2021, Vol. 42
2. 国网安徽省电力有限公司电力科学研究院, 合肥 230601
2. State Grid Anhui Electric Power Research Institute, Hefei 230601, China
在过去10年, 快速的经济增长伴随着巨大的能源消耗, 加上大气环境保护措施的缺乏, 导致中国出现了持续的雾-霾事件[1, 2], 大气颗粒物排放增加是其主要成因[3].学者们对大气颗粒物, 尤其是PM2.5和PM10的组分、理化性质、来源途径和时空变化特征等方面进行了广泛地研究, 但对占大气颗粒物25%的生物气溶胶(细菌、真菌、病毒和花粉)[4]研究较少.Bowers等[5]的研究发现生物气溶胶主要成分为细菌和真菌, 占比分别为70%和21%.空气中细菌和真菌可以直接作为病原体, 或者作为诱导物引发各种呼吸道疾病和过敏症状[6~8]. 2019年末暴发的新冠病毒疫情至今仍肆虐全球, Morawska等[9]的研究指出新冠病毒通过空气传播的风险或被低估, 呼吁世界卫生组织(WHO)关注和重视新冠病毒通过空气传播的风险.随着对大气颗粒物研究不断加强, 附着在颗粒物上的大气微生物逐渐成为热门的研究对象, 其研究主题不断拓展, 范围已从探索其在大气中的存在和代谢活动到研究其潜在的致病性以及对气候和人类健康的影响.
传统的大气微生物研究方法主要是基于培养[10~12]或直接镜检法[13].凌琪等[14]使用自然沉降法在合肥市采集大气微生物样品, 并进行培养基培养, 发现细菌优势属为微球菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属, 真菌优势属为曲霉属、青霉属、毛霉属和根霉属, 其中真菌占大气微生物总量的6.92%.由于只有很小一部分(＜1%)大气细菌和真菌可以培养, 且在培养基选择上存在困难, 因此使用这些方法对大气微生物的表征非常有限[12, 13, 15].随着基因测序技术的快速发展, 第二代高通量测序为研究气溶胶微生物提供了新的视角[16].Bowers等[5]在美国科罗拉多州丹佛市和格里利市连续采集了14个月的PM2.5和PM2.5-10大气颗粒物样品, 通过高通量测序分析了细菌和真菌的多样性, 发现细菌是生物气溶胶的主要组成部分, 其余是真菌和花粉.Du等[17]采用高通量测序方法分析了北京市不同季节不同空气污染水平下PM2.5的细菌和真菌群落组成, 结果表明冬季细菌和真菌的物种丰富度最高, 夏季最低, 空气污染会降低PM2.5中细菌物种丰富度和群落多样性.Yu等[18]同样采用高通量测序技术对长沙市雾-霾天和非雾-霾天大气颗粒物的微生物群落结构进行了研究, 结果表明大气微生物群落多样性随颗粒物浓度和AQI的增加而增加.
目前国内的相关研究主要集中在北京、济南等中东部城市[17, 18, 19], 合肥作为迅速发展的科技重镇, 相关研究还未见报道.此外, 这些研究主要以分析PM2.5和PM10中细菌群落组成在雾-霾与非雾-霾期间的差异性为主, 但细菌和真菌群落在其它天气条件下以及不同粒径间的差异性研究则较为匮乏.大气颗粒物中PM1.0可轻易穿透胸部和肺部的气道, 对雾-霾的形成和能见度的降低起重要作用[20].同时, PM1.0比表面积大于PM2.5, 意味着PM1.0具有更大的健康风险[19].扩增子测序(包括细菌16S rRNA测序和真菌ITS测序)不仅价格低廉, 结果易于分析, 而且可以提供充分的细菌和真菌群落结构信息[17~19].
因此, 本文选择了合肥市作为研究地点, 采集了大气颗粒物样品, 对附着的大气微生物群落特征及其环境效应进行了分析研究.采用高通量测序技术表征了合肥大气中PM10、PM2.5和PM1.0这3种粒径中的细菌和真菌群落, 探究了不同粒径下微生物群落结构差异, 以及合肥市大气微生物的主要来源途径.除此之外, 测定了大气颗粒物样品中痕量元素和水溶性离子浓度, 据此分析了大气微生物群落组成的主要影响因素.本文还分析了合肥市大气微生物中的致病菌, 有助于揭示大气微生物对人体健康的致病机制, 对颗粒物监测的改进和政府相应政策的制定具有重要的参考价值.
1 材料与方法 1.1 样品采集在2019年7~9月于国网安徽电力科学研究院楼顶(31°50′09.8″N, 117°15′53.8″E, 采样口距地面21 m)采集了PM1.0、PM2.5和PM10样品.采样点位于住宅区, 商业区和大学校园之间, 人口密集, 没有典型较大颗粒物排放源影响.使用小流量采样器(ZR-3930B, 青岛众瑞, 16 L·min-1)收集PM1.0于47 mm石英滤膜上(Tissuquartz, Pall), 同时使用两台中流量采样器(ZR-3922, 青岛众瑞, 100 L·min-1)分别收集PM2.5和PM10于90 mm石英滤膜上.每月连续采集3 d晴天样品, 7月额外连续采集3 d雨天样品, 采样时间为24 h(大致为上午09:00至次日09:00), 采样前后使用百万分之一高精度天平(Sartorius M2P)称量并记录每张滤膜的质量, 采用称重法分析颗粒物浓度[21].为了防止引入外源微生物污染, 滤膜不进行恒温恒湿处理[22].滤膜在采样前均使用马弗炉500℃烘烤5 h, 其它实验器具在使用前均使用75%酒精消毒.采集到的滤膜放入已消毒的滤膜保存盒内, 置于-20℃冰箱保存[17].
