纺织印染废水占每年产生废水的很大比例[1], 由于水资源缺乏, 再生水回用一直是研究的热点问题[2, 3].尽管印染工业废水的可生化性低, 属于难处理废水, 但是采用二段物化和生化组合工艺, 处理后废水能达到排放标准限值要求[4, 5].印染工业用水更多是就地循环、多次回用于生产[6].
在过去的几十年中, 过度使用抗菌药物加速了微生物耐药性的出现[7].作为公共卫生问题, 近年来抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)污染问题已引起越来越多的关注[8, 9].污水处理厂是ARGs的主要聚集区[10], 研究影响生物反应器ARGs发生的因素对制定适当的缓解策略非常重要.已有研究证实印染废水(printing and dyeing wastewater, PDWW)中ARGs的数均高于生活污水[11], 印染废水也是ARGs重要的人为来源之一.此外, 低剂量抗生素不能杀死细菌, 反而能够促进基因水平转移[12~15], 而印染废水生物反应器中存在的多种芳香族化合物会促进ARGs的转移.因此, 印染废水活性污泥被认为是抗生素耐药基因(ARGs)的贮存库之一[16~18], 印染废水中的ARGs成为研究的热点.但是, 印染废水循环利用过程中芳香族化合物的富集与微生物群落的变化对ARGs的影响尚不清晰.
本研究构建了印染废水循环利用系统, 采用高通量测序定量基因, 探讨3个问题: ①抗生素抗性基因在循环利用过程中的变化趋势; ②循环过程中微生物群落变化及其与抗生素抗性基因的相关性和③循环过程中芳烃污染物的富集及其与抗生素抗性基因的相关性.本研究对了解印染废水循环利用中ARGs丰度的变化及其影响因素具有指导意义.
1 材料与方法 1.1 实验装置与运行条件印染废水循环利用系统包括原水池、混凝沉淀池、水解酸化池、好氧生物池、二沉池和臭氧气浮池(图 1).其中水解酸化池和好氧生物池设计处理能力均为5m3·d-1, 24 h连续运行, 水力停留时间(HRT)分别为9 h和16 h.水解污泥和活性污泥取自浙东沿海某印染产业集聚区污水处理厂.好氧池初始污泥浓度控制在3 000 mg·L-1左右, 污泥龄控制为12 d.臭氧气浮池处理能力36 m3·d-1, PAC投加量为100 mg·L-1, 接触区混合时间60 s, 溶气比为1∶10, 分离区水力停留时间为60 min, 溶气压0.4 MPa, 回流比为40%.模拟印染废水由混合染料、助剂和营养盐组成.助剂均来自工业化产品, 与实际印染废水组成接近一致.模拟印染废水COD∶N∶P为200∶5∶1, 有助于生物处理系统正常运行.
运行分为驯化期和循环利用期.生物系统接种活性污泥后, 进入20 d驯化期, 在此阶段梯度递增印染废水中染料和助剂量, 处理出水外排.最终接种微生物已能很好适应人工模拟印染废水中的有机物和无机物, 处理出水COD为60~80mg·L-1, 色度为2~4倍; 进入循环利用实验阶段, 出水返至原水箱, 在原水箱中投加定量染料和助剂配制成模拟印染废水后, 再次进入物化和生化处理系统.初沉污泥、剩余污泥和气浮渣排放量约为0.5m3·d-1, 由此产生近10%的污水散失率, 每次配水时用工业给水将原水补足到5 m3.系统总回用比例大于90%, 运行特征为闭路循环.系统循环终止运行的评判标志为好氧池活性污泥浓度降至1 000 mg·L-1以下或SOUR值低于1 g·(mg·L)-1, 低于此值活性污泥系统净化功能处于低效水平[19].
1.2 样品采集与预处理在原水箱、水解酸化池和好氧生物池出口等5个地方布设水样采集点, 以分析不同循环时间下, 有机物沿处理流程变化规律; 生物相采用水解污泥和好氧污泥作为研究对象, 污泥采集点位为水解酸化污泥和好氧池污泥.泥样采集间隔时间均为20 d, 采集至第100 d.污泥样品采集后离心脱水, 弃去上清液, 固相于-20℃低温保存, 保存时间低于60 d. AS00、AS20、HS00和HS20分别代表好氧池运行第1 d、好氧池运行第20 d、水解酸化池运行第1 d和水解酸化池运行第20 d的样品.UV254的测定采用紫外/可见分光光度计进行测定(UV-2102C, UNIC, 中国), 波长为254 nm, 比色皿采用1 cm石英比色皿, 苯胺的测定采用高效液相色谱仪(日本岛津公司)和带ESI源API 4000 QTrap三重四极杆质谱仪(美国AB SCIEX公司)测定[20], 采用分散液相微萃取结合气相色谱法分析水中苯系物[21].
