2021, Vol. 42
2. 山西大学环境与资源学院, 太原 030006
2. School of Environment and Resources, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
环境条件在土壤微生物群落构建过程中发挥重要作用[1].工业革命以来, 采矿业及其下游产业发展使得土壤中重金属含量剧增, 这对土壤微生物群落的结构与功能造成了很大影响.在重金属污染的影响下, 土壤微生物群落会重新构建[2, 3].基于实验室重金属与微生物群落关系的研究发现, 短期重金属污染胁迫会降低土壤微生物的丰度和多样性[2~4], 而长期受重金属污染的土壤中, 土壤微生物的丰度和多样性反而会有所回升[5].
不同土地利用方式会影响土壤微生物群落的丰度与组成, 这是由于土壤的理化性质会随土地利用方式的改变而改变[6].土壤真菌群落是土壤微生物的重要组成, 其群落动态主要受地上植被的影响[7].通常, 在重金属胁迫条件下, 真菌比细菌具有更强的重金属抗性[8, 9], 且真菌群落的碳源利用功能多样性的下降要远低于细菌群落[10].由于真菌群落的这些特性, 其已成为重金属污染区生物修复研究的重要对象.然而到目前为止, 长期土壤重金属污染条件下, 不同土地利用方式对真菌群落结构与功能的影响尚不明确.因此, 本文在长期受重金属污染的尾矿区开展不同土地利用方式下真菌群落结构与功能多样性的研究, 对深刻理解重金属污染在真菌群落构建中的作用以及重金属污染区生态修复具有重要意义.
本研究拟对长期受重金属污染的铜尾矿坝及其周边区域的土壤真菌群落开展以下3个方面研究：①不同土地利用类型土壤中真菌群落的结构差异; ②土壤真菌群落对不同碳源的利用方式有何不同; ③土壤真菌群落多样性与环境因子的响应关系如何.
1 材料与方法 1.1 研究区概况及土壤样品采集研究区(35°15′N, 111°39′E)位于山西省南部的铜尾矿坝及其周边地区, 为暖温带大陆季风性气候, 年平均气温14℃, 年平均降雨量780 mm, 年无霜期超过200 d[11].在尾矿坝的底部, 有一条由尾矿库渗流水形成的河道.本研究选取尾矿坝及河道两边的4个样地作为研究对象, 分别为TD0、TD1、TD2和TD3(图 1).TD0位于尾矿坝上, 主要植被类型为一年生草本; TD1位于大坝底部, 主要植被类型为15 a杨树林(Populus deltoids cv.‘zhonghuahongye’); TD2土地利用类型为农田, 与TD1相邻, 作物类型为冬小麦和秋玉米轮作; TD3距大坝最远, 主要植被类型为10 a杨树林(Populus deltoids cv.‘zhonghuahongye’).
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图 1 研究区样地设置示意 Fig. 1 Sampling sites in the study area |
土壤样品采集于2016年6月, TD2样地的冬小麦收获后.TD0样地中随机取得3个土壤样品, 其余3个样地中分别随机采取9个土壤样品.所有土壤样品用冰袋保存于保温箱并迅速转移回实验室, 过2 mm筛, 去除杂草根系等, 使之完全均一化后分成两部分.一部分置于4℃保存, 一部分风干进行理化性质分析.
土壤pH值(土水比为1∶2.5)用pH计测定(HI3221, Italy).土壤总碳(TC)、总氮(TN)和总硫(TS)由元素分析仪(vario macro cube, elementar, Germany)测定.采用HNO3-HF-H2O2法[12]对土壤样品进行消解, 采用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES, iCAP 6000, Thermo Fisher, UK)对消解液中的重金属进行测定.本课题组前期已对研究区各样地土壤理化性质和重金属含量进行了相关分析和报道(表 1)[13].
