 厚壁菌门与废水及废弃物的厌氧处理有关, 其中包含的芽孢杆菌纲(Clostridia)与COD及难以分解的大分子有机物的降解有关.表明人类社会活动, 大量含氮磷污染物的排放, 为厚壁菌门菌群提供了良好的生活环境, 水体有逐渐转变为黑臭趋势^[28].有研究者对长江中游枯水季水体菌群的测序结果也表明, 变形菌门为水体微生物优势菌门, 主要由于变形菌门中包含了多数与氮代谢相关菌群, 在氮磷的代谢过程中发挥重要作用^[29].

在图 6中显示, 子囊菌门(Ascomycota)是所有样品的优势菌群, SAR_k_norank与担子菌门(Basidiomycota)在样品中变化差异较大、不同区域主要真菌群落所占比例不同, 壶菌门(Chytridiomycota)在NBD、NBN和NBX中出现, 在NBN中所占比例较大, 说明湿地环境的变化对真菌群落结构的影响非常明显, 主要是由于人类社会活动把更多的陆生真菌类群(担子菌门)带入到了淀区水体中.壶菌门类群是水体中普遍存在的真菌类群, 大多腐生在动植物残体上或寄生于水生植物、藻类、小动物和其他真菌上, 是难降解有机碳的主要分解者(纤维素和几丁质)^[30].

(1) 补给水质和社会活动使湿地水体中有机物和氮磷含量增加, 水体发生富营养化, 湿地净化功能出现退化趋势.

(2) 不同区域水体中细菌和真菌菌群发生了变化, 社会活动和养殖增加了水体发生黑臭的可能性; NBN中腐生类菌群壶菌门群落数量增加, 该区域难降解有机碳增加; 古菌群落组成受环境影响变化不明显.

(3) 引起白洋淀淀区污染及微生物群落变化的主要因素是外源污染和内源污染共同作用结果.