1.2 化学组分测定考虑到同一采样点同一粒径在相似天气条件和短时间序列内, 它的化学组分、细菌丰富度和群落组成具有高度相似性, 为了降低数据集的复杂程度, 对样品进行合并[5, 17]：7月雨天的3个样品按粒径分别合并为7Y1、7Y2和7Y3(1、2和3分别表示PM1.0、PM2.5和PM10), 同理7~9月晴天样品分别合并为7F1、7F2、7F3、8F1、8F2、8F3、9F1、9F2和9F3, 共计12个样品.
使用打孔器(直径12 mm)从每张滤膜上打取两个样本, 按照上述分组合并后分别进行水溶性离子与痕量金属元素测定.采用离子色谱仪(ICS-2100, Dionex)测定样品中的水溶性阳离子(NH4+、K+、Na+、Ca2+和Mg2+)和水溶性阴离子(SO42-、NO3-、NO2-、PO43-、Cl-和Br-)浓度.采用电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS(NexION2000, PerkinElmer)测定样品中As、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Mn、Ni、Pb和Zn等多种痕量金属元素的含量.上述两个实验均按照仪器实验流程严格进行.
1.3 DNA提取和PCR扩增剩余样品经液氮冷冻后, 在组织破碎仪中进行破碎, 以使样品表面及内部的菌群能更好地与裂解液接触.之后使用OMEGA E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit试剂盒提取样品中的DNA, 具体步骤参照试剂盒使用说明书.
利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量, 以确定PCR反应需要加入的DNA量.PCR所用的引物已经融合了测序平台的通用引物(表 1).在两轮PCR扩增结束后, 对PCR产物进行琼脂糖电泳检测.之后, 分别选用0.6倍和0.8倍的磁珠处理细菌PCR产物和真菌PCR产物, 纯化回收样品的DNA.利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量.最后使用MiSeqTM平台(Illumina, San Diego, CA, USA)按照1∶1的等量混合后, 对细菌16S rRNA基因的V3-V4区和真菌rRNA基因的ITS1-ITS2区进行高通量测序.
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表 1 PCR扩增引物序列 Table 1 Primers used in PCR reaction |
1.4 荧光定量PCR检测
本研究采用荧光定量PCR测定3种粒径颗粒物中rRNA基因的绝对含量, 使用的引物同高通量测序(表 1).将DNA样品稀释10倍作为模板, 荧光定量PCR反应混合物包含5 μL SybrGreen qPCR Master Mix(B639271, BBI)定量PCR试剂, 每个引物0.2 μL, 模板DNA 1 μL, 双蒸水3.6 μL.反应程序为：95℃ 3 min; 95℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35次循环; 72℃ 8 min.
qPCR程序在LightCycler® 480 Ⅱ Real-Time PCR系统(Roche, Rotkreuz, Switzerland)中进行：95℃ 3 min; 95℃ 40 s, 45次循环; 60℃ 30 s, 45次循环.去离子水作为阴性对照, 从样品中提取DNA, 将去离子水注入微板孔中.完成上述步骤后, 把加好样品的孔板放在LightCycler480 Ⅱ型荧光定量PCR仪(Roche, Rotkreuz, Switzerland)中进行扩增和检测.
1.5 测序分析使用QIIME2 2019.10[23]进行微生物组生物信息学分析.使用q2-demux插件对原始序列数据进行拆分并进行质量过滤, 然后使用DADA2进行去噪[24](via q2-dada2).将所有扩增子序列变体(ASVs)与mafft进行比对[25](via q2-alignment), 并用于构建fasttree2系统发育树[26](via q2-phylogeny).使用q2-diversity计算α多样性指标和β多样性指标.使用q2-feature-classifier[27]classify-sklearn训练Greengenes 13_8 99% OTUs参考序列[28]的Naive Bayes分类器, 之后与ASVs进行比对, 完成物种信息注释.真菌样本序列经过拆分后, 使用PIPITS(version 2.7)软件[29]进行后续处理过程.
1.6 数据分析采样期间的合肥市气象数据(temperature、wind direction、wind speed、relative humidity、visibility、AQI、SO2、NO2、O3和CO)从国家气象科学数据中心网站获取(http://data.cma.cn/article/getLeft/id/29172/type/15.html).使用R包vegan计算微生物群落多样性指数(R version 4.0.2).使用SPSS 25.0软件中的方差分析(ANOVA)评估细菌群落多样性和真菌群落多样性的差异.使用Canoco 5(version 5.02)软件中的冗余分析(redundancy analysis, RDA)来可视化细菌和真菌群落多样性与环境因子之间的关系, 其余绘图使用Origin 2020软件.本文所测得的细菌16s rRNA序列和真菌ITS序列已存入NCBI数据库的Sequence Read Archive(SRA)中, BioProject ID分别为PRJNA646403和PRJNA646388.