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表 1 研究区各样地的土壤理化性质1) Table 1 Soil physicochemical characteristics and heavy metal contents at each sampling site |
1.2 土壤DNA提取、真菌群落ITS rDNA定量和扩增子测序
使用Qiagen DNeasy PowerSoil试剂盒(Qiagen, Carlsbad, CA, USA)从0.25g新鲜土壤中提取土壤总DNA, 提取步骤参照试剂盒说明书.采用LineGene9600plus型荧光定量PCR仪(博日, 中国南京诺唯赞生物科技有限公司)对样本中ITS1区进行定量.
采用ABI GeneAmp® 9700 PCR仪(美国)对土壤真菌rDNA的ITS1区进行扩增以进行多样性分析, 扩增产物纯化并测定浓度(NanoDrop)后在Illumina MiSeq平台上测序.在97%的相似水平上, 采用RDP classifier贝叶斯算法对获得的高质量序列中的OTU代表序列进行分类学分析, 并与Silva数据库进行比对, 获得各分类学水平上的群落信息.
荧光定量、高通量测序和生信分析均在上海美吉生物医药科技有限公司完成.
1.3 真菌碳源利用功能多样性分析采用Biolog FF MicroPlate对真菌的碳源代谢活性和功能多样性进行分析, Biolog FF MicroPlate包括95种碳源和1个对照孔, 以碘硝基四唑紫(iodonitrotetrazolium violet)作为底物利用指示剂.Biolog FF微平板的95种碳源可以分为8大类[14], 包括碳水化合物(carbohydrates, 29种)、羧酸类(carboxylic acids, 20种)、氨基酸类(amino acids, 10种)、糖苷类(glycosides, 4种)、聚合物类(polymers, 5种)、多元醇类(polyols, 10种)、胺和酰胺类(amines and amides, 9种)和其它类碳源(miscellaneous, 8种).本实验步骤如下：将4℃下保存的土壤样品的水分含量调整至土壤最大充水空隙(water-filled pore space, WFPS)的60%并在25℃下暗培养, 一周后称取相当于5 g干土的土壤, 加入45 mL 0.9%的无菌生理盐水, 同时按照100 mg·L-1的比例加入土霉素(Oxytetracycline)以去除细菌的干扰, 振荡1 h后静置约0.5 h, 使用无菌生理盐水将悬浊液逐步稀释至10-2, 用排枪将130 μL的稀释液加入Biolog FF MicroPlate各反应孔中, 将130 μL的无菌生理盐水加入Biolog FF MicroPlatee的对照孔中.所有加好样的Biolog FF MicroPlate置于25℃下暗培养, 从第0 d算起, 每隔24 h使用Infinite 200 PRO (TECAN, Sweden)在490 nm下测定其吸光度, 共测定12 d, 根据平均颜色变化率(average well color development, AWCD), 选择真菌群落生长平台初期(第10 d)吸光度值进行真菌碳源利用功能多样性分析.AWCD和功能多样性指数使用如下公式计算：
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式中, C表示Biolog FF MicroPlate各碳源的吸光度值, R表示Biolog FF MicroPlate中对照孔吸光度的平均值.Pi表示第i孔C-R值(ni)与所有孔C-R总和的比率.S表示有颜色变化的孔的数目.
1.4 数据分析采用单因素方差分析(One-way ANOVA)对不同样地间真菌群落丰富度、多样性、碳源利用效率和碳源代谢多样性等进行差异性检验, 并通过Duncan检验进行多重比较.采用主成分分析(PCA)对不同样地的真菌群落的碳源利用方式进行排序.采用Spearman相关分析来检验环境因子、碳源利用效率与优势类群之间的相关性.
方差分析、PCA分析和Spearman相关性分析分别采用IBM SPSS Statistics 19、Canoco5.0和R 3.4.4实现.
2 结果与分析 2.1 真菌群落的结构多样性研究区土壤样品中共测得863 391条高质量有效序列.分类学分析表明, 在97%的相似性水平上, 共优化得到2 685个真菌OTU单元, TD0、TD1、TD2和TD3的OTU个数分别是870、1 624、804和1 464.这些OTU单元中包含13个门、44个纲、101个目、235个科、472个属和775个种.ITS rDNA定量结果表明, TD1样地的真菌丰度显著高于TD0样地(P < 0.05, 表 2).TD0样地的Chao1丰富度指数、Shannon多样性指数和Shannoneven均匀度指数均表现为最低; TD1样地的这些指标均表现为与TD0相反的特征; 方差分析表明, 研究区真菌群落多样性指标样地间的差异性均达到了显著性水平(P < 0.05).
