2021, Vol. 42
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
抗生素在20世纪被人类发现并利用以来, 在医疗卫生领域能够防治相关疾病, 在畜牧水产养殖业中能够提高饲料利用率和加快动物生长, 因此在人类发展史上具有重要的里程碑意义.抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)在地球环境中属于古老的存在[1], 但人类活动(抗生素滥用、禽畜养殖、城市污水排放和人口全球迁徙等)加剧了环境中抗生素抗性的产生和传播[2], 甚至一些具有多重耐药性的“超级细菌”在全球不断出现[3, 4], 这些致病细菌可能会引发无法医治的传染病[5].因此, 抗生素抗性基因被认为是一种新型的具有微生物特点的环境污染物[3, 6].过去30a, 通过常规筛选培养方法, 全球没有发现新的抗生素[7], 部分抗生素的效用不断降低, 与此同时抗生素抗性基因在环境中的污染与传播却越来越严重, 生态环境和人类健康面临着严峻挑战.
农田土壤对保障粮食安全和生态平衡具有重要的基础性作用, 目前全球都非常关注土壤安全议题[8].有研究表明, 施用城市污泥会增加农田土壤中抗生素抗性基因丰度[9], 农田土壤施用猪粪后, 水稻和小麦叶际微生物抗生素抗性基因也会显著增加[10].同时施用污泥和有机肥也会增加玉米叶际微生物抗生素抗性基因的种类和丰度[11].土壤动物的肠道微生物也会受到有机肥的影响, 加快了抗生素抗性基因在土壤和植物叶际的传播和扩散[12, 13].另外, 污水灌溉的农田土壤, 作物摄取的抗生素及叶表具有抗性基因的微生物, 可经由食物链改变人体肠道微生物组[14].可以看出, 农作物叶际和果实的微生物组和抗生素抗性基因分布特征和驱动机制研究也成为了土壤安全和粮食安全相关研究的重要内容, 特别是抗生素抗性基因可以基于农田土壤, 通过土壤-微生物-动物-植物进行传播扩散[15~17], 突显了继续深入研究农田土壤抗生素抗性基因来源、污染状况和驱动机制的重要性.
农田土壤受到了自然环境和人为耕种活动的双重影响, 研究种植不同作物的土壤微生物抗生素抗性基因的多样性和驱动机制具有重要意义.目前针对稻田土壤中抗生素抗性基因污染研究相对比较多, 但是对不同作物种植情况的农田土壤的相关研究则相对匮乏.不同作物农田土壤抗生素抗性基因的污染特征和传播扩散机制还不甚明确.本研究基于福建省龙岩市农作物种植情况, 采集了本地区典型作物的农田土壤, 采用高通量qPCR方法, 从抗生素抗性基因谱的角度, 综合分析了种植不同作物农田土壤的抗生素抗性基因的种类组成和丰度水平, 结合相关环境因子, 探究不同作物农田土壤中抗生素抗性基因的多样性、分布特征和驱动机制, 以期为农田土壤的潜在微生物污染评估和土壤风险防控政策制定提供理论支持.
1 材料与方法 1.1 研究区域背景与样品采集研究区域位于福建省龙岩市雁石镇, 分别采集了种植柑橘、花生、水稻、甘蔗和香蕉的土壤样品(图 1), 5个采样点分布在九龙江两侧, 属于相对同质的地理小单元, 可以避免因农田土壤背景值差异过大而不利于比较研究的问题.基于网格布点法, 对每个采样点进行土壤样品采集, 每个点位采集3个重复样品.采集的新鲜土壤及时送回实验室, 一部分自然风干, 用于后续的重金属元素分析; 一部分直接放置于-20℃冰箱冻存, 用于后续的土壤微生物组DNA的提取.
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图 1 不同作物农田土壤采样点地理位置分布示意 Fig. 1 Sampling sites in different croplands |
农田土壤在实验室自然通风晾干后, 用玛瑙研钵进行充分研磨, 后用200目(保证样品的均匀度, 提高样品密度)尼龙网筛过滤得到土壤样品约20 g, 装入自封袋干燥保存.每个土壤样品称重约4g, 添加硼酸粉末进行压片制作上机土壤样品, 采用X射线荧光光谱仪(XRF, Axios mAX, PANalytical, 荷兰)测定农田土壤中的Ag、As、Cd、Co、Cr、Cu、Mo、Ni、Pb和Zn等重(类)金属元素含量.
