环境科学  2021, Vol. 42 Issue (6): 2981-2991   PDF    
引用本文
张俊华, 陈睿华, 刘吉利, 尚天浩, 沈聪. 宁夏养牛场粪污和周边土壤中抗生素及抗生素抗性基因分布特征[J]. 环境科学, 2021, 42(6): 2981-2991.
ZHANG Jun-hua, CHEN Rui-hua, LIU Ji-li, SHANG Tian-hao, SHEN Cong. Distribution Characteristics of Antibiotics and Antibiotic Resistance Genes in Manure and Surrounding Soil of Cattle Farms in Ningxia[J]. Environmental Science, 2021, 42(6): 2981-2991.
宁夏养牛场粪污和周边土壤中抗生素及抗生素抗性基因分布特征
张俊华1, 陈睿华2, 刘吉利1, 尚天浩2, 沈聪3     
1. 宁夏大学生态环境学院, 银川 750021;
2. 宁夏大学地理科学与规划学院, 银川 750021;
3. 宁夏大学生命科学学院, 银川 750021
收稿日期: 2020-11-09; 修订日期: 2020-12-02
基金项目: 宁夏自治区重点研发项目（2019BFG02015）
作者简介: 张俊华(1977~), 女, 博士, 研究员, 博士生导师, 主要研究方向为土壤质量提升及微生物资源开发与利用, E-mail: zhangjunhua728@163.com
通信作者: 刘吉利, E-mail: 18295172155@163.com
摘要: 畜禽粪便是抗生素和抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，ARGs）重要的储存库.为揭示宁夏肉牛养殖场牛粪和养殖场周边土壤中抗生素及ARGs的分布特征，采用超高效液相色谱-串联质谱法和高通量荧光定量法对不同规模的养牛场进行调查研究.结果表明：①牛粪中优势抗生素为四环素类、喹诺酮类和磺胺类.不同养殖期牛粪中抗生素含量差异显著；育肥前期和哺乳期抗生素含量较高，犊牛期相反.②土壤中以喹诺酮类和四环素类抗生素为主，喹诺酮类抗生素检出率和含量都最高.养殖场对周边土壤中抗生素的分布无影响；施用牛粪的土壤中喹诺酮类和四环素类抗生素含量显著增加.③牛粪中共检测到ARGs亚型79~142种，其中氨基糖苷类ARGs数目最多.育成期ARGs数目最多且相对丰度最高，犊牛期相反.所有养殖期牛粪中共存ARGs是tetQ、ermF和tetO-01.④土壤中ARGs亚型有35~79种，主要是多药类和氨基糖苷类ARGs.养殖场对周边土壤中ARGs的数目和相对丰度无影响；施用牛粪的土壤中ARGs数目和相对丰度都显著高于其他土壤.⑤磺胺类和氯霉素类ARGs在牛粪和土壤中都有水平移动的风险.牛粪中氨基糖苷类和四环素类ARGs相对丰度与其对应抗生素含量呈极显著相关.⑥对牛粪和土壤中各类ARGs相对丰度而言，氨基糖苷类与磺胺类和氯霉素类、可移动遗传元件（mobile genetic elements，MGEs）与氨基糖苷类和磺胺类均呈显著或极显著正相关，而大环内酯类与万古霉素类则呈显著负相关.本研究结果可为肉牛不同养殖期抗生素的使用和牛粪施用等提供理论依据.
关键词: 抗生素      抗生素抗性基因(ARGs)      可移动遗传元件(MGEs)      牛粪      养殖期      土壤     
Distribution Characteristics of Antibiotics and Antibiotic Resistance Genes in Manure and Surrounding Soil of Cattle Farms in Ningxia
ZHANG Jun-hua1 , CHEN Rui-hua2 , LIU Ji-li1 , SHANG Tian-hao2 , SHEN Cong3     
1. School of Ecology and Environment, Ningxia University, Yinchuan 750021, China;
2. School of Geography and Planning, Ningxia University, Yinchuan 750021, China;
3. School of Life Sciences, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
Abstract: Livestock breeding intensively uses veterinary antibiotics in concentrated feeding operations to improve growth and control disease. Consequently, livestock and poultry manure is an important repository of antibiotics and antibiotic resistance genes (ARGs). To understanding the distribution of antibiotics and ARGs in manure and surrounding soils of cattle farms in Ningxia, cattle manure from five breeding periods (lactation, calving, growing, pre-fattening, and post-fattening periods) and comparative soil samples were collected from the largest beef-breeding area in Ningxia. The compositions of ARGs in the samples were analyzed by UPLC-MS/MS and HT-qPCR. The results showed that: ① Tetracycline, quinolone, and sulfonamide were the dominant antibiotics in cattle manure. The content of antibiotics in the manure varied greatly between different breeding periods. High amounts of antibiotics were detected during the pre-fattening and lactation periods, and the lowest amounts were detected during the calving period. ② Quinolone and tetracycline were the dominant antibiotics in the soils, and the detection rate and content of quinolone were highest. The cattle farms did not affect the distribution of antibiotics in the surrounding soils. The content of quinolone and tetracycline in the soils with cattle manure application were significantly higher than control and surrounding soils. ③ We detected 79-142 ARGs in cattle manure, with aminoglycosides the most common form. The number and relative abundance of ARGs were highest during the growing period and lowest during the calving period. The dominant ARGs were tetQ, ermF, and tetO-01 across all the breeding periods. ④ There were 35-79 ARGs in the tested soils, and multidrug and aminoglycoside ARGs were dominant. The cattle farms did not affect the number and relative abundance of ARGs in the surrounding soils; however, manure application significantly affected the number and relative abundance of ARGs. ⑤ Sulfonamide and chloramphenicol ARGs are at risk of mobilization and horizontal transport. A correlation analysis showed that the relative abundances of aminoglycoside and tetracycline in cattle manure were significantly positively correlated with their contents. ⑥ Aminoglycoside, sulfonamide, chloramphenicol, and mobile genetic elements (MGEs) in manure were significantly or extremely significantly positively correlated with aminoglycosides and sulfonamides in the soils, whereas macrolides were negatively correlated with vancomycin. These results provide baseline data to inform controls on the variety and dosages of feed and veterinary drugs in cattle farms and the application of organic fertilizers in agriculture.
Key words: antibiotic      antibiotic resistance genes(ARGs)      mobile genetic elements(MGEs)      cattle manure      breeding periods      soils     

