2021, Vol. 42
2. 内蒙古大学内蒙古自治区环境污染控制与废物资源化重点实验室, 呼和浩特 010021
, ZHANG Qiu-ping1 , ZHU Tian-jiao1 , QIN Shuai1 , ZHU Wen-bo1 , PANG Xiao-ke1 , ZHAO Ji1,2
2. Inner Mongolia Key Laboratory of Environmental Pollution Control and Waste Resource Recycle, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China
随着集约化养殖规模的扩大, 畜禽粪便的产量日益增多, 随之而来的抗生素抗性问题受到广泛关注[1~4].抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)是抗生素抗性传播的重要物质, 可在不同种类微生物间水平转移, 从而对环境造成污染, 甚至对人类健康产生威胁[5~7].畜禽粪便中的ARGs是环境中ARGs的主要来源之一, 养殖场周边空气、土壤、甚至河流中均检出ARGs[8~10].最大限度地降低畜禽粪便中ARGs的丰度, 可减缓ARGs带来的生态风险.
厌氧消化是处理畜禽粪便的主要方式之一, 可将粪便转化为沼气及肥料, 也是削减ARGs的有效手段之一[11, 12].已有研究表明厌氧消化对ARGs的去除效果与微生物群落密切相关[13~17].温度是厌氧消化系统的重要工艺参数, 可通过改变微生物群落影响产沼气性能[18, 19].作为厌氧消化系统中的另一重要工艺参数, 搅拌可影响传质和传热效率, 并影响微生物群落分布[20, 21].因此, 温度和搅拌可能作用于微生物群落且产生交互作用, 从而影响厌氧消化对ARGs的削减作用.
目前, 温度和搅拌及二者交互作用对厌氧消化系统中ARGs的影响不甚清楚.本文以大规模奶牛场粪便中的ARGs为研究对象, 开展不同温度和不同搅拌速率的厌氧消化试验, 主要研究温度和搅拌对ARGs和可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)丰度以及微生物群落的影响, 分析理化因子、ARGs、MGEs以及微生物群落之间的互作关系, 提出有利于削减ARGs的厌氧消化工艺运行参数.
1 材料与方法 1.1 试验材料新鲜牛粪取自内蒙古一大规模奶牛场, 固液分离后, 将固体自然风干加入至液体中调节固含率为8%, 作为厌氧消化原料.调节后的原料pH值为6.76, 可溶性化学需氧量(soluble chemical oxygen demand, SCOD)为8 575.00 mg·L-1, 总氨氮(total ammonia nitrogen, TAN)浓度为531.55 mg·L-1, 总挥发酸(total volatile fatty acids, TVFAs)浓度为3 960.49 mg·L-1.
1.2 试验设置厌氧消化反应器为有效容积1 000 mL的厌氧瓶, 瓶塞设有采样口和出气口各一个, 出气口连接排水集气装置.向每个反应器中加入400 mL固含率为8%的消化原料, 盖上瓶塞, 从采样口通入氮气5 min营造厌氧环境, 随后迅速关闭采样口并连接出气口与排水集气装置, 置于恒温水浴锅.共设置4组处理, 分别在35℃和55℃下设定搅拌速率0和200 r·min-1, 依次记为M0、M1、T0和T1, 详情见表 1, 每个处理3个平行.
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表 1 不同厌氧消化处理参数设置 Table 1 Operational parameters of anaerobic digestion |
1.3 样品采集及理化指标的测定
记录每个反应器每24 h的产气量, 并用沼气分析仪(MRU Optima7, 德国)测定沼气中甲烷含量.厌氧消化反应运行结束后, 混匀消化产物并测定固含率, 重复3次; 另采取每个反应器中的样品1 mL于离心管内, 重复3次, 4℃、12 000 r·min-1的条件下离心5 min, 上清液用于理化性质的测定, 沉淀物用于提取DNA.