2 结果与讨论 2.1 合肥市大气颗粒物中细菌和真菌群落多样性特征不同颗粒物样品中细菌和真菌物种丰富度及群落多样性的相关参数列于表 2和表 3中.去除不合格的基因序列后, 分别获得了总计240 863和764 894条高质量的细菌16S rRNA基因和真菌ITS基因.细菌和真菌的覆盖率(coverage)均为1.00, 表明了实验数据的可靠性[19].细菌的OTUs/Chao1达到100%饱和度, 真菌除7Y1(72%)外, OTUs/Chao1均高于75%饱和度, 说明测序足够充分[30].对比7月的雨天样品和晴天样品, 发现无论是细菌还是真菌, 雨天样品的香农指数(Shannon)均高于晴天样品, 表明雨天细菌和真菌群落多样性高于晴天, 这可能是因为雨天对流不稳定, 会激发高浓度真菌羽流的释放[31], 意味着真菌孢子、细菌和其它较小的生物气溶胶可以沿上升流到达有利于远距离运输和扩散的高度[5].有研究表明, 雨天后近地表大气总的生物气溶胶浓度(大部分是细菌和真菌)会增加[32, 33].PM10真菌样品的香农指数高于其它两种粒径, 说明PM10真菌群落多样性最高, 这可能归因于许多真菌孢子团块的空气动力学直径在2.5~10 μm[34].另外, 细菌群落的香农指数高于真菌, 表明细菌群落多样性显著高于真菌群落多样性(ANOVA, F=23.36, P＜0.01).
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表 2 不同大气颗粒物样品中细菌群落物种丰富度和群落多样性指标比较 Table 2 Comparison of species richness and community diversity estimators of the bacterial communities in different atmospheric particulate matter samples |
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表 3 不同大气颗粒物样品中真菌群落物种丰富度和群落多样性指标比较 Table 3 Comparison of species richness and community diversity estimators of the fungal communities in different atmospheric particulate matter samples |
2.2 合肥市大气颗粒物中细菌和真菌群落的组成特征
在12个样品中共发现了24个细菌门[图 1(a)].在所有序列中, 变形菌门(Proteobacteria)是丰度占比最高的门类, 占46.19%.其次是厚壁菌门(Firmicutes, 33.42%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 10.99%)、蓝藻门(Cyanobacteria, 3.33%)和放线菌门(Actinobacteria, 2.11%).其中, 变形菌门在细颗粒物(PM1.0)中占比较高, 厚壁菌门多分布于粗颗粒物(PM2.5和PM10)中, 放线菌门在PM1.0和PM2.5中占比高于PM10, 这可能是因为放线菌门的存在形式主要是孢子态, 其粒径较小, 更倾向于附着在较细颗粒物上; 而厚壁菌门在大气中多以细菌聚合物形式存在, 更易于附着在粗颗粒物上[35].
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“其它”表示每个样品中相对丰度 < 3%的细菌和真菌, 不能归入任何已知类别的序列被分配为“未鉴别” 图 1 合肥市大气颗粒物中门层次细菌群落和纲层次真菌群落的组成 Fig. 1 Composition of the bacterial communities at the phylum level and fungal communities at the class level in atmospheric particulate matter in Hefei City |
在属水平上, 合肥大气微生物中优势细菌属为不动杆菌属(Acinetobacter, 16.19%)、芽孢杆菌属(Bacillus, 13.21%)、沉积物杆状菌属(Sediminibacterium, 4.98%)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium, 4.97%)、乳杆菌属(Lactobacillus, 2.90%)、拟杆菌属(Bacteroides, 2.77%)、假单胞菌属(Pseudomonas, 2.26%)、伯克氏菌属(Burkholderia, 2.05%)、青枯菌属(Ralstonia, 2.04%)和葡萄球菌属(Staphylococcus, 1.96%).
另外, 在12个大气颗粒物样品中鉴定出了11个真菌门.主要真菌优势菌门为子囊菌门(Ascomycota, 73.23%)、担子菌门(Basidiomycota, 5.78%)、被孢霉菌门(Mortierellomycota, 3.41%)和毛霉门(Mucoromycota, 0.10%).优势菌纲[图 1(b)]为子囊菌纲(Sordariomy-cetes, 36.64%)、座囊菌纲(Dothideomycetes, 24.43%)、酵母菌纲(Saccharomy-cetes, 17.23%)、散囊菌纲(Eurotiomycetes, 5.47%)、伞菌纲(Agaricomycetes, 4.14%)和被孢霉菌纲(Mortierellomycetes, 4.08%).酵母菌纲集中分布于PM1.0中, 雨天样品的伞菌纲和被孢霉菌纲相对丰度高于晴天样品.真菌优势属为间座壳属(Diaporthe, 26.79%)、酵母菌属(Saccharomyces, 16.50%)、红曲霉属(Monascus, 3.78%)、被孢霉属(Mortierella, 3.64%)、绿核菌属(Ustilaginoidea, 1.80%)和Cutaneotrichosporon(1.14%).