作为20世纪最重要的发现之一, 抗生素曾挽救了无数生命.如今却由于过量使用和滥用, 细菌耐药性不断进化、增强, 甚至出现了能耐受几乎所有抗生素的“超级细菌”, 从而使受感染人群面临死亡的风险[1].世界卫生组织已将ARGs作为21世纪威胁人类健康的最重大挑战之一[2].中国是抗生素生产和消费大国, 其中52%为兽用抗生素[3], 这些兽用抗生素有30%~90%不能被动物完全吸收, 而是以母体化合物的形式随粪便排出体外[4].据英国抗生素耐药评估委员会预测, 如果目前抗生素滥用的情况得不到改善, 到2050年中国将有100万人因耐药菌感染而死亡[5].

Heuer等[6]的研究指出, 抗生素抗药性通过农业传播对人类健康的影响可能大于医院传播.养殖粪便已成为抗生素和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)重要的储存库, 如不加以处理控制, ARGs便会随着农用进一步污染土壤等环境介质, 并有可能通过直接或间接途径进入食物链和人体, 危害人类公共健康[4].畜禽养殖涉及的抗生素种类主要有磺胺类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类、β-内酰胺类、氨基糖苷类和林可酰胺类等[7, 8].猪、鸡和其他粪便内普遍检测到高水平的抗生素[9, 10].在动物粪便中, 由于代谢物再转化回母体化合物, 抗生素的浓度非常稳定, 甚至会增加[11].猪口服14C标记磺胺嘧啶10 d后, 连续4 d 96%以上的药物作为母体化合物或代谢物排出体外[12], 二氟沙星和磺胺嘧啶都有类似的研究结果[13].不同类型或相同类型不同地区的畜禽粪便中抗生素种类和浓度差异可能较大[8~11].

ARGs通常位于质粒、转座子和整合子等可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)上, 通过基因水平转移在菌群间迁移, 引起抗生素耐药菌的扩散, 甚至可能转移到人类共生微生物和病原体中[14, 15].澳大利亚某养殖场鸡粪、牛粪和猪粪中分别检出127、109和136种ARGs, 3种粪便中共存86种[16].加拿大某奶牛场牛粪中发现114种ARGs, 其中大环内酯-林可酰胺-链阳菌素B类、四环素类、氨基糖苷类、多药类和β-内酰胺类ARGs分别有28、21、19、18和16种[17].国内某大型猪场粪肥中检测到149种ARGs, 与不使用抗生素的粪肥相比, 这些基因的含量增加了192~28 000倍[18].由于这些粪便通常被农民用作肥料, 所以粪肥中的抗生素和ARGs及相关的环境风险是全球关注的焦点[19].Karci等[20]的研究指出, 农业土壤中抗生素和AGRs含量因重复施用粪肥而增加.农田中大量兽用抗生素和生物活性代谢物可持续存在数月至数年[21].长期施用粪肥一般都会增加土壤中抗生素含量, 但随着土壤深度的增加, 抗生素和ARGs含量普遍降低[22].在猪场周围的环礁湖和土壤中, 抗生素含量和ARGs相对丰度之间具有显著相关性[19].也有研究表明, 抗生素含量并不直接影响ARGs的传播[23].目前, 关于畜禽重要养殖期粪便中抗生素和ARGs的分布特征研究较少, 养殖场的存在对周边土壤抗生素和ARGs的影响也没有一致结论.

肉牛养殖是宁夏南部山区的支柱产业之一.宁夏肉牛养殖场粪污中抗生素和ARGs处于何种水平？哪个养殖期粪污中抗生素及ARGs水平最高？养殖场的存在对周边土壤抗生素和ARGs有多大影响？施用牛粪后土壤中抗生素和ARGs分布有无显著变化？为了回答以上问题, 本文系统研究了不同养殖期牛粪中抗生素种类和含量及ARGs相对丰度状况, 明确了养殖场周边及施用牛粪的土壤中抗生素和ARGs分布特征, 以期为当地肉牛养殖场兽药抗生素种类的选择、用量及相关有机肥的科学施用提供依据.

1 材料与方法 1.1 样品采集及处理

宁夏固原市西吉县是目前全区肉牛存栏量最大的县市.本研究在该县选取规模不同的肉牛养殖场10家(具体情况见表 1)[24].同一家养殖场相同养殖时间视为同一个处理, 相同处理取多点(同一圈舍采集3份样品)充分混合为一个样, 所有养牛场共采集新鲜粪污样品(牛粪)27个.为便于分析, 根据肉牛生长期将牛粪样品分为5个时期: 哺乳期(0~2个月, C1)、犊牛期(2~6个月, C2)、育成期(6~12个月, C3)、育肥前期(12~18个月, C4)和育肥后期(18个月以上, C5).