总固体含量(total solids, TS)采用105℃烘干法测定; SCOD采用重铬酸钾分光光度法测定; TAN浓度采用纳氏试剂分光光度法测定; pH值采用多功能pH计(雷磁S-3E, 上海)测定; TVFAs采用比色法测定.
1.4 DNA提取及荧光定量PCR利用粪便基因组DNA提取试剂盒(天根DP-328, 北京)提取每毫升样品沉淀物的DNA, 按照说明书操作.提取出的DNA用超微量紫外分光光度计(Nanodrop-2000, 美国)检测浓度及纯度, 用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性.在Bio-Rad CFX96 system中对7个ARGs(tetA、tetC、tetG、tetO、tetQ、tetT和tetX)、3个MGEs(intI1、intI2和Tn916/1545)和总细菌数(16S rRNA)进行定量分析, 具体引物信息参考文献[22, 23]. qPCR反应体系(20 μL): 10 μL 2×SG Fast qPCR Master Mix, 0.5 μL正反向引物(10 μmol·L-1), 1 μL DNA模板, 8 μL无菌无酶水.反应条件: 95℃预变性3 min; 95℃变性3 s, 退火温度30 s, 72℃延伸30 s, 共40个循环.
1.5 高通量测序将提取的DNA送至上海派森诺生物公司, 利用Illumina NovaSeq平台进行16S rRNA高通量测序, 测序区域为V3~V4区, 引物为338F(ACTCCTACG GGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTW TCTAAT).原始序列经质控后得到高质量序列, 并在SILVA 16S rRNA数据库进行比对.
1.6 数据分析本试验数据采用Microsoft Excel软件进行整理, SPSS 22.0进行单因素方差分析、双因素方差分析及Pearson相关性分析, CANOCO 4.5软件进行冗余分析, Cytoscape 3.6.0进行网络分析, Origin Pro 9.0和R 3.2.5作图.
2 结果与讨论 2.1 厌氧消化性能厌氧消化的产气曲线如图 1所示, 反应后期产气稳定, 微生物量达到稳定状态, 35℃和55℃厌氧消化分别在第45 d和第30 d时日产气量小于反应体积的5%(即20 mL), 此时可视为消化结束.以日产气量代表厌氧消化产气速率[图 1(a)], 35℃条件下产气集中在第6~30 d, 而55℃条件下产气集中在第3~16 d, 且前10 d的产气速率远高于35℃, 说明高温加快了厌氧消化反应进程, 缩短了整个周期[22].M0、M1、T0和T1的最大产气速率分别为223、340、703和720 mL·d-1.T0和T1的最大产气速率分别是M0和M1的3.15倍和2.12倍, 证明高温可显著(P < 0.01)提高产气速率.分别比较M0与M1和T0与T1, 发现相较M0而言, M1显著(P < 0.01)提高了最大产气速率, 而T0与T1之间最大产气速率无显著差异.由此说明中温条件下搅拌可显著提高厌氧消化产气速率, 而高温条件下搅拌则对产气速率无明显影响.消化后总产气量如图 1(b)所示, M0、M1、T0和T1的总产气量分别为5 120、5 767、5 833和5 933 mL.由双因素方差分析可知温度和搅拌对总产气量均具有显著影响(P < 0.001).其中, 温度的影响(η2=0.934)大于搅拌(η2=0.911)及二者交互作用(η2=0.845).T0和T1总产气量分别较M0和M1增加了13.93%和2.88%, 证明高温条件可促进产气, 与Lin等[24]的研究结果一致.35℃条件下搅拌可促进产沼气, M1总产气量较M0显著(P < 0.01)增加12.63%.而T0与T1之间总产气量无显著差异, 表明二者交互作用弱于单独作用.这是因为中温条件下搅拌可促进物料的水解, 从而增加了微生物对有机物的利用率[25], 而高温本身可提高有机物利用率, 此温度条件下搅拌对总产气量的影响可忽略不计.4组处理甲烷含量均为50%左右, 无显著差异, 总产甲烷量则与总产气量规律一致.