1.3 农田土壤微生物组DNA提取将实验室保存的农田土壤样品, 室温解冻后, 精确称取重约0.5 g的土样, 选用FastDNA spin kit for soil(MP Biomedcals, 美国)试剂盒, 按照说明书的标准流程方法提取农田土壤微生物组总DNA, DNA洗脱体积统一为100 μL, 提取所得DNA样品存储在-80℃冰箱超低温冻存.
1.4 常规定量PCR与高通量定量PCR细菌16S rRNA基因的常规定量PCR扩增分析是使用LightCyclerRR 480 SYBRRR Ⅰ Master试剂(Roche Diagnostics, 美国)在LightCyclerRR 480 Ⅱ荧光定量PCR仪(Roche Diagnostics Ltd., 瑞士)上进行.用于做标准曲线的16S rRNA质粒初始浓度为1.5×1010 copies·μL-1, 浓度变化范围为103~109 copies·μL-1.常规定量PCR反应体系为20 μL, 其中包括10 μL的SYBRRR Ⅰ Master试剂, 7 μL的PCR级超纯水, 上、下游引物各1 μL, 农田土壤DNA样品1 μL.
高通量qPCR(HT-qPCR)系统平台是日本TaKaRa集团公司旗下的SmartChip Real-Time PCR Systems, 选择的目标基因、PCR反应条件和数据初筛参考文献[18].该HT-qPCR平台单孔PCR反应体积为100 nL, 最大通量为5 184个PCR, 具有样品组合灵活、平均成本低和通量高的优势.HT-qPCR反应结束后, 自动进行熔解曲线分析, 获得PCR效率介于1.85~2.15的有效Ct值.
1.5 数据统计与分析HT-qPCR得到的16S rRNA基因Ct值, 计算其相应的拷贝数(丰度), 与常规定量PCR的16S rRNA基因丰度结合分析, 得到农田土壤中各抗生素抗性基因的绝对丰度[18].HT-qPCR的数据通过Microsoft公司的Excel 2019计算整理, 采用IBM SPSS 22.0进行显著性和普通相关性分析, 采用OriginPro 9.1进行直方图等的作图, 采用R 4.0.1软件版本进行了热图分析(pheatmap)和环境因子冗余分析(redundancy analysis, RDA).
2 结果与分析 2.1 不同作物农田土壤抗生素抗性基因多样性不同作物农田土壤总共检测出187种抗生素抗性基因, 11种可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs), MGEs包含有8个转座子基因和3个整合子基因(图 2).各个不同作物的农田土壤平均检测出139种抗生素抗性基因, 种植柑橘(GJ)的土壤最少, 为89种, 种植香蕉(XJ)的土壤最多, 为159种.检测出可移动遗传元件的数量范围为4~9种, 其中种植甘蔗(GZ)和香蕉(XJ)的都检测到了9种可移动遗传元件.农田土壤中, 抗生素抗性基因类型比较多样, 主要有多重耐药类抗性基因(multidrug, 22.73%)、四环素类抗性基因(tetracycline, 16.55%)、β-内酰胺类抗性基因(β-lactam, 15.83%)、MLSB类抗性基因(MLSB, 14.96%)、氨基糖苷类抗性基因(aminoglycoside, 13.81%)、万古霉素类抗性基因(vancomycin, 8.35%)、FCA类抗性基因(FCA, 3.60%)、磺胺类抗性基因(sulfonamide, 2.45%)和其它类抗性基因(others, 1.73%).