表 1 样本基本信息 Table 1 Basic information of samples

为研究养殖场对周边土壤抗生素和ARGs的影响, 选择其中两家规模较大的养牛场(表 1中序号为3和4), 在距离养牛场西侧20、50、100、200和300 m处分别采集0~20 cm土壤作为养牛场周边土壤样品(D1、D2、D3、D4和D5).同时, 在各养殖场院内采集施用了牛粪的农用地土壤表层样品14个(AC).此外, 在远离所有养殖场5 km的荒地上采集对照土壤样品3个(CK).土样均采用五点取样法, 每个样品约1.0 kg.

采集的牛粪和土壤样品冷冻于-80℃冰箱用于抗生素和ARGs的测定.

1.2 抗生素检测

采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS), 对牛粪和土壤中的氨基糖苷类(林可霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素)、四环素类(土霉素、金霉素、四环素、强力霉素)、喹诺酮类(诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星)、磺胺类(磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺甲唑、磺胺二甲氧嘧啶)、大环内酯类(红霉素、泰乐霉素、罗红霉素)和β-内酰胺类6大类共21种抗生素进行检测.

1.2.1 提取

称取1.0 g样品于15 mL离心管中, 加入EDTA-Mcllvaine缓冲溶液∶乙腈＝5∶5(pH≈4.9)10 mL提取, 然后置于超声波清洗器中超声20 min, 4 000 r·min-1条件下离心10 min后收集上清液, 重复提取2次, 第3次提取液为5 mL, 合并3次的提取液.准确量取5 mL混合提取液, 氮吹至约2.5 mL(移除乙腈), 用蒸馏水补足至5 mL, 待净化.

1.2.2 净化

HLB固相萃取柱依次用甲醇3 mL、水3 mL和EDTA-Mcllvaine缓冲溶液3 mL活化, 准确移取备用液5 mL过柱, 水3 mL淋洗, 抽干.用甲醇5 mL洗脱, 收集洗脱液, 于40℃下氮气吹干.准确加入50%甲醇溶液1 mL溶解残余物, 混匀后过微孔滤膜过滤, 供液相色谱-串联质谱仪测定.

液相色谱-串联质谱法检测抗生素的检测条件和检出限等详细信息见文献[25].

1.3 DNA提取

使用FastDNA®Spin Kit for soil(MP Biomedical, Santa Ana, California, USA)试剂盒提取样品微生物基因组, 按说明书操作步骤进行.分别用琼脂糖凝胶和NanoDrop ND-1000(Nanodrop, USA)检验DNA纯度和浓度.

1.4 抗生素抗性基因的高通量荧光检测

采用Wafergen SmartChip实时荧光定量PCR系统完成, 该系统可用于大规模基因表达研究.共使用296对引物集, 包括295个几乎针对所有大类的ARGs、MGEs和1个16S rRNA基因.在95℃初始酶活化10 min后, 95℃变性30 s, 60℃退火30 s, 共40个循环; 融化过程由wafergen软件自动生成.然后用qPCR软件对结果进行分析, 剔除多峰或扩增效率超过90%~110%的样品.根据系统的灵敏度和精确度, 确定循环次数CT值为31时作为仪器的检测限.阳性样品同时有3个复制的条件下进行筛选, 计算相对拷贝数.所有浓度≥10 ng·μL-1的样本16S rRNA内参基因全部检出, NTC无扩增[26].相对丰度计算如下:

式中, CT表示高通量荧光定量所测定的循环阈值.

1.5 数据分析

采用Excel 2010分析不同处理中抗生素和ARGs的组成特征, 利用R语言绘制热图和韦恩图.

2 结果与讨论 2.1 牛粪和土壤中抗生素种类和含量 2.1.1 不同养殖期牛粪中抗生素种类和含量

检测结果显示, 整个养殖期牛粪中优势抗生素为四环素类、喹诺酮类和磺胺类(表 2), 其中环丙沙星、强力霉素和土霉素的最高含量超过1 000 μg·kg-1.此外, 还有氨基糖苷类和大环内酯类, 而β-内酰胺类抗生素未检出.其中, 磺胺甲唑检出率最高(52.94%), 林可霉素、卡那霉素、新霉素、红霉素、罗红霉素、氧氟沙星和培氟沙星均未检出.四环素类和磺胺类抗生素使用广泛且在环境中具有持久性[19, 27], 是动物粪便中发现最频繁的种类[28].根据本研究实地调查, 氨基糖苷类和喹诺酮类也是当地养殖户常用的抗生素种类.Tang等[10]指出在中国北方地区, 畜禽粪便中检出率最高的抗生素是四环素类, 其次是喹诺酮类、磺胺类和大环内酯类, 与本研究结果略有不同.

表 2 牛粪中抗生素含量 Table 2 Contents of antibiotics in cattle manure

不同养殖期牛粪中抗生素种类和含量差异都较大(表 3): 哺乳期四环素类抗生素含量较高(平均402.19 μg·kg-1), 其中强力霉素含量高达1 198 μg·kg-1.犊牛期抗生素种类最少且平均含量最低.育成期抗生素种类较多, 只有β-内酰胺类未检出.育肥前期抗生素种类与育成期相同, 但环丙沙星含量高达1 694 μg·kg-1, 其他抗生素含量普遍低于育成期.育肥后期抗生素含量都较低.哺乳期牛粪中抗生素含量较高可能是出于防病和促生长等目的, 在畜禽幼龄期大剂量使用多种抗生素, 而动物长成后抵抗力增加, 需要的抗生素较少[29].统计结果显示, 不同养殖期各种抗生素含量差异较大, 这是由于每个养殖场肉牛健康状况不同, 养殖户给牛使用的抗生素的量也大不相同.值得注意的是, 肉牛养殖中后期牛粪中环丙沙星含量较高.该抗生素具有抗菌谱广、半衰期长、药物快速发展的特点[30], 但在农业土壤中矿化率极低, 生物难降解且易吸附[31].所以建议养殖户尽量少用或不用环丙沙星, 而用青霉素类药物来替代.

