氮素是水体初级生产力的关键限制性营养元素, 也是我国地表水的主要污染物之一.河流系统作为氮素滞留的主要区域, 其结构与功能受到人类活动的影响和控制, 导致活性氮的可利用性增加, 进而对水质、生物多样性和人类健康产生负面影响^[1].进入河流的有机氮或者无机氮, 除了被生物体直接利用外, 还会通过一系列生物地球化学过程在沉积物中转化和贮存, 从而使沉积物成为重要的氮“汇”.国内有关氮转化研究多集中在长江流域、黄河流域及主要的富营养化湖泊, 而对地处青藏高原的河流研究十分匮乏^[2].

药物及个人护理品(pharmaceuticals and personal care products, PPCPs)是地表水环境中普遍存在的新型污染物, 它们通过生活污水、工业废水、养殖废水、污水处理厂尾水以及固废渗滤液等源源不断排到自然水体中.水环境中的PPCPs浓度水平一般为ng·L^-1级, 而在一些频繁受到人类活动影响的湖泊或河流中赋存水平更高, 达到μg·L^-1级^[3].其中一些PPCPs的水体浓度已高于现有的致毒终点阈值, 对生态环境构成潜在风险^[4].

氮素和PPCPs在地表水中广泛共存, 容易形成复合污染, 而复合污染物的交互作用使得水生态安全问题变得更加复杂.目前关于PPCPs对河流系统氮转化过程的影响研究还很少, 特别是对生态相对脆弱的高原河流.已有研究发现, 甲砜霉素对河口沉积物的硝酸盐还原过程产生了抑制作用, 导致亚硝酸盐积累并促进了N₂O的释放^[5]; 而多种抗生素共暴露对河流沉积物的反硝化速率产生了协同抑制作用^[6].随着西部水电开发的推进, 雅鲁藏布江流域受到的人为干扰日益增多.由于生活污水处理效率不高, 同时传统污水处理工艺对新型有机污染物的处理效率不高, 使得大量含氮化合物和PPCPs进入雅鲁藏布江.已有研究表明, 雅鲁藏布江及其主要支流溶解性总氮的范围为枯水期1.3~2.5 mg·L^-1, 丰水期为1.1~2.0 mg·L^{-1 [7]}; 31种PPCPs被检出, 浓度范围在75.6~234 ng·L^-1之间; 混合风险熵评估结果表明, 有机滤光剂对鱼类构成慢性毒性风险^[8].

硝化反应是水环境中氮转化的重要过程, 是通过酶的催化作用将环境中的铵态氮氧化为硝态氮的过程.首先氨在氨单加氧酶(ammonia monooxygenase, AMO)的催化作用下氧化成为羟胺, 然后羟胺在羟胺氧化还原酶(hydroxylamine oxidase, HAO)的催化作用下氧化还原为亚硝态氮, 这两个阶段是硝化过程中必不可少的部分^[9].AMO主要有3个基因编码, 分别为amoA、amoB和amoC.其中amoA编码携带了AMO酶活性位点的亚基, 是典型的硝化功能基因^[10].本文选取在雅鲁藏布江广泛检出的两种PPCPs, 磺胺甲唑(SMX)和甲氧基肉桂酸乙基己酯(EHMC), 现场采集雅鲁藏布江沉积物和上覆水样品, 研究共存PPCPs对硝化速率、AMO和HAO活性及相关基因丰度的影响, 以期为高海拔河流复合污染的生态风险评估提供科学依据.

SMX(98%)、EHMC(98%)、LC-SAX(500 mg, 3 mL)和HLB((200 mg, 6 mL)固相萃取柱购自上海安谱科技实验股份有限公司.甲醇、丙酮和乙腈购自德国Merck公司, 色谱纯.其他化学试剂购于国药集团化学试剂有限公司, 分析纯.SMX和EHMC的结构和理化性质列于表 1.