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表 2 研究区土壤真菌群落的丰度与多样性指数1) Table 2 Abundance and species diversity of soil fungal communities in the study area |
研究区共有优势真菌门3个(相对丰度大于1%, 图 2), 分别为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota).其中, 子囊菌门(Ascomycota)在4样地中均有最高分布, 在TD0样地真菌群落中占比最高, 达92.92%, 而在TD3样地中占比最低, 达到48.80%, 其各样地中的相对丰度均显著高于其它类群(P < 0.05).TD0和TD2样地的子囊菌门(Ascomycota)显著高于其它两样地; TD1样地中的被孢霉门(Mortierellomycota)显著高于其它3样地(图 3).
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图 2 真菌优势类群在各样地中的占比 Fig. 2 Percentage of the dominant taxa at each sampling sites |
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大写字母表示同一样地对不同真菌类群的差异性(P < 0.05), 小写字母表示同种真菌类群在不同样地间的差异性(P < 0.05) 图 3 门水平不同样地间土壤优势真菌类群比较 Fig. 3 Differences among the dominant fungi taxa in different sample sites |
研究区真菌群落的AWCD变化表明, TD1样地的AWCD增长最快, TD2样地真菌群落AWCD增长最慢(图 4).采用第10 d(平台期)的AWCD值进行真菌群落碳源利用功能多样性的分析.
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图 4 不同样地土壤真菌群落Biolog FF MicroPlate培养过程中平均颜色变化率(AWCD)的动态变化 Fig. 4 Changes of average well color development (AWCD) during Biolog FF MicroPlate culture in different sampling sites |
TD1样地的AWCD、Shannon多样性指数、Shannoneven均匀度指数和McIntosh多样性指数均显著高于其它3个样地(P < 0.05), TD2样地的这些指数最低(表 3).
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表 3 研究区土壤真菌群落的功能多样性指数1) Table 3 Soil fungal functional diversity of carbon source utilization in study area |
不同样地对8类碳源的利用强度有显著差异(图 5).TD0样地的真菌群落对糖苷类碳源的利用强度显著高于其它样地, 对糖苷类和多元醇类碳源的利用强度显著高于其余碳源类型; 除糖苷类外, TD1样地的真菌群落对其余7类碳源的利用强度均显著高于其它样地, 对聚合物类、胺与酰胺类和其它类碳源的利用强度显著低于其它5类碳源; 4样地中, TD2样地的真菌群落对碳水化合物类、羧酸类、氨基酸类和多元醇类的利用强度最低, 对碳水化合物类、聚合物类、胺与酰胺类碳源的利用强度显著高于其它类碳源类型; 较之其它样地, TD3样地的真菌群落对糖苷类、聚合物类、胺与酰胺类和其它类碳源类型利用强度最低, 对碳水化合物类碳源的利用强度最高.
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大写字母表示同一样地对不同类型碳源利用强度的显著性差异(P < 0.05), 小写字母表示不同样地相同类型碳源利用强度的显著性差异(P < 0.05) 图 5 不同样地中土壤真菌群落碳源代谢强度 Fig. 5 Carbon utilization intensity of soil fungi community in different sampling sites |
PCA结果表明, 碳源利用对于研究区真菌群落的分异作用中共提取到4个主成分, 第1、2主成分共可解释75.73%(图 6), 有23种碳水化合物类、17种羧酸类、7种氨基酸类、5种糖苷类、4种聚合物类、8种多元醇类、9种胺与酰胺类和8种其它类碳源在第1、2主成分中起重要作用(表 4).