表 3 不同养殖期牛粪中抗生素含量含量/μg·kg-1 Table 3 Contents of antibiotics in cattle manure during different breeding periods/μg·kg-1

2.1.2 养殖场周边及施用牛粪的土壤中抗生素种类和含量

所有供试土壤中共检测到4大类抗生素(表 4), 以喹诺酮类和四环素类抗生素为主, 其中喹诺酮类检出率(22.7%)和含量(平均为4.14 μg·kg-1)都最高, 氨基糖苷类和磺胺类检出率和含量都很低, 大环内酯类和β-内酰胺类均未检出.距养殖场50 m处土壤中检出4种抗生素, 其中四环素和诺氟沙星的含量都超过1.0 μg·kg-1, 其他距离处土壤中抗生素种类和含量都很低.土壤中抗生素种类和含量并没有随距离养殖场的远近而呈现出规律性分布.孔晨晨等[32]选取了我国北部典型农副产品生产基地, 发现抗生素含量与距养殖场距离呈显著负相关, 与本研究结论不同.这可能是由于本研究区养牛场牛粪收集都采用干清粪方式, 不用水冲洗, 且该地区降雨量低, 所以抗生素随水流失转移到养殖场周边的可能性大大减小, 此外养牛场多建在相对偏僻、荒凉的地方, 土壤本底污染少, 所以短期内养殖场并未影响周边土壤抗生素分布.

表 4 养殖场周边和施用牛粪的土壤中抗生素含量/μg·kg-1 Table 4 Contents of antibiotics in soils around farms and with cattle manure application/μg·kg-1

施用牛粪的土壤中检测到喹诺酮类、四环素类和磺胺类抗生素, 其中喹诺酮类抗生素含量最高, 平均为27.63 μg·kg-1, 四环素、强力霉素和磺胺嘧啶含量在1~10 μg·kg-1之间.所以施用牛粪会显著提高土壤中喹诺酮类和四环素类抗生素的含量.由于土壤中检测到的抗生素含量整体较低, 所以各处理检测值的差异相对也较小.

2.2 牛粪和土壤中抗生素抗性基因多样性 2.2.1 不同养殖期牛粪中抗生素抗性基因多样性

肉牛不同养殖期粪便中共检测到抗生素ARGs亚型79~142种, 其中相对丰度大于0.000 5的有11~64种, 主要隶属于氨基糖苷类(22.6%)[图 1(a)]、四环素类(20.3%)、多药类(18.4%)和大环内酯类(12.3%), MGEs占比为10.4%.所有牛粪中检测到的喹诺酮类ARGs亚型只有qnrA, 但相对丰度均小于5×10-4, 故下文中均未出现.由MGEs导致的ARGs的水平转移是造成ARGs污染广泛、严重且日益恶化的主要原因, 所以MGEs是导致耐药基因在细菌间水平转移重要的指示基因[2].本研究牛粪中MGEs种类多于β-内酰胺类、磺胺类、氯霉素类和万古霉素类ARGs, 因此也有造成ARGs污染的风险.

图 1 牛粪及养殖场周边土壤中抗生素抗性基因种类 Fig. 1 Variety of antibiotic resistance genes in cattle manure and soil

整体来看, 牛粪中氨基糖苷类ARGs数目最多, 其次为四环素类和多药类, 万古霉素类最少[图 2(a)].除犊牛期外, 其他4个养殖期牛粪中都有9类ARGs.育成期ARGs数目最多(64个), 哺乳期次之(60个), 犊牛期最少(11个).牛粪中ARGs平均相对丰度由高到低分别为: 四环素类、氨基糖苷类、多药类、大环内酯类、β-内酰胺类、磺胺类、氯霉素类、其他和万古霉素类[图 2(b)].育成期各类ARGs丰度最高; 哺乳期虽然ARGs数目较多, 但相对丰度居5个养殖期中间; 犊牛期ARGs相对丰度最低, 只有四环素类、β-内酰胺类和多药类3类ARGs及MGEs.

图 2 不同养殖期牛粪中抗生素抗性基因与可移动元件的数目及相对丰度 Fig. 2 Number and relative abundance of ARGs and MGEs in cattle manure during different breeding periods

2.2.2 养牛场周边及施用牛粪的土壤中抗生素抗性基因多样性

供试土壤中共检测到ARGs亚型35~79种, 其中丰度大于0.000 5的亚型有2~13种, 主要由多药类(25.6%)、氨基糖苷类(17.9%)、大环内酯类(12.8%)和磺胺类(10.3%)ARGs组成[图 1(b)].距离养殖场50 m处的土壤中ARGs数目相对较多[图 3(a)], 300 m处土壤最少.施用了牛粪的土壤中ARGs种类和数目都显著高于其他土壤.从相对丰度的角度看[图 3(b)], 施用了牛粪的土壤中ARGs相对丰度分别比对照土壤和养殖场周边土壤平均增加了5.40倍和1.56倍.结果表明施用粪肥后土壤中ARGs种类和数量都显著增加, 与前人的研究结果基本一致[33, 34].

