2021, Vol. 42
2. 中国检验认证集团福建有限公司, 福州 350002
2. China Certification & Inspection Group Fujian Co., Ltd., Fuzhou 350002, China
聚苯乙烯(polystyrene, PS)具有良好的可塑性以及稳定性, 主要用途为各类工业品外壳和绝缘材料等, 被广泛应用于建筑、制造和包装等诸多领域[1~3].据统计2015年全球PS产量为2 500万t, 而同年产生的PS废料为1 700万t, 回收率不足40%[4, 5].大量的PS沦为废弃物, 并在陆地、海洋甚至空气中不断累积, 是构成“白色污染”的主要来源[6~8].此外, 环境中废弃的PS可沦为有毒有害化学物质、微生物和持久性有机污染物的良好载体, 对生态环境造成破坏, 威胁人类及动物的生命安全[9~13].因此, 如何妥善且有效地处理PS废弃物, 已成为全世界有待解决的环境问题.
传统处理废弃PS的方法主要包括焚烧、填埋和物理化学回收利用等[14, 15].但这些方法存在着二次污染、处置不彻底和处理成本高等缺点[16].而生物降解是一种环境友好型的处理方法, 利用昆虫或微生物的取食及代谢过程, 将塑料及其他有机废弃物转化为水和二氧化碳等产物, 经济有效且无二次污染[17~19].有研究表明, 蜡螟(Galleria mellonella)幼虫能够快速啃食并高效降解聚乙烯(polyethylene, PE)塑料袋, 生成乙二醇[20].黄粉虫(Tenebrio molitor)能够对聚苯乙烯发泡塑料进行取食和降解, 降低其相对分子质量, 并改变其分子结构[18, 21].然而, 随着进一步的研究发现, 导致塑料降解的主要原因是寄生在昆虫肠道内的微生物群落[17, 18].有学者在蜡虫和黄粉虫的肠道中分离获得Bacillus sp. YP1、Enterobacter asburiae YT1和Exiguobacterium sp. YT2菌株, 这些微生物能够以PE或PS作为碳源进行生长, 并将其降解成低分子物质[17, 21].同时, 陈冠舟等[22]的研究发现黄粉虫肠道微生物菌群具有17个与芳香族化合物和烷烃降解相关功能基因, 进一步从基因学的角度证实了微生物在塑料降解过程中具有重要作用.
高温氧化处理, 可以促使废弃塑料中C—C结构的断裂, C—O和C＝O结构的增加, 从而提高PS塑料的生物可降解性[23~25].嗜热微生物广泛存在于堆肥、火山和温泉等高温环境中, 具有热稳定性好和生物转化效率高等特点, 能够促进有机污染物的高效降解[26].然而, 目前对嗜热微生物介导的PS塑料降解还缺乏深入研究.本文以1株从超高温堆肥中筛选出的嗜热菌为研究对象, 探究其在高温环境下对PS的降解性能及降解过程中PS表面结构的变化, 以期为利用嗜热微生物发展高效塑料降解技术奠定基础.
1 材料与方法 1.1 供试菌源嗜热脂肪地芽胞杆菌-FAFU011菌株(Geobacillus stearothermophilus FAFU011)由本实验室从北京顺义污水处理厂超高温堆肥腐熟料中筛选, 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心, 保藏号为CGMCC No.15303.
1.2 供试聚苯乙烯塑料由于无市售PS薄膜样品, 本实验采用的PS样品为本实验室自制.将中国石化福建分公司出售的聚苯乙烯发泡塑料溶解于二甲苯(阿拉丁试剂上海有限公司, 分析纯)中, 配置浓度为3.0×10-2 mg·L-1的混合溶液[17], 均匀倒在玻璃平板上, 干燥48 h后将PS膜揭下, 并用甲醇浸泡清洗薄膜表面残留的二甲苯, 经去离子水超声洗涤后, 裁剪至20 mm×20 mm的大小以供使用.在实验前, 所有样品均使用75%乙醇(国药集团化学试剂有限公司, 分析纯)溶液浸泡灭菌20 min, 再用无菌水清洗和风干后备用.