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图 6 不同样地土壤真菌群落碳源代谢的主成分分析 Fig. 6 Principle component analysis for carbon utilization of soil fungi community in different sampling sites |
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表 4 研究区土壤真菌碳源代谢主成分载荷1) Table 4 Loading matrix of principal components |
2.3 真菌群落多样性与环境因子相关性分析
土壤pH值、土壤TC和所有群落多样性指数间表现出显著的相关性(P < 0.05), 而土壤TN仅与ITS rDNA之间发现显著的相关性(表 5); 重金属As、Cd和所有群落多样性指数间具有显著相关性, 未发现其余重金属与群落多样性指数之间的显著相关性(P>0.05).
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表 5 土壤真菌群落多样性与环境因子之间的相关性1) Table 5 Correlations between soil physicochemical characteristics and the fungal diversity index, respectively |
土壤pH值和担子菌门(Basidiomycota)之间具有显著相关性(P < 0.05), 土壤TC、TN与子囊菌门(Ascomycota)显著负相关, 而与担子菌门(Basidiomycota)显著正相关[图 7(a)].土壤N与土壤真菌群落对糖苷类碳源的代谢强度间显著负相关(P < 0.05)[图 7(b)]; 重金属Cu与糖苷类、羧酸类和聚合物类碳源的代谢强度间显著正相关, Cd与其它类碳源的代谢强度间显著正相关; 其它环境因子与各碳源代谢强度间未见显著相关性.
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(a)优势门, (b)碳源利用类型; a1表示Ascomycota, a2表示Basidiomycota, a3表示unclassified_k__Fungi, a4表示Mortierellomycota; b1表示胺与酰胺类碳源, b2表示其它类碳源, b3表示碳水化合物类碳源, b4表示氨基酸类碳源, b5表示羧酸类碳源, b6表示多元醇类碳源, b7表示聚合物类碳源, b8表示糖苷类碳源; *表示P < 0.05水平相关; **表示P < 0.01水平相关; ***表示P < 0.001水平相关 图 7 研究区真菌群落优势门、碳源利用类型与环境因子之间的相关性 Fig. 7 Correlations of the soil physicochemical characteristics with the dominant taxa in the phylum level, carbon source utilization intensity, respectively |
子囊菌门(Ascomycota)与糖苷类碳源的代谢强度间显著正相关(P < 0.05), 担子菌门(Basidiomycota)与糖苷类、聚合物类碳源的代谢强度间显著负相关(P < 0.05, 表 6).
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表 6 土壤真菌群落优势门与碳源利用强度之间的相关性 Table 6 Correlations between the carbon source types and the dominant fungal taxa in phylum level, respectively |
3 讨论 3.1 重金属污染区的真菌群落
研究区真菌群落的丰度与α多样性在样地间具有显著差异.在重金属含量最高与潜在生态风险最大的TD1样地(表 1), 真菌群落具有显著高于其它样地的丰度, 群落多样性指数在样地间差异显著(表 2), 同时, 真菌群落的这些指数均与土壤TC显著相关(表 5).土壤有机质的含量与微生物群落结构密切相关, 土壤TC的升高会有效提高微生物的丰富度[15], 而植被重建亦有助于土壤TC的积累[16].TD1样地和TD3样地的重建植被分别为15 a和10 a杨树林, 据报道, 杨树可与多种真菌共生形成外生菌根而提升其抗逆性[17], 如担子菌门(Basidiomycota)中的笼头菌属、鹅膏菌属、木耳属、口蘑属和硬皮马勃属中的许多种均可与杨树形成共生.研究区的优势种中, TD1样地和TD3样地的担子菌门(Basidiomycota)分别占到了本样地OTU总数的9%和31.62%(图 2), 这对提升杨树林的抗逆性有很大帮助, 同时很大程度上提高了杨树林对土壤碳汇的贡献.本研究发现, TD1和TD3样地的土壤TC显著高于其它两样地(表 1).