1.3 DNA提取与测定污泥细菌总DNA提取、PCR操作和16S rDNA测序由北京诺禾致源公司完成.首先, 采用Power Soil DNA提取试剂盒(MO Biomedical, U.S.)对生物膜样本中的DNA进行提取.然后, 选取细菌基因的V3~V4区进行聚合酶链式反应(PCR)扩增, 选取引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′).在使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物后, 用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量, 然后按照Illumina MiSeq平台的测序要求进行测序.本研究中高通量测序数据的序列保存在NCBI序列读取档案中, 登记号为SRR12451724.
1.4 ARGs丰度测定ARGs丰度测定方法为, 首先使用CARD数据库提供的Resistance Gene Identifier (RGI)软件将Unigenes与CARD数据库(https://card.mcmaster.ca/)进行比对(RGl内置blastp, 默认evalue≤l0~30)[22~24].根据RGI的比对结果, 结合Unigenes的丰度信息, 统计出各ARGs的相对丰度.最后, 从ARGs的丰度出发, 进行丰度柱形图和聚类热图分析.
1.5 微生物群落分析使用Qime(version1.17)软件进行数据去杂, 使用Uparse(version7.1)方法将操作分类单位(operational taxonomic units, OTUs)进行分类, OTU中序列相似性设为97%, 得到OTU的代表序列[25]; PCR扩增中产生的嵌合体序列使用Uchime(version4.2.40)检测, 并从OTU中去除; 使用Usearch_global方法将优化序列map比对回OTU代表序列, 得到OTU个样品序列丰度统计表.采用Mothur(version1.30.1)软件分析群落多样性指数(Shannon指数)、丰富度指数(Chao指数; ACE指数)和覆盖率指数(Good's coverage)来反映微生物群落的多样性(α diversity).采用RDP classifier贝叶斯算法, 对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析, 从而得到每个OTU所对应的物种分类信息, 并统计每个样品的群落组成.使用R语言Veran包进行热图(Heatmap)分析, 并采用Vegdist和Hclust进行距离计算和聚类分析, 距离算法为Bray-Curtis, 聚类方法为Complete.
1.6 统计分析采用Microsoft Excel2010对数据进行处理, 并用Origin9.0进行图解和相关分析.在R3.3.2(http://cran.r-project.org)中利用Pheatmap package构建基于各富集样品优势细菌属的热图; 用Canoco4.5进行了ARGs与细菌群落的相关性的冗余分析(RDA).用Spearman相关分析探讨了ARGs与细菌群落和芳香族化合物的相关性.
2 结果与讨论 2.1 印染废水循环利用系统运行情况印染废水二级出水中含有部分染料降解中间产物, 这些有机物是二级处理水中溶解性COD的重要来源[26].很多染料降解中间产物都具有苯环结构, 其中代表性的污染物为苯胺类(Aniline)、单环芳烃类(MAHs)和多环芳烃类(PAHs)等[27].印染废水循环利用条件下, 二级处理水中UV254、单环芳烃类、多环芳烃类和苯胺污染物浓度变化曲线如图 2所示.UV254反映水中含CC键和CO键的芳香族化合物含量.在循环利用初始阶段, 进水和水解出水中UV254快速增长, 到第30 d增速减缓[图 2(a)].而二级出水中的UV254出现波动, 经历了增长、下降再增长的过程.从UV254变化曲线可以看出, 污染物富集对微生物系统的冲击拐点出现在第60 d[图 2(a)].图 2(b)显示, 原水中苯胺浓度为9.80~10.10mg·L-1.二级出水中苯胺初始浓度为1.83mg·L-1, 前70 d保持稳定.从第70 d开始, 二级出水中苯胺浓度出现显著增加, 到第100 d达到3.92mg·L-1, 富集了1.14倍.图 2(c)显示了芳香烃的浓度.在循环利用过程中, 通过预处理和生物处理, MAHs的去除效率均高于99%.众所周知, MAHs具有很高的挥发性, 大部分MAHs可在好氧池曝气过程有效去除.虽然二级出水中的MAHs残留量很低, 但也存在MAHs积累现象.苯系物从初期0.87μg·L-1升高到运行末期的1.30μg·L-1, 增长了1.49倍.图 2(d)显示, 100 d内二级出水多环芳烃的浓度从390ng·L-1增加到680ng·L-1, 循环初期, 苯系物浓度增速较快, 到末期苯系物浓度增速减缓.PAHs物质浓度富集过程与苯系物相反, 初期增速较慢, 后期增速较快.