表 1 (Table 1)

表 1 SMX和EHMC的结构和理化性质 Table 1 Structure and physicochemicl properties of SMX and EHMC 名称 缩写 CAS号 结构式 相对分子质量/g·mol-1 溶解度/mg·L-1 lgKow 磺胺甲唑 SMX 723-46-6 ① 253 459 0.890 甲氧基肉桂酸乙基己酯 EHMC 5466-77-3 ② 290 0.155 5.80

表 1 SMX和EHMC的结构和理化性质 Table 1 Structure and physicochemicl properties of SMX and EHMC

于2019年9月在雅鲁藏布江林芝段(29°32′30″N, 94°26′27″E)采集表层沉积物(0~5 cm)和上覆水.沉积物样品密封在无菌塑料袋中, 上覆水样品置于聚乙烯瓶中, 低温运回实验室.采样点海拔为2 910 m, 水温为16.2℃, 气压为70.9 kPa.

为消除沉积物中SMX和EHMC本底值的影响, 在实验开始之前, 对沉积物样品进行预培养.将采回的沉积物样品转移到玻璃容器(30 cm×30 cm×20 cm)中, 用多通道蠕动泵保持上覆水的流动, 流速设置为1 mL·min^-1, 在人工气候箱(15℃)中进行预培养.期间每7 d取沉积物样品, 检测SMX和EHMC的浓度, 直到低于检出限.

1.3.2 磺胺甲唑和甲氧基肉桂酸乙基己酯定量分析

冷冻干燥后的沉积物样品采用加速溶剂萃取仪(Dionex ASE 350, Sunnyvale, 美国)萃取, 经Oasis HLB柱净化, 采用Waters Acquity^TM UPLC-MS/MS(Waters, Miford, MA, USA)高效液相色谱-三重四极杆质谱系统测定SMX和EHMC的浓度^[11].SMX和EHMC的检测限分别为0.2和0.3 ng·kg^-1.培养28 d后, SMX和EHMC的浓度均低于检测限, 结束预培养.将沉积物样品充分混合, 用于后续硝化反应实验.

取完成预培养的沉积物样品(600 g)与超纯水(4.5 L)混合, 充分搅拌混匀得到泥浆样品.先将泥浆预培养24 h, 去除本底NH₄⁺-N.然后, 将100 mL泥浆样品装入250 mL锥形瓶中.向锥形瓶中加入NH₄Cl和KH₂PO₄(最终浓度分别为100μmol·L^-1和30 μmol·L^-1).为研究PPCPs组成和浓度对硝化过程的影响, 设置3个处理组(SMX、EHMC、SMX+EHMC)和5个浓度组(单一及联合处理组中SMX和EHMC的浓度均为0.01、0.1、1、10和100 μg·L^-1).另外设置空白对照组.所有处理和对照设置3组平行.所有样品在15℃下避光振荡(200 r·min^-1)培养12 h后, 测定NH₄⁺-N的浓度.单位时间内单位质量的沉积物消耗的NH₄⁺-N量为硝化速率, 即:

式中, N为潜在硝化反应速率[nmol·(kg·h)^-1]; k₁和k₀分别为样品中NH₄⁺-N的初始浓度和终止浓度(nmol·L^-1); W为沉积物的质量(g).

粗酶液的提取: 从培养结束后的锥形瓶中取泥浆25 mL, 于4℃、4 000 r·min^-1条件下离心3 min, 倒掉上清液, 沉淀用缓冲液定容到25 mL, 重复一次.采用超声波破碎机在4℃、20 kHz破碎细胞2 min.然后破碎液在4℃、12 000 r·min^-1条件下, 冷冻离心30 min, 取离心后的上清液, 即为粗酶液.

AMO活性测定: 在10 mL反应体系中, 加入600 μL粗酶液和1.8 mL 0.01mol·L^-1的磷酸盐溶液和1.6 mL 2 mmol·L^-1 (NH₄)₂SO₄.在恒温(15℃)振荡30 min, 然后离心.通过测定反应前后体系中NH₄⁺-N浓度, 得到AMO的活性.