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M0、M1、T0和T1分别代表中温不搅拌、中温搅拌、高温不搅拌和高温搅拌处理 图 1 厌氧消化过程产气速率及总产气量 Fig. 1 Biogas production rate and total biogas yield in anaerobic digestion |
消化结束后理化因子见表 2.35℃和55℃条件下的TS分别小于7%和大于7%, 其中M0与M1及T0与T1之间无明显差异.消化结束后SCOD浓度降低了34.99%~63.17%, 其中高温条件和搅拌处理的SCOD浓度均高于中温条件和未搅拌处理, 证明高温和搅拌可促进有机质的水解[25], 这也进一步解释了高温和搅拌可提高总产气量.TVFAs浓度在消化结束后也降低, 但4组处理间几乎无显著差异, 只有T1的浓度显著(P < 0.01)低于其他3组.TAN浓度从初始的531.55 mg·L-1升高至866.26~953.92 mg·L-1, 4组之间无显著差异.消化结束后4组处理的pH值均接近中性.
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表 2 厌氧消化后理化因子 Table 2 Physicochemical parameters after anaerobic digestion |
2.2 ARGs与MGEs丰度变化
消化原料中共检测到7种ARGs, 包括外排泵基因tetC和tetG, 核糖体保护蛋白基因tetO、tetQ和tetT, 以及转座酶基因tetX.其中tetQ的绝对丰度最高, 为7.45×109 copies·mL-1, 可能是tetQ在奶牛病原菌之间可频繁转移[23].TetC的绝对丰度最低, 为2.33×106 copies·mL-1.
以16S rRNA为管家基因, ARGs与16S rRNA绝对丰度的比值作为ARGs的相对丰度.经厌氧消化后, M0~T1中ARGs的总相对丰度分别为0.177、0.309、0.019和0.020[图 2(a)].由双因素方差分析结果可知, 温度、搅拌以及二者交互作用对ARGs总相对丰度具有显著影响(P < 0.001).与产气结果相似, 温度对ARGs总相对丰度的影响(η2=0.992)大于搅拌(η2=0.920)及二者交互作用(η2=0.917), T0和T1产物中总相对丰度显著低于M0和M1, 表明高温条件更有利于ARGs的去除, 与Sun等[26]的研究结果一致.将消化产物中每个基因相对丰度的对数值与其消化原料中相对丰度的对数值作差, 得到各基因相对丰度的变化量(对数值), 结果如图 2(b)所示.7种ARGs在T0和T1中的去除量为0.09~1.53(对数值), 高于M0和M1中的去除量0.02~0.68(对数值), 进一步证明高温可促进ARGs的去除.搅拌也可促进部分ARGs的去除, 例如, tetA和tetG的相对丰度在M0中分别增加了0.07和0.43(对数值), 而在M1中则分别降低了0.11和0.19(对数值).TetC和tetO的相对丰度在M1中也显著(P < 0.01)低于M0.与T0相比, T1中tetC、tetT和tetX的相对丰度较低.由以上分析可知, 搅拌对ARGs的影响在不同的温度条件下略有差异.搅拌在中温条件下可显著促进tetA、tetC和tetG的去除, 在高温条件下则促进了tetC、tetT和tetX的去除.有研究表明中温厌氧消化搅拌速率越高, tetM和tetO的去除效果越好[27], 高温条件下搅拌对ARGs的影响还未有报道.
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D0代表消化前,M0、M1、T0和T1分别代表中温不搅拌、中温搅拌、高温不搅拌和高温搅拌处理 图 2 厌氧消化前后ARGs和MGEs的相对丰度及其变化 Fig. 2 Relative abundances and changes of ARGs and MGEs before and after anaerobic digestion |
消化原料中3种MGEs的总相对丰度为0.006, 经厌氧消化后只有M1中升高至0.178, 其他3组处理均下降[图 2(c)].厌氧消化后3种MGEs相对丰度对数值的变化如图 2(d)所示.M0中intI1和intI2的相对丰度分别降低了0.72和0.67(对数值), Tn916/1545的相对丰度几乎无变化.相比之下, T0使得intI2相对丰度降低了1.81(对数值), intI1和Tn916/1545的相对丰度变化与M0无明显差异.M1较M0显著(P < 0.01)增加了整合子intI1和intI2的相对丰度, 而T1则是较T0显著(P < 0.01)降低了Tn916/1545的相对丰度.由此可见, 高温可促进厌氧消化对intI2的去除, 搅拌则抑制了中温厌氧消化对intI1和intI2的去除, 促进了高温厌氧消化对Tn916/1545的去除.