1.3 培养基的制备菌体富集培养基[27](国药集团化学试剂有限公司, 分析纯): 0.5 g·L-1酵母提取物、2.0 g·L-1 NH4SO4和10 mL微量元素(1.0 g·L-1 FeSO4·7H2O、1.0 g·L-1 MgSO4·7H2O、0.1 g·L-1 CuSO4·5H2O、0.1 g·L-1 MnSO4·5H2O和0.1 g·L-1 ZnSO4·7H2O)
液体无碳矿物盐培养基[17](LCFBM, 国药集团化学试剂有限公司, 分析纯): 0.7 g·L-1 KH2PO4、0.7 g·L-1 K2HPO4、0.7 g·L-1 MgSO4·7H2O、1.0 g·L-1 NH4NO3、5.0×10-3 g·L-1 NaCl、2.0×10-3 g·L-1 FeSO4·7H2O、2.0×10-3 g·L-1 ZnSO4·7H2O和1.0×10-3 g·L-1 MnSO4·H2O, 所有培养基均经过121℃的高压灭菌20 min.
1.4 实验过程首先, 将FAFU011接种到以酵母提取物作为碳源的富集培养基中, 120 r·min-1、70℃水浴摇床培养48 h, 离心收集菌体, 用生理盐水将菌体洗涤3次, 去除菌体中代谢物和培养基, 再将菌体用生理盐水进行重悬, 制成浓度为1×105 cells·mL-1的菌悬液.取2 mL的菌悬液接种到含有100.0 mg PS样品的LCFBM培养基中, 其中PS作为底物提供碳源, 并放置到70℃的环境中进行培养.对照组中不接种菌液其他条件相同.
设置5组与上述PS降解实验相同的平行体系, 每周对培养基中的PS进行采集并测定, 共观测8周.
1.5 实验方法 1.5.1 激光共聚焦显微镜观察采集不同时期LCFBM培养基中的PS样品, 利用Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit试剂盒(美国赛默飞世尔公司)对PS样品进行染色, 避光静置15 min后, 利用激光共聚焦显微镜(LSCM, LMS 880, 德国Carl Zeiss公司)观察PS表面生物膜上细菌的活性.
1.5.2 分子质量分析取20.0 mg PS样品, 用四氢呋喃(阿拉丁试剂上海有限公司, 分析纯)溶解, 放置到90℃的水浴中萃取12 h, 萃取液用旋转蒸发仪蒸馏至5.0 mL, 经过0.45 μm滤膜过滤后放置到凝胶渗透色谱仪[GPC, V2000, 沃特世(上海)有限公司]中测定PS的重均分子质量(Mw)和数均分子质量(Mn).
1.5.3 PS表面形貌和化学组分分析采集处理56 d后LCFBM培养基中对照组和有菌组的PS样品.将一部分的PS样品放入2.5%戊二醛溶液(阿拉丁试剂上海有限公司, 分析纯)中固定6 h, 固定完成后用0.1 mol·L-1的磷酸盐缓冲液冲洗20 min, 然后分别加入到10%、30%、50%、70%、90%和100%的乙醇中梯度脱水15 min; 经过干燥后, 将PS样品固定在导电胶上进行喷金, 利用扫描电子显微镜(SEM, Ultima Ⅳ, 日本株式会社理学公司)观察PS表面形貌的变化.另一部分PS样品放置到十二烷基磺酸钠(SDS, 阿拉丁试剂上海有限公司, 分析纯)水溶液中, 并利用超声波清洗仪(KQ-400KDE, 中国昆山市超声仪器有限公司)进行处理, 去除其表面生物膜及微生物分泌物等杂质, 经无菌水洗净烘干后, 利用水接触角测定仪(WCA, DSA30, 德国KRUSS公司)测定PS表面的疏水性能.利用X射线光电子能谱仪(XPS, ESCALAB 250, 美国VG公司)测定表面化学结构.