HAO活性测定: 取4 mL反应液(50 mmol·L^-1Tris-HCl, 1 μmol·L^-1 K₃Fe(CN)₆, 4 μmol·L^-1 EDTA, 2 μmol·L^-1 NH₂OH)和0.4 mL粗酶液混合均匀, 在25℃水浴中反应5 min, 加入1 mL盐酸溶液(2 mol·L^-1)终止反应, 在400 nm处测定吸光度.

从培养结束后的锥形瓶中取泥浆10 mL, 4 000 r·min^-1离心得到沉积物, 冷冻干燥后用土壤DNA快速提取试剂盒提取总DNA(MP Biomedicals, Cleveland, OH, USA).采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)系统测定amoA和hao基因的表达情况, 两个基因的引物名称、序列及扩增条件列于表 2.使用ABI 7500序列检测系统(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)测定amoA和hao的基因拷贝数.

表 2 (Table 2)

表 2 amoA和hao基因引物名称、引物序列和扩增条件 Table 2 Primers, thermal profiles, and parameters for qRT-PCR quantification of amoA and hao 目的基因 引物名称 引物序列(5′-3′) 扩增条件 文献 amoA amoA-1F amoA-2R GGGGTTTCTACTGGTGGT CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC 95℃、3 min, 一个循环; 94℃、30 s, 65℃、30 s, 72℃、10 s, 40个循环 [12] hao hao-F hao-R GTMGGHTGYATYGACTGYCAC GRCGRTTGGTBKTYTGDCC 95℃、3 min, 一个循环; 94℃、30 s, 71℃、30s, 72℃、10 s, 40个循环 [13]

表 2 amoA和hao基因引物名称、引物序列和扩增条件 Table 2 Primers, thermal profiles, and parameters for qRT-PCR quantification of amoA and hao

使用统计软件(SPSS, version-20.0)进行数据统计分析.采用单因素方差分析(ANOVA)检验不同处理与对照组间的差异以及同一处理组不同浓度间的差异.绘图采用OriginPro 2017完成.

采集的雅鲁藏布江林芝段水样中NH₄⁺、NO₃^-和NO₂^-的浓度为0.280、0.360和0.004 mg·L^-1, 沉积物中含量分别为3.27、3.88和0.140 mg·kg^-1, 沉积物中总氮含量为487 mg·kg^-1.

2.1 磺胺甲唑和甲氧基肉桂酸乙基己酯对硝化速率的影响

不同浓度的SMX和EHMC处理条件下沉积物的硝化速率变化如图 1所示.与对照组相比, 所有处理组沉积物的硝化速率均显著降低.SMX的浓度越高, 对硝化作用的抑制作用越强, 不同浓度的抑制率范围为30%~47%, 呈现出一定的浓度效应关系.不同浓度EHMC的抑制率范围为9.7%~50%, 其中1 μg·L^-1的EHMC对硝化速率的抑制作用最强; 更高浓度下(10 μg·L^-1和100 μg·L^-1)抑制效应有所减轻, 与0.1 μg·L^-1浓度组没有显著差异.SMX和EHMC联合暴露对硝化作用的抑制率为38%~66%, 但是浓度-效应关系不明显.0.01 μg·L^-1和10 μg·L^-1联合暴露组的抑制率显著高于单独暴露, 其他浓度联合暴露组的抑制率与SMX或EHMC单独暴露组一致.

图 1

Fig. 1

均值±标准差, n=3, 不同大写字母表示同一处理组中不同浓度之间的显著性差异, 不同形式小写字母表述相同浓度下不同处理及对照组之间的显著性差异(P < 0.05), 下同 图 1 SMX和EHMC对硝化速率的影响 Fig. 1 Effects of SMX and EHMC on nitrification rates

2.2 磺胺甲唑和甲氧基肉桂酸乙基己酯对AMO和HAO活性的影响

SMX和EHMC对AMO和HAO活性的影响如图 2所示.所有SMX和EHMC处理组均显著抑制了AMO活性.随着SMX浓度的升高, AMO活性逐渐降低, 抑制率在51%~78%之间, 呈现明显的浓度-效应关系.在SMX和EHMC联合处理组中, AMO活性抑制率为55%~84%, 但是浓度依赖性不明显.而随着EHMC的浓度增加, 对AMO活性的抑制率呈现降低趋势.