图 3 养殖场周边及施用牛粪的土壤中抗性基因与可移动元件的数目及相对丰度 Fig. 3 Number and relative abundance of ARGs and MGEs in soil around cattle farms and with cattle manure application

2.3 牛粪和土壤中抗生素抗性基因组成 2.3.1 不同养殖期牛粪中抗生素抗性基因组成

哺乳期牛粪中相对丰度较高的有四环素类tetO-01、tet(32)和tetQ、氨基糖苷类aadA-02、aadA-01、大环内酯类ermF和ermB等ARGs(图 4).犊牛期四环素类tetQ、tetO-01、β-内酰胺类cfxA和MGEs Tp614相对丰度较高.育成期ARGs和MGEs种类最多且相对丰度也较高.育肥前期丰度较高的有β-内酰胺类cfxA和bacA-02、四环素类tetQ、tetO-01和tetX、大环内酯类ermF和mefA, MGEs Tp614和tnpA-05相对丰度也较高.育肥后期主要有β-内酰胺类cfxA、大环内酯类mefA和ermF、四环素类tetQ、tetX和tetO-01, MGEs主要是Tp614.

图 4 不同养殖期牛粪中抗生素抗性基因与可移动元件的相对丰度 Fig. 4 Relative abundances of ARGs and MGEs in cattle manure during different breeding periods

整个养殖期牛粪中共存ARGs有3个[图 5(a)], 分别是tetQ、ermF和tetO-01.此外, aadA-02、aadA-01、strB、cfxA、mefA及Tp614存在也较普遍.其中tetQ是家畜体内最丰富的四环素类抗性基因, 通常与共轭转座子有关[18].

图 5 牛粪及养殖场周边土壤中抗生素抗性基因韦恩图 Fig. 5 Venn diagram of antibiotic resistance genes in cattle manure and soils around cattle farms

2.3.2 养牛场周边及施用牛粪的土壤中抗生素抗性基因组成

在对照土壤、距养牛场20、100和300 m处(图 6), 所有ARGs相对丰度都小于0.1, 其他2个距离处丰度较高且常见的有sul2、acrA-04和acrA-05.有研究表明, 禽畜养殖场周围土壤ARGs丰度较于正常土壤显著偏高, 抗性基因污染严重[34], 与本研究的结论不一致.原因与养殖场周边土壤中抗生素种类少且含量低这一现象相同.施用牛粪的土壤中相对丰度较高的亚型有sul2、cmx(A)、aadA2-03、oprD和tnpA-04及整合子intI-1(clinic).Ⅰ类整合子(integron genes I, intI-1)是细胞内获得ARGs的活动基因元件, 是最早被发现的整合子, 与革兰氏阴性致病菌有密切联系, 广泛存在于畜禽粪便等各种环境介质中[18].施用了牛粪的土壤中intI-1(clinic)丰度较高, 说明该类土壤中ARGs横向转移的可能性更大[2].有研究发现在施用了猪粪的水稻土中转座子基因丰度是未施猪粪土壤的15.5倍[34], 表明转座子类基因在施用猪粪土壤中富集, 与本研究的结论相似.因此, 本研究区土壤施用牛粪也需要注意土壤中ARGs富集问题.由于养殖场周边土壤中ARGs普遍较少, 故所有供试土壤只有一个共存ARGs亚型[图 5(b)], 即磺胺类sul2.

图 6 土壤中抗生素抗性基因与可移动元件的相对丰度 Fig. 6 Relative abundances of ARGs and MGEs in different soils

2.4 牛粪及土壤中抗生素抗性机制

深入了解与抗生素耐药性相关基因的机制和调控, 将有助于开发克服耐药性的抗生素衍生物[35].从牛粪中抗生素抗性机制来看, 抗生素失活、细胞保护和细胞外排泵是其主要的抗性机制, 但不同养殖期各抗性机制的占比不同[图 7(a)].犊牛期没有细胞外排泵机制, 细胞保护机制占67%; 其他4个养殖期则都具有4种抗性机制, 但未知机制占比最小.由于抗生素失活酶可将胞内抗生素转换为低活性产物, 因此是微生物适应抗生素选择压力的最有效方式之一, 比如氨基糖苷类抗生素[36].外排泵机制则可介导抗生素和重金属等多种污染物排出细胞外, 因而也是微生物适应环境胁迫条件的主要途径[37].所以新鲜牛粪中的ARGs有污染环境的条件和可能.

(a)牛粪; (b)土壤 图 7 牛粪和土壤中抗生素抗性机制分析 Fig. 7 Mechanism analysis of antibiotic resistance in manure and soil

供试土壤中抗生素抗性机制差异较大[图 7(b)]: 对照土壤中有4种抗性机制, 而养殖场周边不同距离的土壤和施用牛粪的土壤中均无未知机制, 在距离100 m和200 m的土壤中只有细胞保护和细胞外排泵2种抗性机制, 而距离养殖场300 m的土壤中只有细胞外排泵1种抗性机制.整体来看, 施用牛粪的土壤中细胞失活和外排泵机制占比较大.能量驱动的药物外排系统越来越被认为是抗生素抗药性的机制[38].目前, 抗生素的耐药性发展很快, 以单一机制或酶为靶点的抗生素导致细胞死亡, 但对多个目标或机制起作用的抗生素, 杀死微生物的耐药性发展相对较慢[1].所以本研究土壤中抗生素的耐药性发展较慢.