1.5.4 PS表面官能团分析采集处理0、14、28、32和56 d的PS样品, 用SDS水溶液去除生物膜, 洗净干燥后用傅里叶变换红外光谱仪(ATR/FTIR, iS 50 FT-IR, 美国赛默飞世尔公司)收集500~4 000 cm-1波长范围处的红外光谱, 并基于二维相关性分析(2D-COS)判断PS表面官能团随时间变化的顺序.
2 结果与讨论 2.1 PS表面生物膜观察及表面侵蚀形貌为了探究FAFU011与PS培养过程中, FAFU011的生长情况以及对PS表面形态造成的影响, 利用LSCM和SEM观察了PS表面生物膜的活性以及形貌变化.在LSCM图中[图 1(a)~1(c)], 红色代表死亡细菌, 绿色代表活体细菌.结果表明, FAFU011与PS培养的过程中, 可以利用PS作为碳源进行生长, 并在PS表面形成一层活性较高的生物膜, 且在不同时期内, 始终保持着较高的活菌数.利用SEM观察处理56 d后的PS表面形貌的变化, 结果如图 1(d)~1(f)所示, 对照组中的PS表面[图 1(d)]没有明显的菌体, 仅在局部存在少量的细纹, 这可能是由于高温导致PS发生热裂解, 从而产生的细微裂痕; 而接种FAFU011的PS表面分布着大量密集的菌体[图 1(e)], 并且原本平滑的PS表面也被侵蚀为层次分明并伴有微孔的坑洞结构[图 1(f)].LSCM和SEM的结果共同说明, FAFU011可以利用PS为碳源进行生长繁殖, 并对PS表面进行侵蚀, 致使PS表面的形貌发生改变.
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(a)处理第7 d, (b)第14 d, (c)第30 d的PS表面生物膜情况, (d)处理第56 d后对照组, (e)和(f)处理第56 d后接菌组的PS表面形貌变化 图 1 利用激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜观察不同处理时期PS表面的生物膜及形貌 Fig. 1 PS surface biofilm and morphology after different culture periods visualized by CLSM and SEM |
为了探究FAFU011对PS的降解情况, 以处理周期内PS的减重损失, 评估其降解效率.结果如图 2(a)所示, 在56 d的处理周期内, PS的降解程度随着时间的延长而增加, 对照组中的PS样品有1.0%的质量下降, 这可能是由于70℃的高温环境所引起的; 接种FAFU011的PS样品有4.2%的质量下降, 相比对照组增加了3.2%, 表明FAFU011可以促进PS的降解.这个结果与Kim等[28]利用昆虫肠道内分离的1株假单胞菌降解PS的效率类似.利用GPC进一步分析FAFU011对PS解聚性能的影响[18], 结果如图 2(b)所示.所制备原始PS的Mw和Mn为254 000和125 000, 经过高温处理后, 对照组中PS的Mw和Mn为248 500和118 300, 分别下降2.2%和5.4%.这种现象的产生, 是由于高温造成了PS长链分子热裂解成为低分子物质导致的, 同时也解释了SEM观察对照组中PS表面产生少量裂痕的原因.而经FAFU011处理后PS的Mw和Mn为209 700和101 600, 与原始PS相比, Mw和Mn分别下降17.4%和18.2%, 与对照组相比, Mw和Mn分别下降14.1%和15.6%.重均分子质量和数均分子质量的下降进一步表明, FAFU011对PS具有解聚或裂解的作用, 可以将PS分子的长链结构变为低分子质量的短链结构, 进而致使PS发生降解.