采用高通量方法分析活性污泥中抗性基因丰度, 共检测出52个抗生素抗性基因, 其中丰度排序前35的基因如图 3所示.编码的基因产物可分为9种类别的抗生素抗性基因[图 3(a)]: β-内酰胺类(β-lactam)、氨基糖苷类(Aminoglycoside)、氟喹诺酮-喹诺酮-氟苯尼考-氯霉素-胺酰醇类(FCA)、大环内酯-林肯酰胺酶-链阳性菌素B类(MLSB)、磺胺类(Sulfonamide)、四环素类(Tetracycline)、万古霉素类(Vancomycin)、外排类(Efflux)和其他(other).
对比得到水解污泥和活性污泥中的抗性基因分布情况如表 1所示.其中HS100是本研究循环至第100 d时的水解污泥, AS100是循环至第100 d时的好氧污泥, G-An、G-Ax和G-Ox来自于文献[28], 分别代表厌氧池泥水混合物、缺氧池泥水混合物和好氧池泥水混合物.由表 1可以看出, 不同样品中抗性基因的分布存在相类似性, 即ermB在各样品中的相对丰度均最高, 且tetA和sulⅡ更易集中在好氧池, 另外, 本研究印染废水循环利用运行至第100 d时, 抗性基因的相对丰度整体小于文献[28]中的相对丰度.
如图 3所示, 所有样本中ARGs的多样性分布均呈相同趋势, 即ARGs随循环次数的增加而富集, 特别是在水解污泥中编码β-内酰胺、其他和外排抗性的基因, HS100的富集明显高于其他时间.值得注意的是, 水解污泥内的ARGs相对丰度(第100 d: 1.5E-3)总体高于好氧污泥内的ARGs相对丰度(第100 d: 1.26E-3), 可以解释为好氧处理对抗性基因有一定的去除效果.相较于前一天, 富集倍数最大的是HS100中的磺胺类抗性基因(2.62倍).不同的基因其丰度最高时所处的时期不同, 数量最多的K07576基因, 在AS60时相对丰度显著增高.其次是ampG基因和marC基因, 相对丰度最高的时期均在AS40.结合图 4所示, 有7种抗性基因(penP、tetA、mef、aacC、aac62、ampC、ebr, 占比13%)显示出类似的趋势, 在第0~100 d的循环中, 相对丰度呈现先降低后增长的趋势, 有5种抗性基因(emrE、TCSMR3、tetM、ereAB、mdtH)分别在AS20和AS80出现最高丰度和最低丰度.
图 5(a)显示, 印染废水循环利用过程中, 好氧活性污泥微生物群落组成变化显著.总体来说, 运行初始阶段好氧活性污泥中共检测到19个已知菌门, 主要包括变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、TM6_Dependentiae、厚壁菌门(Firmicutes)、Ignavibacteriae和绿弯菌门(Chloroflexi), 丰度分别为58.95%、18.68%、4.04%、3.38%、2.60%和1.99%.在第40 d之后, 大部分细菌门急剧减少, 如Bacteroidetes、TM6_Dependentiae、Firmicutes、Ignavibacteriae和Chloroflexi等, 甚至有些门最终消失, 如游动杆菌门(Peregrinibacteria)和俭菌超门(Parcubacteria).值得注意的是, 变形菌的丰度从58.95%增加到92.62%.此外, 图 5中的SBR_1093丰度从0.16%逐渐增加到1.06%.与本文情况相似, 变形菌在高苯胺负荷率时成为优势菌[29], 变形菌门在印染废水、市政污水处理的活性污泥中处于优势门.本项目研究中, 变形菌在循环时间的不断增加下, 丰度逐渐上升到90.02%, 但是, 其它微生物门类丰度大幅降低甚至消失.
根据所有样品在属水平的物种注释及丰度信息, 选取丰度排名前35的属, 根据其在每个样品中的丰度信息, 绘制成热图, 便于发现哪些物种在哪些样品中聚集较多或含量较低.细菌群落在属水平上的变化结果如图 5(b)所示, 没有一种微生物丰度处于持续稳定状态.印染废水循环利用过程中硫杆菌属(Thiobacillus)的相对丰度由9.52%上升到53.81%, 然后下降到17.10%.此外, 丝硫菌属(Thiothrix)的丰度从14.22%下降到10.32%, 然后上升到48.72%.因此, 丝硫菌属成为优势属[图 5(b)].总体而言, 好氧条件下聚类微生物种数随循环次数增多持续下降.