2.5 牛粪和土壤中抗性基因与可移动元件的相关性

为研究牛粪中ARGs水平转移的风险, 采用Pearson法分析了ARGs与MGEs的相关性(表 5): 磺胺类ARGs与MGEs相关性最强, 其次为氯霉素类和氨基糖苷类ARGs, 都达到极显著正相关水平; ARGs相对丰度总和与MGEs呈极显著正相关.说明牛粪中磺胺类、氯霉素类、氨基糖苷类ARGs都存在水平移动风险, 进一步说明了MGEs可能会加快这些ARGs在土壤环境的迁移、传播和富集[14].

表 5 牛粪和土壤中抗生素抗性基因与可移动元件的相关性1) Table 5 Correlation analysis between ARGs and MGEs in manure and soil

土壤中MGEs与各类ARGs的相关性与牛粪差异较大: 与氨基糖苷类ARGs呈极显著正相关关系, 与氯霉素类、其他类ARGs呈显著正相关.表明氨基糖苷类和氯霉素类抗生素在土壤中有水平移动的风险.梅花鹿养殖环境氨基糖苷类、大环内酯类、其它类和四环素类抗生素分别与MGEs都具有极显著的正相关关系[39], 与本研究结论既有相同之处, 也有不同之处, 这主要和土壤类型、抗生素种类、来源、微生物和气候等因素有关[4].

2.6 牛粪中抗生素浓度与抗生素抗性基因丰度间的相关性

整个养殖期牛粪中氨基糖苷类、四环素类、β-内酰胺类、大环内酯类和磺胺类抗生素含量与对应ARGs相对丰度的相关系数依次为: 0.868、0.939、0.555、0.450和0.537, 说明氨基糖苷类和四环素类ARGs与其抗生素浓度分别呈显著和极显著正相关关系, 其他种类抗生素与其ARGs间关系未达显著水平.大量研究表明, 抗生素浓度和ARGs之间有显著的相关性[4, 15, 19].

由于土壤中检测到的抗生素种类很少且浓度较低, 故本文没有做土壤中抗生素含量与ARGs相对丰度的相关分析.

2.7 牛粪和土壤中抗性基因相对丰度之间的相关性

牛粪中氨基糖苷类ARGs相对丰度与磺胺类(表 6)、氯霉素类和MGEs, 大环内酯类ARGs与多药类, 磺胺类ARGs与氯霉素类和MGEs, 氯霉素类ARGs与MGEs, 万古霉素类与多药类和MGEs均极显著正相关关系; 大环内酯类与万古霉素类则呈显著负相关.四环素类、β-内酰胺ARGs相对丰度与其他种类ARGs均不相关.

表 6 牛粪和土壤中抗生素抗性基因间的相关性 Table 6 Correlation analysis between ARGs and ARGs in cattle manure and soil

供试土壤中氨基糖苷类ARGs相对丰度与磺胺类、氯霉素类、MGEs之间, 磺胺类与MGEs之间, 氯霉素类与MGEs间均呈显著或极显著正相关关系(表 6), 而大环内酯类和万古霉素类呈显著负相关, 其他ARGs相对丰度间均无相关性.相对而言, 土壤中各类ARGs之间的相关性明显弱于牛粪中, 可能是因为土壤环境比牛粪更复杂.

整体来讲, 牛粪和土壤2种生境中氨基糖苷类ARGs与磺胺类和氯霉素类之间、MGEs与氨基糖苷类和磺胺类之间均呈显著或极显著相关, 而大环内酯类与万古霉素类则呈显著负相关.

3 结论

(1) 整个养殖期牛粪中优势抗生素为四环素类、喹诺酮类和磺胺类, 其中环丙沙星、强力霉素和土霉素含量较高.育肥前期和哺乳期牛粪中抗生素含量较高.

(2) 养殖场的存在对周边土壤中抗生素质量、种类和浓度无影响.施用牛粪会显著提高土壤中喹诺酮类和四环素类抗生素的含量.

(3) 牛粪中氨基糖苷类抗性基因数目最多.育成期抗性基因数目最多且相对丰度最高, 犊牛期数目最少且相对丰度最低.

(4) 供试土壤中ARGs主要是多药类、氨基糖苷类、大环内酯类和磺胺类.施用了牛粪的土壤中ARGs数目和相对丰度都显著高于其他土壤.

(5) 抗生素失活、细胞保护和细胞外排泵机制是牛粪中ARGs主要的抗性机制, 但不同养殖期各抗性机制的占比不同.施用牛粪的土壤中细胞失活和外排泵机制占比较大.

(6) 牛粪中磺胺类、氯霉素类、氨基糖苷类ARGs都存在水平移动风险; 土壤中氨基糖苷类和氯霉素类ARGs有水平移动的风险.牛粪中氨基糖苷类和四环素类ARGs与其抗生素含量分别呈显著和极显著正相关关系.

(7) 牛粪和土壤中氨基糖苷类ARGs相对丰度与磺胺类和氯霉素类相对丰度之间、MGEs相对丰度与氨基糖苷类和磺胺类相对丰度之间均呈显著或极显著相关, 而大环内酯类与万古霉素类相对丰度则呈显著负相关.