为了进一步对比温度和搅拌哪种条件对ARGs和MGEs去除的影响更大, 分别研究中温(M0和M1)和高温(T0和T1)、未搅拌(M0和T0)和搅拌(M1和T1)之间各基因相对丰度的差异.如图 3所示, 图中样点代表各ARGs和MGEs在消化结束后的相对丰度, 箱形内横线代表每种条件下基因相对丰度的中值.与初始相比, 只有高温和未搅拌条件下的中值减小, 说明这两种条件有利于厌氧消化对ARGs的去除.中温条件下的中值为0.002, 比高温条件下的中值高出7倍之多, 表明高温更有利于ARGs和MGEs的去除.与未搅拌对比, 搅拌条件下的中值略高, 为0.001, 表明搅拌在一定程度上削弱了ARGs和MGEs的去除效果.整体来看, 中温和高温条件之间ARGs相对丰度差异显著(P < 0.05), 而未搅拌和搅拌之间则不显著, 进一步证明温度比搅拌对ARGs和MGEs去除的影响更大.从此角度考虑, 高温不搅拌的厌氧消化工艺更有利于ARGs的去除.
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*表示P<0.05的显著差异,ns表示无显著差异 图 3 不同条件厌氧消化后ARGs和MGEs相对丰度 Fig. 3 Relative abundances of ARGs and MGEs after anaerobic digestion under different conditions |
厌氧消化前后门水平微生物(前15)丰度变化如图 4所示.消化原料中, 有4种优势菌门, 总丰度占群落结构的94.56%, 分别为Proteobacteria(39.03%)、Bacteroidetes(26.56%)、Firmicutes(23.58%)和Spirochaetes(5.39%).厌氧消化结束后, 微生物群落结构发生了明显变化, 且不同处理中变化具有差异.M0中Firmicutes、Bacteroidetes和Spirochaetes的丰度分别增加至33.40%、40.26%和15.42%, Proteobacteria的丰度则降低至1%以下.而T0中这4种门水平微生物只有Firmicutes丰度升高至86.58%, 其他均下降至3%以下.Firmicutes是参与降解纤维素产挥发酸的主要微生物[28], 55℃条件下Firmicutes丰度远高于35℃, 这解释了高温促进产气的现象.Wu等[29]的研究发现高温条件下Firmicutes的相对丰度降低, 这可能是因为与本文厌氧消化原料不同导致的.与M0相比, M1中Bacteroidetes和Proteobacteria丰度分别从40.26%和0.91%升高至52.49%和7.47%, Spirochaetes丰度从15.42%下降至2.66%.Bacteroidetes也是参与产H2和CO2的主要微生物[28], 35℃条件下搅拌增加了Bacteroidetes的丰度, 从而解释了中温条件下搅拌促进产气的现象.55℃条件下未搅拌与搅拌处理微生物相对丰度差异较小, 说明搅拌对微生物的影响小于温度.