2.4 ARGs与细菌群落的关系RDA分析能反映菌群与ARGs之间的关系.好氧污泥中ARGs与微生物群落之间的RDA分析结果见图 6, 其中显示K07576和TCMATE这两种抗性基因与微生物群落分布相关关系显著.在属水平上, 硫杆菌(Thiobacillus)与K07576呈正相关, 在门水平上, 变形菌门(Proteobacteria)与K07576呈正相关, 而硫杆菌和变形菌在循环利用过程中逐渐得到富集, 属于优势菌种, 因此可以解释K07576是丰度最高的抗性基因.拟杆菌门(Bacteroidetes)与marC和ampG呈正相关, 拟杆菌受污染物富集的影响, 在第60 d时丰度显著下降, 图 6中显示拟杆菌在第20 d和第40 d丰度较高, 与前述细菌结构的分析结果一致, 抗性基因marC和ampG均在第40 d时达到最高丰度, 随后持续下降, 与拟杆菌的变化趋势关系密切.文献[18]显示不动杆菌门(Acinetobacter)会促进ARGs的合成, 在第60 d丰度增至最高, 随后丰度持续下降.据报道, 厚壁菌门(Firmicutes)经常与抗生素抗性相关[12], 随循环次数的增加, 丰度呈波动趋势, 第100 d的丰度与初始丰度相比下降了84.66%, 放线菌门(Actinobacteria)也因经常产生多重抗性而被发现为一组产生抗生素的细菌, 会驱动ARGs的命运[18], 丰度先增后减, 在第60 d出现最大降幅, 为64.38%, 蓝藻门(Cyanobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)[30]与tetM、mefA和blaCTX等抗性基因有关, 前者丰度下降了85.15%, 而后者在第80 d时, 丰度增加至初始的3.96倍.在图 6(c)中, 放线菌门和酸杆菌门的箭头连线长度很长, 表明该菌落与ARGs的分布相关性相对更大.
Spearman秩相关可以用来研究环境因子与基因丰富度之间的相互变化关系, 得到两两之间的相关性和显著性P值.随着循环次数的增加, 有21种抗性基因受到芳香族化合物的显著影响, 其中有12种受到极显著影响(P<0.01).与抗性基因有显著相关性的芳香族化合物主要有芴(Flu)、菲(Phe)、(Chry)和苯并[b]荧蒽(BbF)等多环芳烃(PAHs), 以及甲苯(TOL)和乙苯(EBZ)等单环芳烃(MAHs).有研究证实[12], 与生活污水的单独处理相比, 生活污水与印染废水混合处理过程中, 抗生素抗性基因的丰度相对较高, 印染废水中的有机化合物可以促进PP4质粒的转移(4.3~219倍).如图 7所示, 12种多环芳烃对抗性基因K07576、aac3Ⅰ和oqxB的影响均为正相关, 对抗性基因marC、fsr、aadK、mdtG、norB、mdtH和norA的影响均为负相关, 但相关性有高低差别.其中, 苯并[k]荧蒽(BkF)与K07576呈极显著正相关(P<0.01, r=0.926), 芴与ampC(P<0.01, r=0.943)存在极显著正相关, 与marC和mdtH呈极显著负相关(P<0.01, r=-0.943), 菲与fsr、aadK和mdtH存在极显著负相关(P<0.01, r=-0.943).有两种多环芳烃[萘(Nap)和蒽(Ant)]对抗性基因的转移没有显著相关性.实验选取的6种单环芳烃类有机物中, 甲苯与抗性基因aac6Ⅰ(P<0.01, r=0.943)、ctcP(P<0.01, r=1)和ampC(P<0.01, r=0.943)存在极显著正相关, 与抗性基因marC呈现极显著负相关(P<0.01, r=-0.943), 乙苯与抗性基因fsr、aadK和mdtH呈现极显著负相关(P<0.01, r=-0.943).结果证明, K07576受到了多环芳烃的正相关影响, 而在循环利用过程中, 多环芳烃得到富集, 这可能是K07576丰度最高的原因; 然而, 丰度排名第二的marC基因却受单环芳烃和多环芳烃的极显著负相关影响, 因此, 芳香化合物的作用不是主要的.
(1) 印染废水生物处理系统的活性污泥中检出9大类52种ARGs.β-内酰胺类(β-lactam)抗性基因相对丰度最高, 其中K07576基因相对丰度最大.与循环初期相比, 运行末期ARGs相对丰度增幅为6.17%, 未出现显著富集现象.
(2) 芳香族化合物随循环次数的增加逐渐得到富集, 超过21种ARGs受到芳烃类污染物富集的显著影响, 其中, 6种ARGs与芳烃类污染物的浓度变化极显著正相关, 6种极显著负相关.
(3) 在印染废水的循环利用过程中, 微生物群落受芳香族化合物富集影响相对丰度显著下降, 其中与ARGs相关的Firmicutes、Actinobacteria和Cyanobacteria的群落丰度降幅分别为84.66%, 64.38%和85.15%.
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