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a)质量下降曲线, (b)重均分子质量和数均分子质量的变化; mean±SD，n=5 图 2 FAFU011对PS质量和分子质量的影响 Fig. 2 Change in the dry weight and average molecular weight of PS by FAFU011 |
PS表面的疏水性能是决定微生物定殖及可生物降解性的关键因素[29, 30].为了探究FAFU011处理PS过程中对表面疏水性能的影响, 进行了水接触角测试, 结果如图 3(a)所示.将PS表面生物膜及杂质完全去除后, FAFU011处理后的PS表面水接触角为(72.7±0.7)°(n=3), 低于对照组的水接触角(84.3±0.9)°(n=3), 表明FAFU011具有改变PS表面的疏水性的能力, 增加其亲水性, 从而为微生物的定殖提供了更有利的环境, 有助于提高PS的生物降解性[17, 28, 31].这和Kin等[28]利用昆虫肠道微生物降解PS, 导致其水接触角降低的研究结果类似.
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(a)PS表面水接触角的变化, (b)和(c)PS表面的XPS谱图 图 3 对照组与接种FAFU011对PS表面化学结构的影响 Fig. 3 WCA of PS the uninoculated control incubation and inoculated incubation surface and XPS spectra |
为了探究FAFU011对PS表面化学结构的影响, 利用XPS分析了PS表面的化学组分, 结果如图 3(b)所示.对照组PS样品在280.8 eV位置上的C1s峰较为强烈, 而在532.3 eV位置上的O1s峰比较微弱.进一步对PS的C1s峰分析, 结果如图 3(c)所示, 在284.8 eV和286.2 eV的位置, 分别代表PS分子长链结构中的C—C键和C—O键[17, 26, 28].经过FAFU011处理后, O1s峰强度明显增加, 而C1s峰强度降低.对C1s进行分析表明, 在288.2 eV的位置产生了一个新的C＝O键[26].另外, 被FAFU011处理后PS的O/C比值为0.21, 远大于对照组0.07, C—O键和C＝O键的相对峰面积也大于对照组(表 1).以上研究结果表明, FAFU011处理PS的过程中, 具有改变PS化学结构的能力, 增加PS表面的含氧结构, 这也是PS表面水接触角降低的主要原因.
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表 1 PS表面化学成分的O/C比和C 1s中各峰的相对面积 Table 1 O/C atomic ratios and relative C 1s peak areas of PS surface chemical composition |
为了进一步研究FAFU011处理PS的过程中, 对其表面官能团的影响, 利用ATR/FTIR光谱测定了不同处理时期PS表面官能团的变化情况, 结果如图 4(a)所示.PS的主要官能团集中在1 800~500 cm-1区域, 其特征峰在1 601、1 491、1 450、1 366、1 068和1 027 cm-1附近产生明显的振动.其中, 1 601 cm-1处代表PS分子苯环上C＝C结构, 1 491 cm-1和1 450 cm-1处均代表PS分子中的C—H结构, 1 366、1 068和1 027 cm-1处分别代表PS分子中C—OH结构、C＝O结构和C—O结构[1, 29, 32].其中, C—H结构随着FAFU011处理PS的时间延长峰强不断增加, 这可能是由于FAFU011会破坏PS分子中的苯环, 使其断裂为C—H结构或从PS分子主链上脱落而导致的[18, 32, 33].当FAFU011处理PS至14 d的时候, 在1 366 cm-1的位置新增一个代表C—OH结构的特征峰, 并且随着处理时间的延长峰强不断增加.这种现象的产生, 说明C—OH结构可能是由FAFU011降解PS产生的次生结构.而1 068 cm-1处C＝O结构的峰强增加, 则表明PS的降解过程可能是氧化过程, 且产物可能为类羟基化合物[17].这些结果表明FAFU011处理PS的过程, 会改变PS表面的结构, 增加C—O、C＝O和C—OH含氧官能团.而这些含氧官能团为亲水基团, 也是导致PS表面亲水性增强的原因, 从而促使PS更容易被FAFU011所定殖, 并通过微生物代谢持续对PS进行生物氧化降解[26, 28].