图 2

Fig. 2

图 2 SMX和EHMC对AMO和HAO活性的影响 Fig. 2 Effects of SMX and EHMC on AMO and HAO activities

SMX单独及与EHMC联合处理均显著抑制了HAO活性, 并呈现出类似的浓度-效应关系, 最大抑制率分别为57%和87%, 联合暴露诱导了更强的抑制效应.但是, 与对照组相比, 低浓度EHMC没有明显改变HAO活性, 当EHMC浓度大于1 μg·L^-1时, HAO活性增加了21%~40%.

2.3 磺胺甲唑和甲氧基肉桂酸乙基己酯对amoA和hao基因丰度的影响

所有SMX和EHMC处理组均显著降低了amoA基因丰度(图 3).不同浓度的SMX对amoA基因丰度的抑制率范围为28%~47%.尽管amoA基因丰度随SMX浓度升高呈现降低的趋势, 但是浓度-效应关系并不明显.EHMC处理对amoA基因丰度的抑制范围为9.2%~29%, 两个低浓度组EHMC对amoA基因的抑制率与SMX接近, 但是高浓度组显著低于SMX.SMX和EHMC混合暴露对amoA基因丰度的抑制率范围为26%~41%, 除了最高浓度组, 其他浓度组间并无显著差异.

图 3

Fig. 3

图 3 SMX和EHMC对amoA和hao基因丰度的影响 Fig. 3 Effects of SMX and EHMC on the abundance of amoA and hao genes

不同浓度的SMX单独及其与EHMC联合处理均显著降低了hao基因丰度(图 3).SMX对hao基因丰度的抑制率在48%~76%之间, 3个低浓度(0.01~1 μg·L^-1)之间的抑制效应没有显著差异, 当浓度高于1 μg·L^-1时, hao基因丰度随浓度升高显著降低.在SMX和EHMC联合暴露组, hao基因丰度随暴露浓度升高逐渐降低, 最大抑制率达到68%, 呈现明显的浓度-效应关系, 但是最低浓度暴露下hao基因丰度与对照组没有显著差异.除了最低浓度组, 混合暴露对hao基因的抑制效应与SMX单独暴露相似.但在EHMC单独处理组中, 0.01和1 μg·L^-1浓度下hao基因丰度与对照组没有明显差异, 而两个高浓度EHMC使hao基因丰度增加了16%左右.这一结果与EHMC诱导的HAO活性增加基本一致.

长期施用氮肥使土壤中amoA基因的多样性降低, amoA和hao基因的菌群组成发生显著变化^[14].Ming等^[15]在对辽河河口沉积物的研究中发现, 沉积物粒径是影响氨氧化古菌和氨氧化细菌群落结构的主要因子, 而amoA基因丰度与粉粒含量呈显著正相关.Zhou等^[16]在对青藏高原不同类型湿地的研究中发现, 气候因素在塑造氨氧化微生物群落组成方面起着主导作用; 氨氧化古菌的群落组成受年平均气温和年平均降水量的影响, 而年平均气温、电导率、植物丰富度、pH和总氮含量影响了氨氧化细菌的群落组成.此外, 河口地区细菌amoA基因丰度与盐度密切相关, 而且氨氧化古菌比氨氧化细菌的潜在硝化速率要低^[17].