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D0代表消化前,M0、M1、T0和T1分别代表中温不搅拌、中温搅拌、高温不搅拌和高温搅拌处理 图 4 厌氧消化门水平微生物群落 Fig. 4 Microbial relative abundances in anaerobic digestion at the phylum level |
以厌氧消化前后属水平微生物丰度的对数值作热图, 如图 5所示.消化原料中Pseudomonas、Sphaerochaeta、Oscillospira和Paludibacter丰度较高, 为优势属, 经消化结束后优势属发生变化.35℃消化产物中相对丰度较高的属包括Syntrophomonas、Sphaerochaeta、Clostridium、vadinCA02和Sedimentibacter等; 55℃消化产物中相对丰度较高的属则少于35℃, 包括Clostridium、Caldicoprobacter和SHD-231等.另外, 中温条件下搅拌改变了一些属水平的相对丰度.M1中Pseudomonas的相对丰度为2.30%, M0中此属完全消失; M1使得Sedimentibacter、Advenella和Acholeplasma的相对丰度从0.83%、0.01%和0.08%增加至2.91%、2.87%和3.11%.T0~T1之间的属水平微生物相对丰度较为接近.
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D0代表消化前,M0、M1、T0和T1分别代表中温不搅拌、中温搅拌、高温不搅拌和高温搅拌处理 图 5 厌氧消化属水平微生物群落 Fig. 5 Microbial relative abundances in anaerobic digestion at the genus level |
选取每个样本中相对丰度大于1%的属, 共11个属, 与ARGs及MGEs作网络分析, 结果如图 6(a)所示, 找到8个属为ARGs和MGEs的潜在宿主菌, 其在各处理之间丰度影响了ARGs的丰度.Ma等[17]的研究表明Trichococcus、Acinetobacter和Tissierella等12个属为tetM、tetW和intI1等的潜在宿主, 这些属的相对丰度与ARGs的变化规律一致.本文中tetG有4个宿主菌Sphaerochaeta、Treponema、Syntrophomonas和vadinCA02, 其在M0中丰度最高, 也反映了tetG在此条件下相对丰度最高.TetO和intI1有一个共同宿主菌Pseudomonas, intI1在各处理之间的分布可能间接影响tetO的分布.Sedimentibacter为tetQ和tetX的潜在宿主菌, 另外tetX和intI2共享3个潜在宿主菌Sedimentibacter、Acholeplasma和Advenella, 这些属的相对丰度在M1中最高, 这也代表tetQ和tetX在此条件下丰度增加.为了进一步探究影响不同处理中微生物分布的因子, 采用理化因子与微生物间冗余分析, 结果见图 6(b). RDA1和RDA2的共同解释量为99.2%, 表明理化因子较大程度影响了4组处理间的微生物分布.其中, TAN的解释量最高, 占总解释量的57%.而且TAN和TVFAs与大多数ARGs的宿主菌Sedimentibacter、Acholeplasma、Advenella和Pseudomonas等呈正相关关系, 由此证明本研究中TAN和TVFAs通过影响微生物从而影响ARGs的变化, 与Zhang等[30]的研究结果一致.
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(a)网络分析; (b)冗余分析; 空心箭头表示理化因子,实心箭头表示属水平微生物 图 6 理化因子、ARGs、MGEs以及微生物群落间互作关系 Fig. 6 Interactions among physicochemical parameters, ARGs, MGEs, and microbial communities |
(1) 温度和搅拌对厌氧消化特性均有影响, 高温和搅拌可以促进有机质水解, 提高SCOD浓度, 从而提升总产气量和总甲烷量.与搅拌相比, 温度对厌氧消化特性影响更为显著.
(2) 高温可显著提高7种ARGs和intI2的去除率, 搅拌在不同温度条件下对ARGs影响不同.整体来看, 温度比搅拌对ARGs和MGEs去除的影响更显著, 高温不搅拌的厌氧消化工艺有利于ARGs的去除.
(3) 微生物群落受温度影响更明显.高温条件下优势菌门种类减少, Firmicutes变为绝对优势菌门.中温条件下搅拌可增加Bacteroidetes的丰度, 而在高温条件下未搅拌与搅拌的微生物群落无显著差异.
(4) Sedimentibacter、Pseudomonas和Spharochaeta等为ARGs的潜在宿主菌, 其在不同条件下的丰度直接影响了厌氧消化对ARGs的处理效果.TAN和TVFAs通过影响宿主菌的丰度, 从而间接影响了不同条件下ARGs的相对丰度.
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