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图 2 不同作物农田土壤抗生素抗性基因和可移动遗传元件的种类分布 Fig. 2 Number of ARGs and MGEs in different croplands |
对土壤中抗生素抗性基因的丰度水平进行分析(图 3), 结果表明不同作物农田土壤抗生素抗性基因丰度的范围为6.47×109~1.41×1010 copies·g-1之间.方差分析(ANOVA)表明, 不同作物农田土壤抗生素抗性基因的丰度有显著差异(P < 0.05).5个不同农田土壤中, 种植香蕉(XJ)的农田土壤丰度最高, 为1.41×1010 copies·g-1, 种植柑橘的土壤抗性基因为最低, 为6.47×109 copies·g-1, 这与两者抗生素抗性基因种类数高低相一致; 但是种植甘蔗(GZ)的土壤抗性基因丰度为7.96×109 copies·g-1, 相对较低, 而其相应的抗生素抗性基因种类数则相对较高.此外, 种植花生(HS)和水稻(SD)的农田土壤抗生素抗性基因分别为1.10×1010和1.28×1010 copies·g-1.不同作物农田土壤中各类抗性基因丰度占据显著优势的是多重耐药抗性基因(multidrug), MLSB类和万古霉素类抗性基因(vancomycin)在农田土壤中的丰度相对其它类型抗性基因也处于比较高的水平(图 3).此外, 土壤中可移动遗传元件的丰度分布, 整体上与其抗生素抗性基因丰度相一致, 范围为1.12×107~8.43×107 copies·g-1之间, 总体比对应的农田土壤抗生素抗性基因低2~3个数量级.
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图 3 不同作物农田土壤抗生素抗性基因和可移动遗传元件的丰度 Fig. 3 Abundance of ARGs and MGEs in different croplands |
基于种植不同作物农田土壤中抗生素抗性基因的组成和丰度, 经聚类热图分析可以很好展示抗生素抗性基因的组成差异和相互关系(图 4).结果表明, 农田土壤中抗生素抗性基因根据不同的类型, 聚类成了A、B和C这3大簇, 形成了不同作物种植模式下的农田土壤抗生素抗性基因的总体分布格局.
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图 4 不同作物农田土壤抗生素抗性基因组成分布特征 Fig. 4 Patterns of ARGs in different croplands |
农田土壤中, 多重耐药内抗生素抗性的丰度(multidrug)与总体抗性基因关系最为密切(B簇), 由于其丰度在不同作物农田土壤中都是最高的, 暗示着多重耐药基因在农田土壤中的主导优势地位.而C簇, 氨基糖苷类抗性基因(aminoglycoside)、β-内酰胺类抗性基因(β-lactam)、MSLB类抗性基因、四环素类抗性基因(tetracycline)和万古霉素类(vancomycin)抗性基因这5类抗性基因的数量级差异不大, 在农田土壤抗性基因种类数最多, 各类抗性基因关系可能比较密切, 因此聚类成同一簇.A簇中的抗性基因总体丰度较低, 种类较少, 与B簇和C簇有显著差异而独自聚类成簇; A簇主要有磺胺类抗性基因(sulfonamide)和FCA类抗生素抗性基因组成, 不同作物农田土壤差异显著, 特别是种植柑橘的农田土壤(GJ)抗性基因丰度最低; 此外, 可移动遗传元件(MGEs)也聚类在此处, 暗示着在抗性基因丰度相对较低的情况下, 这三者存在一定相关关系.
2.4 农田土壤中重(类)金属元素与抗生素抗性基因的冗余分析根据《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 15618-2018), 本研究中的农田土壤中重(类)金属元素的浓度低于该标准中农用地土壤污染风险筛选值, 显示土壤质量较好. 进一步对各采样点农田土壤抗生素抗性基因与重(类)金属元素进行冗余分析(RDA), 得到在不同农作物种植模式下, 农田土壤抗生素抗性基因与As、Co、Cr、Mo、Ni和Pb这6种重(类)金属元素显著相关的结果(P < 0.05).这些重(类)金属元素对农田土壤抗生素抗性基因的多样性变化的总解释量为59.3%, 在第一轴和第二轴的解释量分别为26.75%和10.95%.图 5可以看出, 种植柑橘的农田土壤(GJ)抗生素抗性基因与As、Mo和Cr显著正相关; 种植花生(HS)、甘蔗(GZ)和香蕉(XJ)的土壤与Co和Pb元素含量显著正相关; 种植水稻的土壤与Ni含量显著正相关.因此, 重(类)金属元素对农田土壤中抗生素抗性基因赋存和演变可能有着密切关系.