对比分析了7月雨天和晴天样品中细菌和真菌的群落组成(图 2), 结果表明：对于细菌, 在雨天收集的细颗粒物(PM1.0和PM2.5)中存在少量的蓝藻菌门, 除此之外不同粒径下优势菌门组成基本不变, 只在相对丰度上存在较小波动.对于真菌, 雨天收集的PM1.0中散囊菌纲和伞菌纲显著增高; 雨天收集的PM2.5中子囊菌纲和座囊菌纲相对丰度明显降低, 同时被孢霉菌纲、散囊菌纲、酵母菌纲和银耳菌纲的相对丰度大幅增高; 雨天PM10样品的子囊菌纲与晴天样品相比相对丰度较低, 但散囊菌纲相对丰度较高, 其它优势菌纲波动不大.可以看出, 雨天颗粒物中细菌群落组成和真菌群落组成均比晴天丰富, 这种影响对于真菌尤为明显, 原因可能是细菌的粒径较小, 在空气中沉降速率更低, 其群落组成也相对更稳定; 而真菌粒径较大, 雨天的对流不稳定对真菌的影响更大.
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从左到右分别为PM1.0、PM2.5和PM10这3种粒径, 外圈=晴天样品, 内圈=雨天样品 图 2 合肥市7月大气颗粒物雨天和晴天样品中微生物群落组成对比 Fig. 2 Comparison of the microbial community composition in samples of atmospheric particulate matter between rainy and sunny days in July in Hefei City |
将本文合肥市的研究结果与其它城市进行对比(表 4), 可以看出不同城市大气微生物, 包括细菌和真菌, 在优势菌门和优势菌纲的组成上类似, 只是相对丰度有所不同.这可能是因为这些菌门在细菌和真菌中占优势地位, 它们能够在大气这种相较于土壤和水体而言资源匮乏的不利环境中生存, 并容易气溶胶化附着在大气颗粒物上, 所以在不同大气环境中普遍存在.但在优势菌属的组成上差异较大, 造成这种差异的原因是相当复杂的.Bowers等[5]的研究发现美国科罗拉多州大气中细菌的群落组成和特定细菌类群的相对丰度表现出明显的季节性规律, 而且城市与农村的大气微生物群落组成不同, 部分原因是因为土地利用类型不同.Cao等[36]使用宏基因组方法分析了北京市严重雾-霾期间PM污染物中的微生物组成, 并且鉴定到了几种呼吸道微生物过敏原和病原体的序列, 其相对丰度随颗粒物污染浓度的增加而增加.因此, 这种相对丰度上的差异可能与不同城市的土地利用类型、人口分布和产业布局等因素相关, 也可能与不同城市的气象条件和采样的季节相关, 又或者受两者的综合影响.
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表 4 不同城市大气微生物群落组成分布情况 Table 4 Composition of airborne microbial communities in different cities |
2.3 合肥市大气颗粒物中细菌和真菌的潜在来源与影响因素
Bowers等[5]通过将各种土壤类型、叶子表面、人和动物粪便中细菌的16S rRNA序列数据源样本, 以及收集到的所有空气样本合并到一个序列文件中, 进行处理分析, 为所有源样本构建了一个科水平上的相对丰度表, 选择指标值>0.5的细菌科作为潜在源环境的指示单元.图 3是根据Bowers等[5]给出的指示单元, 通过相加它们在每个大气样本中的相对丰度得出的热图, 其中每种颜色的强度代表每个来源的相对影响.
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颜色代表3种主要来源，红色表示土壤，绿色表示植物叶面，橙色表示动物粪便; 数字表示每个粒径每个月的总来源贡献 图 3 作为潜在细菌来源的不同环境对合肥市大气样本的相对重要性 Fig. 3 Relative importance of different environments as potential sources of bacteria to the samples collected from Hefei City in the three size fractions |
由于来源跟踪方法的不确定性, 不能保证每个分类单元都能被分配到一个特定的来源(土壤、植物叶面、动物粪便或其它), 这张热图显示的是已确定的来源对不同月份的不同相对贡献, 而不是给定月份的不同来源.换句话说, 数据应该读取为行, 而不是列. 结果表明, 土壤(28.61%, 同一来源指示细菌相对丰度之和在不同粒径、不同月份的平均值, 下同)、植物叶片(32.18%)和动物粪便(2.82%)是合肥大气中细菌群落的主要来源.粗颗粒(PM2.5和PM10)主要受土壤来源影响, 而细颗粒(PM1.0)主要受植物叶片来源影响.本研究结果与前人的研究成果相一致, Bowers等[5]的研究发现美国科罗拉多州大气中细菌的主要来源是土壤和植物叶片, Cao等[36]的研究发现北京市大气微生物基因组区别于其它环境, 但与土壤相近, 表明可吸入微生物大部分来源于土壤.除此之外, 在动物粪便中, 人和狗的粪便占比很小, 主要为奶牛粪便.合肥市有多个养殖场位于采样点17 km以内, 这可能是合肥市大气奶牛粪便细菌的来源.有研究表明, 牛圈表面的粪便平均贡献了养殖场向外排放的总PM10颗粒的78%[37], 这与本文中PM10受奶牛粪便影响最大相符.