参考文献
[1] Hashmi M Z, Mahmood A, Kattel D B, et al. Antibiotics and antibiotic resistance genes (ARGs) in soil: occurrence, fate, and effects[A]. Hashmi M Z, Kumar V, Varma A (Eds. ). Xenobiotics in the Soil Environment[M]. Cham: Springer, 2017.
[2] 支苏丽, 周婧, 赵润, 等. 畜禽粪便厌氧发酵过程抗生素抗性基因归趋及驱动因子分析[J]. 农业工程学报, 2019, 35(1): 195-205.
Zhi S L, Zhou J, Zhao R, et al. Analysis of antibiotic resistance genes fate and its drivers during anaerobic digestion of animal manure[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2019, 35(1): 195-205.
[3] Zhang Q Q, Ying G G, Pan C G, et al. Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China: source analysis, multimedia modeling, and linkage to bacterial resistance[J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49(11): 6772-6782.
[4] 苑学霞, 梁京芸, 范丽霞, 等. 粪肥施用土壤抗生素抗性基因来源、转移及影响因素[J]. 土壤学报, 2020, 57(1): 36-47.
Yuan X X, Liang J Y, Fan L X, et al. Effects of manure application on source and transport of antibiotic resistant genes in soil and their affecting factors[J]. Acta Pedologica Sinica, 2020, 57(1): 36-47.
[5] 张彤, 李炳. 水环境中抗生素耐药性的科学研究前沿、环境健康风险评估和控制阻断策略[J]. 科学通报, 2020, 65(24): 2543-2554.
Zhang T, Li B. Antibiotic resistance in water environment: frontiers of fundamental research, risk assessment and control strategies[J]. Chinese Science Bulletin, 2020, 65(24): 2543-2554.
[6] Heuer H, Solehati Q, Zimmerling U, et al. Accumulation of sulfonamide resistance genes in arable soils due to repeated application of manure containing sulfadiazine[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(7): 2527-2530. DOI:10.1128/AEM.02577-10
[7] Zhang A N, Li L G, Ma L P, et al. Conserved phylogenetic distribution and limited antibiotic resistance of class 1 integrons revealed by assessing the bacterial genome and plasmid collection[J]. Microbiome, 2018, 6. DOI:10.1186/s40168-018-0516-2
[8] 朱为静, 朱凤香, 王卫平, 等. 4种粪便堆肥过程中抗生素的降解特性[J]. 环境科学, 2020, 41(2): 1005-1012.
Zhu W J, Zhu F X, Wang W P, et al. Degradation characteristics of antibiotics during composting of four types of feces[J]. Environmental Science, 2020, 41(2): 1005-1012.
[9] Zhao L, Dong Y H, Wang H. Residues of veterinary antibiotics in manures from feedlot livestock in eight provinces of China[J]. Science of the Total Environment, 2010, 408(5): 1069-1075. DOI:10.1016/j.scitotenv.2009.11.014
[10] Tang X J, Lou C L, Wang S X, et al. Effects of long-term manure applications on the occurrence of antibiotics and antibiotic resistance genes (ARGs) in paddy soils: evidence from four field experiments in south of China[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2015, 90: 179-187. DOI:10.1016/j.soilbio.2015.07.027
[11] Jechalke S, Heuer H, Siemens J, et al. Fate and effects of veterinary antibiotics in soil[J]. Trends in Microbiology, 2014, 22(9): 536-545. DOI:10.1016/j.tim.2014.05.005
[12] Heuer H, Focks A, Lamshöft M, et al. Fate of sulfadiazine administered to pigs and its quantitative effect on the dynamics of bacterial resistance genes in manure and manured soil[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2008, 40(7): 1892-1900. DOI:10.1016/j.soilbio.2008.03.014
[13] Sukul P, Lamshöft M, Kusari S, et al. Metabolism and excretion kinetics of 14C-labeled and non-labeled difloxacin in pigs after oral administration, and antimicrobial activity of manure containing difloxacin and its metabolites[J]. Environmental Research, 2009, 109(3): 225-231. DOI:10.1016/j.envres.2008.12.007
[14] Forsberg K J, Reyes A, Wang B, et al. The shared antibiotic resistome of soil bacteria and human pathogens[J]. Science, 2012, 337(6098): 1107-1111. DOI:10.1126/science.1220761
[15] 张汝凤, 宋渊, 高浩泽, 等. 北京蔬菜地土壤中抗生素抗性基因与可移动元件的分布特征[J]. 环境科学, 2020, 41(1): 385-393.
Zhang R F, Song Y, Gao H Z, et al. Distribution characteristics of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements in Beijing vegetable base soils[J]. Environmental Science, 2020, 41(1): 385-393.
[16] Zhang Y J, Hu H W, Gou M, et al. Temporal succession of soil antibiotic resistance genes following application of swine, cattle and poultry manures spiked with or without antibiotics[J]. Environmental Pollution, 2017, 231: 1621-1632. DOI:10.1016/j.envpol.2017.09.074
[17] Gou M, Hu H W, Zhang Y J, et al. Aerobic composting reduces antibiotic resistance genes in cattle manure and the resistome dissemination in agricultural soils[J]. Science of the Total Environment, 2018, 612: 1300-1310. DOI:10.1016/j.scitotenv.2017.09.028
[18] Zhu Y G, Johnson T A, Su J Q, et al. Diverse and abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110(9): 3435-3440. DOI:10.1073/pnas.1222743110
[19] Cheng W X, Chen H, Su C, et al. Abundance and persistence of antibiotic resistance genes in livestock farms: a comprehensive investigation in eastern China[J]. Environment International, 2013, 61: 1-7. DOI:10.1016/j.envint.2013.08.023