有关抗生素类对硝化过程的影响已有报道.Xing等^[18]的研究发现磺胺甲嘧啶对硝化过程有明显的抑制效应, 抗生素(四环素和磺胺甲嘧啶)和重金属(Zn²⁺和Cu²⁺)共暴露对硝化微生物活性产生了协同作用.张敏等^[19]研究了氯霉素、恩诺沙星和磺胺嘧啶对淡水池塘沉积物氨氧化微生物生长和硝化作用的影响, 结果表明, 3种抗生素均在不同程度上抑制了硝化作用, 而且磺胺嘧啶(≤500 mg·L^-1)对氨氧化细菌的生长有显著抑制作用.阿奇霉素、诺氟沙星、甲氧苄啶和SMX等抗生素混合物对脱氮生物反应器中细菌种群和生物量结构有很大影响, 由于氨氧化菌亚硝基单胞菌(Nitrosomonas)和念珠菌(Candidatus Brocadiales)的数量减少, 导致脱氮效果不佳^[20].在350 ng·L^-1环丙沙星暴露条件下, 部分硝化反应器微生物群落结构发生了显著变化, 氨氧化细菌种群显著减少, NH₄⁺-N去除效率降低^[21].SMX是最主要的人用和兽用抗生素之一, 在地表水环境中的最高检出浓度达到1.49 μg·L^-1[22].2 μg·L^-1的SMX暴露60 d改变了好氧颗粒污泥和悬浮活性污泥中的细菌群落组成^[23].在本研究中, 0.01~100 μg·L^-1的SMX单独及共暴露通过下调amoA和hao基因表达, 抑制了AMO和HAO的活性, 从而导致雅鲁藏布江沉积物的硝化速率显著降低.

关于个人护理品对硝化过程的影响研究较少, 但是它们对细菌具有较强的毒性^[24].研究发现, 三氯生和三氯卡班单独及联合处理可能通过抑制氨氧化菌(氨氧化古菌和氨氧化细菌)或者亚硝化细菌的活性, 使土壤自养硝化速率显著降低^[25].当三氯生在砂土中的浓度超过5 mg·kg^-1, 会抑制土壤的净硝化活性^[26].EHMC属于个人护理品中的防晒剂成分, 存在两种异构体, 即反-EHMC和顺-EHMC, 二者的比例为99∶1.反-EHMC分子吸收紫外光后能迅速发生互变异构, 生成顺-EHMC, 两种异构体的生物毒性不同^[27].本研究中虽然EHMC增加了hao基因丰度及HAO活性, 但硝化速率仍然显著降低, 证明由AMO催化的氨氧化为羟胺的过程是限制硝化速率的关键步骤^[28].

在组合的硝化/厌氧氨氧化中试装置中, 当硝化过程受到抑制时, 磺胺甲唑的去除率显著降低^[29].当活性污泥系统中的硝化过程受到抑制时, 布洛芬、萘普生和酮洛芬的去除率也显著降低^[30].本研究测定了10 μg·L^-1的SMX和EHMC在水-沉积物-微生物系统的浓度变化, 12 h后水中SMX和EHMC的去除率分别为27%和6.4%, 降解率仅为7.3%和2.7%. SMX和EHMC属于难生物降解的污染物, 沉积物中的微生物降解和转化PPCPs时需要消耗营养物质和电子, 可能与氨氧化过程产生竞争效应, 从而导致了硝化过程和PPCPs降解的双向抑制作用.笔者之前的研究发现, SMX和EHMC单独和联合暴露显著抑制了雅鲁藏布江沉积物中的反硝化速率和厌氧氨氧化速率, 促进了反硝化过程中N₂O的释放^[31].以上结果表明, 高海拔河流中广泛检出的PPCPs干扰了氮转化过程, 使高原河流中的氮素去除效率降低, 氮污染负荷加重, 同时也可能加速PPCPs在沉积物中累积, 从而加剧复合污染的生态风险.

(1) SMX单独暴露显著降低了雅鲁藏布江沉积物中硝化反应相关功能基因amoA和hao丰度, 显著抑制了AMO和HAO活性, 进而导致沉积物中的硝化速率显著降低.

(2) EHMC单独暴露显著降低了amoA基因丰度, 并显著抑制AMO活性, 尽管hao基因丰度和HAO活性增加, 沉积物中的硝化速率仍然显著降低, 表明由AMO催化的氨氧化为羟胺的过程是硝化反应的限速步骤.

(3) SMX与EHMC联合暴露对硝化过程的影响与SMX单独暴露类似, 但是对AMO和HAO活性的抑制效应更强, 因此导致硝化速率更低.PPCPs干扰了高海拔河流的氮转化过程, 加剧了复合污染的生态风险.