对于真菌, 在目水平上鉴定到了格孢腔菌目(Pleosporales, 22.04%)、煤炱目(Capnodiales, 2.07%)、座囊菌目(Dothideales, 0.18%)、散囊菌目(Eurotiales, 5.00%)和柔膜菌目(Helotiales, 0.53%).格孢腔菌目、煤炱目和座囊菌目多寄生于植物叶片, 而散囊菌目和柔膜菌目则生活在土壤腐殖质中.这些真菌的存在表明合肥市大气中真菌的主要来源是植物叶片和土壤.
大气微生物群落能对大气环境因子的变化作出快速反应.采用Canoco5软件对细菌[图 4(a)]和真菌[图 4(b)]群落多样性与大气环境因子做冗余分析(redundancy analysis, RDA), 分析前使用SPSS对原始数据进行Z-score标准化.细菌RDA图第一轴可解释63.26%的变异, 第二轴可解释22.17%的变异, 累计高达85.43%, 真菌RDA图第一轴可解释63.69%的变异, 第二轴可解释19.19%的变异, 累计高达82.88%, 因此均选用第一轴和第二轴进行可视化.经过蒙特卡洛置换检验, 筛选出了对细菌和真菌群落多样性解释率最高的几种环境因子, 将其和香农指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)、OTUs、皮洛均匀度指数(Pielou)以及基因拷贝数(Genes)等拟合在排序图上.
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红色箭头表示环境因子，黑色箭头表示群落多样性指数 图 4 合肥市大气颗粒物中细菌和真菌群落多样性与大气环境因子关系的冗余分析排序 Fig. 4 Triplot of the first two axes of the RDA for atmospheric environmental factors associated with the bacterial and fungal community diversity of airborne particulates in Hefei City |
结果显示, 细菌与真菌对环境因子的响应有较大差别.AQI与真菌基因拷贝数和OTUs呈负相关, 因为大气污染物会对真菌造成损伤, 但与真菌皮洛均匀度和香农指数呈正相关, 这可能是大气污染物对优势菌种的抑制作用更强, 劣势菌种生存压力降低, 从而间接提高了群落整体的均匀度和多样性.而AQI对细菌影响较小, 在前向选择中被剔除, 这可能是因为SO2、NO2和O3等大气污染物对细菌没有直接影响, 而是通过与其它环境因子相互作用从而间接影响细菌群落[38]. Al、K和Sr分别与细菌和真菌的基因拷贝数呈正相关, 这3种元素的主要来源是大陆地壳, 印证了土壤是大气微生物的主要来源, 但均与α-多样性指数呈负相关, 这可能是因为强风不利于气溶胶颗粒物的悬浮和滞留.Na+与细菌和真菌的基因拷贝数和α-多样性指数均呈负相关, 这是因为Na+会干扰微生物的结构和功能, 导致微生物死亡[19].值得注意的是, 细菌和真菌对NO2-有截然不同的响应, 这可能是因为亚硝酸盐可以被真菌分解利用, 但却对细菌有毒性, 会抑制细菌生长.
风速(WS)与细菌基因拷贝数呈负相关, 但与α-多样性指数呈正相关, 因为强风会清除掉空气中的悬浮颗粒物, 从而降低细菌浓度, 但同时强风也会带来较远距离源的细菌, 从而增加细菌群落的多样性和均匀度.Ca、Fe和Mg是细菌生长所需要的营养物质, 因此与细菌α-多样性指数呈正相关, 但过多的营养物质会引起细菌群落中对营养物质的竞争, 最终降低养分的有效性, 导致整体细菌浓度下降.有趣的是Pb与细菌基因拷贝数呈正相关, 该元素的主要来源是汽车尾气, 说明交通活动或人类活动的增长, 会提高大气中细菌的浓度, 但同时会降低细菌的α-多样性, 具体机制有待进一步研究.
V、Mn和硝酸盐是真菌生长所需的微量元素和营养物质, 其与真菌α-多样性指数呈正相关, 与基因拷贝数呈负相关, 同样可能是营养物质增多引起的真菌群落对营养物质的内部竞争所致.Cl-多用于给水消毒的化学物质中, 会造成真菌的应激损伤, 因此与基因拷贝数和α-多样性指数均呈负相关.值得注意的是, PM10与真菌的基因拷贝数和α-多样性指数均呈负相关, 可能的解释是真菌在大气中主要以孢子形式存在, PM10浓度增加, 会导致真菌孢子更多地依附在PM10颗粒上, 这会加速真菌的沉降, 同时PM10上携带的化学物质也会抑制真菌的生长.
2.4 细菌与真菌中微生物致病菌通过高通量测序获得的16S和ITS基因序列不足以进行物种级别分类, 因此在属水平上对过敏原和病原体进行了鉴定.
在细菌中, 鉴定到的致病菌共6种, 分别为：不动杆菌属(Acinetobacter, 16.19%)、链球菌属(Streptococcus, 0.25%)、肠杆菌属(Enterobacter, 0.50%)、假单胞菌属(Pseudomonas, 2.26%)以及少量的代夫特菌属(Delftia, 0.05%)和沙雷氏菌属(Serratia, 0.02%).不动杆菌属是一种条件致病菌, 可以引发肺部感染、呼吸机相关性肺炎和败血症[39].链球菌属可引发感染, 常见症状是休克、菌血症和急性呼吸窘迫综合征, 也可引发新生儿败血症和脑膜炎[40, 41].肠杆菌属不是人类的主要病原体, 但是跟大多数肠杆菌科一样, 它们能够在住院或虚弱的患者中引起机会性感染和菌血症[42, 43].假单胞菌属会引发乳制品的细菌性变质, 同时对菊花、生菜、茄子和芹菜等经济作物具有致病性[19].代夫特菌属通常被认为是非致病菌, 但可以引起抵抗力低下宿主的多种机会感染, 是人类少见的机会致病菌[44].沙雷氏菌属是引起医院内感染的重要条件致病菌[39].