[20] KarcƖ A, BalcƖoğlu I A. Investigation of the tetracycline, sulfonamide, and fluoroquinolone antimicrobial compounds in animal manure and agricultural soils in Turkey[J]. Science of the Total Environment, 2009, 407(16): 4652-4664. DOI:10.1016/j.scitotenv.2009.04.047
[21] Du L F, Liu W K. Occurrence, fate, and ecotoxicity of antibiotics in agro-ecosystems. A review[J]. Agronomy for Sustainable Development, 2012, 32(2): 309-327.[J]. Agronomy for Sustainable Development, 2012, 32(2): 309-327. DOI:10.1007/s13593-011-0062-9
[22] Sarmah A K, Meyer M T, Boxall A B A. A global perspective on the use, sales, exposure pathways, occurrence, fate and effects of veterinary antibiotics (VAs) in the environment[J]. Chemosphere, 2006, 65(5): 725-759. DOI:10.1016/j.chemosphere.2006.03.026
[23] 周海东, 黄丽萍, 陈晓萌, 等. 人工生态系统对城市河流中抗生素和ARGs的去除[J]. 环境科学, 2021, 42(2): 850-859.
Zhou H D, Huang L P, Chen X M, et al. Removal of antibiotics and antibiotic resistance genes from urban rivers by artificial ecosystem[J]. Environmental Science, 2021, 42(2): 850-859.
[24] 张俊华, 尚天浩, 刘吉利, 等. 宁夏西吉县养牛场粪污和周边土壤重金属及细菌群落特征[J]. 应用生态学报, 2020, 31(9): 3119-3130.
Zhang J H, Shang T H, Liu J L, et al. Characteristics of heavy metals and bacterial community in manure and surrounding soil of cattle farm in Xiji, Ningxia, China[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2020, 31(9): 3119-3130.
[25] 陈莉, 贾春虹, 刘冰洁, 等. 超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时测定土壤中四环素类抗生素及其降解产物[J]. 地学前缘, 2019, 26(6): 1-6.
Chen L, Jia C H, Liu B J, et al. Determination of tetracyclines and their degradation products in soil using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Earth Science Frontiers, 2019, 26(6): 1-6.
[26] Chen Q L, An X L, Li H, et al. Long-term field application of sewage sludge increases the abundance of antibiotic resistance genes in soil[J]. Environment International, 2016, 92-93: 1-10. DOI:10.1016/j.envint.2016.03.026
[27] Gao P P, Mao D Q, Luo Y, et al. Occurrence of sulfonamide and tetracycline-resistant bacteria and resistance genes in aquaculture environment[J]. Water Research, 2012, 46(7): 2355-2364. DOI:10.1016/j.watres.2012.02.004
[28] McKinney C W, Loftin K A, Meyer M T, et al. Tet and sul antibiotic resistance genes in livestock lagoons of various operation type, configuration, and antibiotic occurrence[J]. Environmental Science & Technology, 2010, 44(16): 6102-6109.
[29] 纪春晓. 多抗性猪源大肠杆菌的部分耐药性基因分析[D]. 长沙: 湖南农业大学, 2007.
Ji C X. Analysis on some resistant genes of Escherichia coli with multiple drug resistance[D]. Changsha: Hunan Agricultural University, 2007.
[30] Alonso J J S, El Kori N, Melián-Martel N, et al. Removal of ciprofloxacin from seawater by reverse osmosis[J]. Journal of Environmental Management, 2018, 217: 337-345.
[31] Andriamalala A, Vieublé-Gonod L, Dumeny V, et al. Fate of sulfamethoxazole, its main metabolite N-ac-sulfamethoxazole and ciprofloxacin in agricultural soils amended or not by organic waste products[J]. Chemosphere, 2018, 191: 607-615. DOI:10.1016/j.chemosphere.2017.10.093
[32] 孔晨晨, 张世文, 聂超甲, 等. 农用地土壤抗生素组成特征与积累规律[J]. 环境科学, 2019, 40(4): 1981-1989.
Kong C C, Zhang S W, Nie C J, et al. Composition, characteristics, and accumulation of antibiotics in the soil in agricultural land[J]. Environmental Science, 2019, 40(4): 1981-1989.
[33] Engelhardt I, Sittig S, Šimůnek J, et al. Fate of the antibiotic sulfadiazine in natural soils: experimental and numerical investigations[J]. Journal of Contaminant Hydrology, 2015, 177-178: 30-42. DOI:10.1016/j.jconhyd.2015.02.006
[34] 黄福义, 李虎, 韦蓓, 等. 长期施用猪粪水稻土抗生素抗性基因污染研究[J]. 环境科学, 2014, 35(10): 3869-3873.
Huang F Y, Li H, Wei B, et al. Long-term manure application induced shift of diversity and abundance of antibiotic resistance genes in paddy soil[J]. Environmental Science, 2014, 35(10): 3869-3873.
[35] Thaker M, Spanogiannopoulos P, Wright G D. The tetracycline resistome[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2010, 67(3): 419-431. DOI:10.1007/s00018-009-0172-6
[36] Zhang X X, Zhang T, Fang H H P. Antibiotic resistance genes in water environment[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 82(3): 397-414. DOI:10.1007/s00253-008-1829-z
[37] 程建华, 唐翔宇, 刘琛. 紫色土丘陵区畜禽养殖场土壤中抗生素抗性基因分布特征[J]. 环境科学, 2019, 40(7): 3257-3262.
Cheng J H, Tang X Y, Liu C. Characteristics of antibiotic resistance genes in various livestock feedlot soils of the hilly purple soil region[J]. Environmental Science, 2019, 40(7): 3257-3262.
[38] Levy S B. Mechanisms for resistance in soil[J]. Science, 2006, 312(5773). DOI:10.1126/science.312.5773.529a
[39] 黄福义, 安新丽, 陈青林, 等. 梅花鹿养殖场抗生素抗性基因分布特征[J]. 环境科学, 2016, 37(11): 4402-4409.
Huang F Y, An X L, Chen Q L, et al. Distribution characteristics of antibiotic resistance genes in Sika deer farm[J]. Environmental Science, 2016, 37(11): 4402-4409.