研究区土壤中含量较高的重金属Cu和As并未发现与真菌群落丰富度和多样性指数之间的显著相关性, 仅发现重金属Cd与真菌群落参数之间的显著相关性.在杨树-外生菌根真菌的共生体系中, 外生菌根真菌体内的Cd含量与土壤中的总Cd含量相关, 同时, 外生菌根并未影响土壤中Cd在杨树体内的富集[18].这意味着该共生体系对重金属Cd具有富集作用.研究表明, 在对Cd有富集作用的植物-外生菌根真菌共生体系中, 丝盖伞属(Inocybe)内的许多种在金属污染的矿区中经常被发现[19].TD1和TD3样地中, 丝盖伞属(Inocybe)分别占到了0.5%和22.3%(图 2), 而其它样地中未见分布.
由于真菌具有较强的重金属耐性, 其在重金属污染区的生态恢复过程中可能发挥着重要作用[20].本研究区真菌优势类群中, 子囊菌门(Ascomycota)在各样地中均有最大分布(图 3), 这与许多之前的研究相一致[21, 22].子囊菌门是世界上分布最为广泛、丰度最高的真菌类群[23], 这与该类群的代谢特性及在多种生境中生存的能力有关, 其在中等重金属污染水平下重金属耐性会明显升高[21].本研究发现, 在重金属污染状况最为严重的两个杨树林样地(表 1), 子囊菌门的相对丰度显著低于坝体草地(TD0)和农田(TD2)样地, 而TD0和TD1样地中, 担子菌门(Basidiomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota)的相对丰度均较高(图 3).这可能是不同重金属污染程度对真菌群落中物种选择的结果[24], 然而本研究并未发现这些优势类群和重金属之间的显著相关性.尾矿区土壤是一个多金属污染的复杂的系统, 重金属污染与真菌群落之间的定量受到多种因素的影响, 厘清二者之间的响应关系的探索还需多金属协同的控制实验与非线性模型的探索.
3.2 真菌群落多样性与功能多样性研究区真菌功能多样性的结果显示, 不同样地的碳源代谢强度(AWCD)间有显著差异(图 5和6).在群落多样性高的TD1样地, 同样也有最高的真菌活性(表 2和3).该样地真菌碳源利用的AWCD和各种多样性指数均显著高于其它3样地.理论上讲, 在群落多样性较低的TD0样地, 微生物活性和碳源利用强度应该最低, 然而, TD0样地的碳源代谢强度却显著高于TD2和TD3样地(表 3), 且TD2对于多数碳源类型的代谢强度为最低(图 5).王蕊等在不同土地利用类型对真菌群落代谢特征的研究中也有类似的发现[25].一般来说, 植物根际会有很高的微生物活性[26, 27], 对于微生物来说, 植物根系是一种很好的碳源, 因为根系滤出液比固态有机物和腐殖质更易利用[28, 29].TD2样地的土地利用类型是农田, 本研究的采样期为小麦收获后, 样地内活根短缺, 而TD0样地为当年生草本, 采样期内活根正处于生长期.糖苷类碳源是根系分泌物中能被微生物利用的一种碳源类型[14], TD0样地真菌群落对糖苷类碳源的代谢强度显著高于其它样地(图 5), 这也间接说明TD0样地碳源利用强度的增高是真菌群落对不同碳源的选择利用的结果.另一方面, 真菌群落结构影响群落对碳源代谢的强度, 本研究发现, 子囊菌门(Ascomycota)在TD0样地的真菌群落中比重达92.92%, 其与糖苷类碳源表现出极显著相关(表 6); 而作为杨树外生菌根重要组成的丝盖伞属(担子菌门)在TD0样地中并未见分布.微生物的丰度决定了其在复杂生态系统中的功能与作用[30], 研究区各样地中真菌丰度的不同在碳源代谢功能多样性中也起到了重要作用.
4 结论(1) 15 a杨树林样地具有最高的真菌群落丰度和多样性, 植被重建和高土壤总碳含量是主要原因.
(2) 子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota)是研究区的优势真菌类群.担子菌门(Basidiomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota)在很大程度上提高了杨树林对土壤碳汇的贡献.
(3) 研究区土壤重金属中, 重金属Cd是影响研究区真菌群落参数的主要因素.
(4) 15 a杨树林样地真菌群落碳源利用效率最高, 而坝体草地真菌群落对糖苷类碳源的高强度利用使其具有了相对较高的碳源利用效率.
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