在真菌中, 鉴定到了木霉属(Trichoderma, 0.17%)、链格孢属(Alternaria, 0.02%)和曲霉属(Aspergillus, 0.66%)这3种致病菌.木霉属代谢产生的单端孢霉烯毒素是某些农业商品和商业食品中不可避免的天然污染物, 会抑制蛋白质合成和免疫调节作用[45].链格孢属是一种常见真菌, 能在被其感染的植物、农产品和水果中产生多种霉菌毒素, 如格链孢酚、交链孢酚单甲醚和致病型链格孢菌毒素, 这些毒素可以成为食物污染物[46].曲霉菌属的一些菌种, 如烟曲霉菌既是机会病原体, 又是主要病原体和主要过敏源, 它的分生孢子产量很高, 会导致严重的哮喘和鼻窦炎[47].
为了研究关键环境因子对致病菌的影响, 分析了样品中致病菌与环境因子之间的相关性(图 5).结果表明, 不同细菌或真菌对环境因子有不同的响应.曲霉属与Sr呈显著正相关(P < 0.05, Spearman, 下同), 说明土壤是曲霉属的主要来源之一.肠杆菌属和链格孢属与NO2-呈显著正相关(P < 0.05), 两者可能都分解利用亚硝酸盐; 而链格孢属与AQI和PM10呈显著负相关(P < 0.05), 说明链格孢属对大气污染物较敏感.链球菌属与风速呈显著负相关(P < 0.01), 表明合肥市大气中链球菌属的源距采样点可能较远.
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**表示P < 0.01，*表示P < 0.05 图 5 合肥市大气颗粒物中致病菌与关键环境参数的相关性 Fig. 5 Correlation betweens pathogens and key environmental factors in atmospheric particulate matter in Hefei City |
(1) 不同粒径下细菌群落多样性无显著差异, PM10样品中的真菌群落多样性高于其它两种粒径.雨天细菌和真菌群落多样性均高于晴天.所有样品细菌群落多样性均高于真菌群落多样性.
(2) 合肥市大气中细菌优势菌门为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、蓝藻门和放线菌门, 真菌优势菌门为子囊菌门、担子菌门、被孢霉菌门和毛霉门.
(3) 土壤、植物叶片和动物粪便是合肥市大气中细菌群落的主要来源, 真菌群落的主要来源是植物叶片和土壤.
(4) 细菌群落主要受K、Pb、Al、Fe、Mg、Ca、Na+、NO2-和WS影响, 而真菌群落主要影响因素是V、Mn、Sr、NO2-、NO3-、Na+、Cl-、AQI和PM10.
(5) 在细菌序列中鉴定到了不动杆菌属(16.19%)、链球菌属(0.25%)、肠杆菌属(0.50%)、假单胞菌属(2.26%)、代夫特菌属(0.05%)、沙雷氏菌属(0.02%)共6种致病菌.在真菌序列中鉴定到了木霉属(0.17%)、链格孢属(0.02%)、曲霉属(0.66%)共3种致病菌.
| [1] | Yang L, Han L Z, Chen Z L, et al. Growing trend of China's contribution to haze research[J]. Scientometrics, 2015, 105(1): 525-535. DOI:10.1007/s11192-015-1668-5 |
| [2] | Li M N, Zhang L L. Haze in China: current and future challenges[J]. Environmental Pollution, 2014, 189: 85-86. DOI:10.1016/j.envpol.2014.02.024 |
| [3] | Huang R J, Zhang Y L, Bozzetti C, et al. High secondary aerosol contribution to particulate pollution during haze events in China[J]. Nature, 2014, 514(7521): 218-222. DOI:10.1038/nature13774 |
| [4] | Jaenicke R. Abundance of cellular material and proteins in the atmosphere[J]. Science, 2005, 308(5718). DOI:10.1126/science.1106335 |
| [5] | Bowers R M, Clements N, Emerson J B, et al. Seasonal variability in bacterial and fungal diversity of the near-surface atmosphere[J]. Environmental Science & Technology, 2013, 47(21): 12097-12106. |
| [6] | Jahne M A, Rogers S W, Holsen T M, et al. Emission and dispersion of bioaerosols from dairy manure application sites: human health risk assessment[J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49(16): 9842-9849. |
| [7] | Fung F, Hughson W G. Health effects of indoor fungal bioaerosol exposure[J]. Applied Occupational and Environmental Hygiene, 2003, 18(7): 535-544. DOI:10.1080/10473220301451 |
| [8] | Douwes J, Thorne P, Pearce N, et al. Bioaerosol health effects and exposure assessment: progress and prospects[J]. Annals of Occupational Hygiene, 2003, 47(3): 187-200. |
| [9] | Morawska L, Milton D K. It is time to address airborne transmission of coronavirus disease 2019 (COVID-19)[J]. Clinical Infectious Diseases, 2020, 71(9): 2311-2313. |
| [10] | Gao M, Jia R Z, Qiu T L, et al. Seasonal size distribution of airborne culturable bacteria and fungi and preliminary estimation of their deposition in human lungs during non-haze and haze days[J]. Atmospheric Environment, 2015, 118: 203-210. DOI:10.1016/j.atmosenv.2015.08.004 |
| [11] | Lee T, Grinshpun S A, Martuzevicius D, et al. Relationship between indoor and outdoor bioaerosols collected with a button inhalable aerosol sampler in urban homes[J]. Indoor Air, 2006, 16(1): 37-47. DOI:10.1111/j.1600-0668.2005.00396.x |
| [12] | Pace N R. A molecular view of microbial diversity and the biosphere[J]. Science, 1997, 276(5313): 734-740. DOI:10.1126/science.276.5313.734 |
| [13] | Després V R, Huffman J A, Burrows S M, et al. Primary biological aerosol particles in the atmosphere: a review[J]. Tellus B: Chemical and Physical Meteorology, 2012, 64(1). DOI:10.3402/tellusb.v64i0.15598 |
| [14] |