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(a)不同处理时期PS的红外光谱, (b)同步谱图, (c)异步谱图; 在同步和异步谱图中, 红色代表正相关、蓝色代表负相关, 颜色越深所代表官能团强度越高 图 4 FAFU011处理PS不同时期的红外光谱和二维相关性分析 Fig. 4 PS of ATR/FTIR spectrum and 2D-COS spectrum |
基于2D-COS分析, 对FAFU011处理PS过程中官能团随时间的变化顺序进行了探究.同步光谱代表两个动态红外信号之间的协同程度, 结果如图 4(b)所示.在Φ(V1, V2)为(1 601 cm-1, 1 601 cm-1)、(1 491 cm-1, 1 491 cm-1)、(1 450 cm-1, 1 450 cm-1)、(1 366 cm-1, 1 366 cm-1)、(1 068 cm-1, 1 068 cm-1)和(1 027 cm-1, 1 027 cm-1)处存在6个自相关峰, 表明谱带强度变化方向一致, 且它们所代表的官能团为C＝C、C—H、C—H、C—OH、C＝O和C—O, 均是随着时间的增加而同步进行变化[31].其中, 在C＝C和C—H的强度变化较大, 这可能是在处理过程中PS分子中苯环的断裂或含有苯环的小分子从PS分子链上脱离导致的[18, 32, 33].而异步光谱图[图 4(c)]可以揭示PS在降解过程中官能团特定的化学变化顺序, 当交叉峰ψ(V1, V2)＞0时, 表明V1发生变化的顺序位于V2之前, 而当ψ(V1, V2)＜0, 则V1发生变化的顺序位于V2之后[32].如表 2所示, ψ(1 027 cm-1, 1 601 cm-1)和(1 068 cm-1, 1 601 cm-1)为负交叉峰, 意味着1 601 cm-1处的官能团变化先于1027 cm-1和1 068 cm-1处的官能团, ψ(1 491 cm-1/1 450 cm-1, 1 601 cm-1)为正交叉峰, 意味着1 491 cm-1和1 450 cm-1处的官能团变化先于1 601 cm-1处的官能团.因此, PS在FAUF011的处理过程中, 官能团变化的先后顺序为: 1 491 cm-1(C—H)＞1 450 cm-1 (C—H)＞1 601 cm-1(C＝C)＞1 027 cm-1(C—O)＞1 068 cm-1(C＝O)＞1 366 cm-1(C—OH).综上所述, 基于XPS、ATR/FTIR等技术手段分析, 证实FAFU011对PS具有降解作用, 并通过2D-COS可以推测, FAFU011在处理PS的过程中, 由于微生物的作用首先促使PS苯环上的C—H和C＝C结构发生解聚或断裂, 将PS分子变为低分子质量物质, 然后通过生物氧化作用, 增加PS表面C—O键、C＝O键以及C—OH等含氧结构, 从而提高PS表面的亲水性, 使其更有利于微生物的定殖, 提高PS的生物可降解性[34, 35].
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表 2 二维相关性分析同步(Φ)和异步(ψ)谱图上交叉峰的位置和符号1) Table 2 The 2D-COS results on the assignment and sign of each cross-peak in synchronous (Φ) and asynchronous (ψ) maps |
3 结论
本研究结果表明, 嗜热菌Geobacillus stearothermophilus FAFU011能够利用PS作为碳源生长, 并在PS表面形成活性较高的生物膜; 经过56 d的处理过程, FAFU011对PS的降解率为4.2%, 使PS的重均分子质量和数均分子质量分别降低17.4%和18.2%; 通过水接触角、XPS和ATR/FTIR光谱进一步分析表明, FAFU011对PS的结构具有较强的作用, 增加PS表面C—O和C＝O等含氧结构, 以至于提高PS表面的亲水性能, 从而更有利于微生物的定殖, 提高PS的生物氧化降解性.
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