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图 5 土壤重金属元素与抗生素抗性基因的冗余分析 Fig. 5 Redundancy analysis depicting the relationship between ARGs and heavy metals |
本研究采用高通量qPCR技术对农田土壤抗生素抗性基因进行了检测与定量, 用以评估不同作物种植模式下农田土壤抗生素抗性基因的多样性、分布特征和影响因素.不同作物(5种作物, 图 1)农田土壤中检出种类和丰度最高的均是多重耐药抗性基因(图 3和图 4).这可能是由于长期施用猪粪堆肥等有机肥料所造成的.有机肥和化肥的施用(不同的氮磷元素营养水平, 也可能引入各类重金属元素)对农田土壤抗生素抗性基因的赋存与演变有重要影响[11].据走访调查, 本研究中的农田土壤(除了种植柑橘土壤)在2003年以前长期使用猪粪堆肥等有机肥料, 后续慢慢转变成施用化肥为主, 种植柑橘的地块以前是次生林地, 2014年开荒为种植柑橘的果园地, 主要使用化肥.猪粪等有机肥在农田土壤中的施用是我国农业的一个显著特点, 但是有机肥施用也给农田土壤引入了多重耐药类等各类抗性基因和重金属元素[9, 19].Du等[20]的研究也发现, 种植玉米和大豆的农田土壤, 占据主导优势的也是多重耐药基因.因此不同作物的农田土壤可能都有此相似特征.多重耐药基因一般与禽畜动物肠道微生物组密切相关[21], 施用禽畜粪肥等有机肥的农业生产实践活动, 可能使得土壤微生物通过水平基因转移机制, 加快了微生物抗生素抗性基因在土壤中的增殖扩散[22], 并可能传递到作物叶际表面[12], 抗生素抗性基因在土壤-植物系统的传递给农田土壤生态系统带来了环境风险[17].多重耐药基因的存在使得很多抗生素的治疗效果大为降低, 含有多重耐药基因的微生物在环境中的增殖和扩散现象, 对人类和禽畜的健康是重要的威胁[23].此外, 不同作物根系分泌物会影响根系土壤及微生物[24], 不同作物与土壤类型的组合也会显著改变根际微生物群落结构[25], 进而影响农田土壤抗生素抗性基因的组成.
金属元素(特别是Cu和Zn)和抗生素对抗性基因的赋存和进化可能存在共选择的关系[22, 26, 27].但本研究中, Cu和Zn与不同作物农田土壤抗生素抗性基因相关关系不显著(P>0.05), 可能与土壤中这类金属元素处于极低水平有关.图 5显示, 种植柑橘土壤(GJ)与砷(As)、钼(Mo)和铬(Cr)显著正相关, 种植花生(HS)、甘蔗(GZ)和香蕉(XJ)的土壤与钴(Co)、镍(Ni)、铅(Pb)元素含量显著正相关, 种植水稻的土壤与Ni含量显著正相关.砷抗性基因和抗生素抗性基因具有共选择/共抗性的特点[22, 28], 而Co、Cr、Ni、Pb和微量元素Mo的相关研究比较少.本研究显示金属元素与抗生素抗性基因关系很密切, 可能需要根据重(类)金属元素在土壤中的转化形态与功能, 结合不同作物种植、施肥措施等对土壤的理化性质和土壤微生物群落结构的影响, 做进一步深入研究.
4 结论(1) 农田土壤是环境抗生素抗性基因的一个重要存储库, 不同作物农田土壤抗生素抗性基因的种类和丰度有显著差异, 种植不同作物的农业生产活动影响了农田土壤抗生素抗性基因的赋存和演变.
(2) 农田土壤抗生素抗性基因与砷(As)、钴(Co)、铬(Cr)、钼(Mo)、镍(Ni)和铅(Pb)这6种元素显著相关, 重(类)金属可能促进抗生素抗性基因的富集与传播, 增加了农田土壤抗生素抗性基因污染的生态风险.
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