凌琪, 王晏平, 王莉, 等. 合肥城区空气微生物分布特征初步研究[J]. 环境与健康杂志, 2007, 24(1): 40-42. Ling Q, Wang Y P, Wang L, et al. Characteristics of outdoor air microbes pollution in Hefei City[J]. Journal of Environment and Health, 2007, 24(1): 40-42. |
| [15] | Bovallius A, Bucht B, Roffey R, et al. Three-year investigation of the natural airborne bacterial flora at four localities in Sweden[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1978, 35(5): 847-852. DOI:10.1128/AEM.35.5.847-852.1978 |
| [16] | Bowers R M, Lauber C L, Wiedinmyer C, et al. Characterization of airborne microbial communities at a high-elevation site and their potential to act as atmospheric ice nuclei[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(15): 5120-5130. |
| [17] | Du P R, Du R, Ren W S, et al. Seasonal variation characteristic of inhalable microbial communities in PM2.5 in Beijing city, China[J]. Science of the Total Environment, 2018, 610-611: 308-315. DOI:10.1016/j.scitotenv.2017.07.097 |
| [18] | Yu R L, Wang S K, Wu X L, et al. Community structure variation associated with airborne particulate matter at central south of China during hazy and nonhazy days[J]. Atmospheric Pollution Research, 2020, 11(6): 162-169. DOI:10.1016/j.apr.2019.05.016 |
| [19] | Xu C H, Wei M, Chen J M, et al. Bacterial characterization in ambient submicron particles during severe haze episodes at Ji'nan, China[J]. Science of the Total Environment, 2017, 580: 188-196. DOI:10.1016/j.scitotenv.2016.11.145 |
| [20] | Shi Y, Chen J M, Hu D W, et al. Airborne submicron particulate (PM1) pollution in Shanghai, China: chemical variability, formation/dissociation of associated semi-volatile components and the impacts on visibility[J]. Science of the Total Environment, 2014, 473-474: 199-206. DOI:10.1016/j.scitotenv.2013.12.024 |
| [21] |
王润芳, 马大卫, 姜少毅, 等. 超低排放改造后燃煤电厂细颗粒物排放特征[J]. 环境科学, 2020, 41(1): 98-105. Wang R F, Ma D W, Jiang S Y, et al. Fine particulate emission characteristics of an ultra-low emission coal-fired power plant[J]. Environmental Science, 2020, 41(1): 98-105. |
| [22] |
王步英, 郎继东, 张丽娜, 等. 基于16S rRNA基因测序法分析北京霾污染过程中PM2.5和PM10细菌群落特征[J]. 环境科学, 2015, 36(8): 2727-2734. Wang B Y, Lang J D, Zhang L N, et al. Characterizing Beijing's airborne bacterial communities in PM2.5 and PM10 samples during haze pollution episodes using 16S rRNA gene analysis method[J]. Environmental Science, 2015, 36(8): 2727-2734. |
| [23] | Bolyen E, Rideout J R, Dillon M R, et al. Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QⅡME 2[J]. Nature Biotechnology, 2019, 37(8): 852-857. DOI:10.1038/s41587-019-0209-9 |
| [24] | Callahan B J, McMurdie P J, Rosen M J, et al. DADA2: high-resolution sample inference from Illumina amplicon data[J]. Nature Methods, 2016, 13(7): 581-583. DOI:10.1038/nmeth.3869 |
| [25] | Katoh K, Misawa K, Kuma K I, et al. MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform[J]. Nucleic Acids Research, 2002, 30(14): 3059-3066. DOI:10.1093/nar/gkf436 |
| [26] | Price M N, Dehal P S, Arkin A P. FastTree 2-approximately maximum-likelihood trees for large alignments[J]. PLoS One, 2010, 5(3). DOI:10.1371/journal.pone.0009490 |
| [27] | Bokulich N A, Kaehler B D, Rideout J R, et al. Optimizing taxonomic classification of marker-gene amplicon sequences with QⅡME 2's q2-feature-classifier plugin[J]. Microbiome, 2018, 6(1). DOI:10.1186/s40168-018-0470-z |
| [28] | McDonald D, Price M N, Goodrich J, et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea[J]. The ISME Journal, 2012, 6(3): 610-618. DOI:10.1038/ismej.2011.139 |
| [29] | Gweon H S, Oliver A, Taylor J, et al. PIPITS: an automated pipeline for analyses of fungal internal transcribed spacer sequences from the Illumina sequencing platform[J]. Methods in Ecology and Evolution, 2015, 6(8): 973-980. DOI:10.1111/2041-210X.12399 |
| [30] | Toti D S, Coyle F A, Miller J A. A structured inventory of appalachian grass bald and heath bald spider assemblages and a test of species richness estimator performance[J]. The Journal of Arachnology, 2000, 28(3): 329-345. DOI:10.1636/0161-8202(2000)028[0329:ASIOAG]2.0.CO;2 |
| [31] | Burch M, Levetin E. Effects of meteorological conditions on spore plumes[J]. International Journal of Biometeorology, 2002, 46(3): 107-117. DOI:10.1007/s00484-002-0127-1 |
| [32] | Prenni A J, Tobo Y, Garcia E, et al. The impact of rain on ice nuclei populations at a forested site in Colorado[J]. Geophysical Research Letters, 2013, 40(1): 227-231. DOI:10.1029/2012GL053953 |
| [33] | Huffman J A, Prenni A J, DeMott P J, et al. High concentrations of biological aerosol particles and ice nuclei during and after rain[J]. Atmospheric Chemistry and Physics, 2013, 13(13): 6151-6164. DOI:10.5194/acp-13-6151-2013 |
| [34] | Lee S A, Liao C H. Size-selective assessment of agricultural workers'personal exposure to airborne fungi and fungal fragments[J]. Science of the Total Environment, 2014, 466-467: 725-732. DOI:10.1016/j.scitotenv.2013.07.104 |
| [35] | Franzetti A, Gandolfi I, Gaspari E, et al. Seasonal variability of bacteria in fine and coarse urban air particulate matter[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 90(2): 745-753. DOI:10.1007/s00253-010-3048-7 |
| [36] | Cao C, Jiang W J, Wang B Y, et al. Inhalable microorganisms in Beijing's PM2.5 and PM10 pollutants during a severe smog event[J]. Environmental Science & Technology, 2014, 48(3): 1499-1507. |
| [37] | Huang Q, McConnell L L, Razote E, et al. Utilizing single particle Raman microscopy as a non-destructive method to identify sources of PM10 from cattle feedlot operations[J]. Atmospheric Environment, 2013, 66: 17-24. DOI:10.1016/j.atmosenv.2012.08.030 |
| [38] | Zhai Y B, Li X, Wang T F, et al. A review on airborne microorganisms in particulate matters: composition, characteristics and influence factors[J]. Environment International, 2018, 113: 74-90. DOI:10.1016/j.envint.2018.01.007 |
| [39] |
苟欢歌, 谢纯斌, 童延斌, 等. 石河子市春季大气颗粒物TSP和PM10中微生物群落特征[J]. 环境工程学报, 2017, 11(4): 2343-2349. Gou H G, Xie C B, Tong Y B, et al. Assessment of microbial communities in TSP and PM10 of Shihezi during spring[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2017, 11(4): 2343-2349. |
| [40] | Lin F Y C, Weisman L E, Troendle J, et al. Prematurity is the major risk factor for late-onset group B streptococcus disease[J]. The Journal of Infectious Diseases, 2003, 188(2): 267-271. DOI:10.1086/376457 |
| [41] | Stevens D L. Invasive group A streptococcus infections[J]. Clinical Infectious Diseases, 1992, 14(1): 2-13. DOI:10.1093/clinids/14.1.2 |
| [42] | Bodey G P, Elting L S, Rodriguez S. Bacteremia caused by Enterobacter: 15 years of experience in a cancer hospital[J]. Reviews of Infectious Diseases, 1991, 13(4): 550-558. DOI:10.1093/clinids/13.4.550 |
| [43] | Gaston M A. Enterobacter: an emerging nosocomial pathogen[J]. Journal of Hospital Infection, 1988, 11(3): 197-208. DOI:10.1016/0195-6701(88)90098-9 |
| [44] |
李金钟, 刘利平. 代夫特菌属的研究进展[J]. 中国热带医学, 2008, 8(12): 2254-2255, 2262. Li J Z, Liu L P. Advance of study in Delftia[J]. China Tropical Medicine, 2008, 8(12): 2254-2255, 2262. DOI:10.3969/j.issn.1009-9727.2008.12.108 |
| [45] | Sudakin D L. Trichothecenes in the environment: relevance to human health[J]. Toxicology Letters, 2003, 143(2): 97-107. DOI:10.1016/S0378-4274(03)00116-4 |
| [46] | Vaquera S, Patriarca A, Pinto V F. Influence of environmental parameters on mycotoxin production by Alternaria arborescens[J]. International Journal of Food Microbiology, 2016, 219: 44-49. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2015.12.003 |
| [47] | Nierman W C, Pain A, Anderson M J, et al. Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus[J]. Nature, 2005, 438(7071): 1151-1156. DOI:10.1038/nature04332 |