2021, Vol. 42
厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX)是一种通过厌氧氨氧化菌(AAOB)实现的以NH4+-N为电子供体, NO2--N为电子受体的生物反应[1].因其脱氮负荷高、生物反应器占地面积小及无需有机碳源等优点, 被认为是当前最具可持续发展潜力的污水生物脱氮技术[2, 3].AAOB及其伴生菌主要以颗粒污泥的形式存在[4].厌氧氨氧化颗粒污泥(AnGS)的形成不仅能减少菌体流失还提高了反应速率.粒径是影响颗粒污泥结构和系统稳定性的重要参数[5].粒径差异使AnGS产生了不同的物质组分和微生物多样性[6], 决定了其主导功能.有研究指出, 大颗粒显著提高了ANAMMOX工艺的性能, 因其能够形成AAOB的高丰度[7, 8].然而, 小颗粒可以克服大颗粒因N2产量增多上浮, 对反应器性能的不良影响.Chen等[9, 10]的研究认为, 粒径过大时, 由于传质受阻颗粒中会形成死区, 导致AnGS崩解.
培养条件的不同导致了ANAMMOX系统的最佳粒径存在着从微米到毫米的不一致性[11, 12], 然而AnGS系统高效脱氮的本质是微生物群落的协同作用, 通过群落优化, 调控污水处理系统的性能[13].因此, 全面了解AnGS形成过程中微生物群落特征、演变规律及菌群间的相互作用, 对阐明颗粒污泥高效脱氮的生物学机制更为重要.
此外, 目前研究多集中于AnGS处理低强度污水的性能, 对高氨氮系统中形成的更大尺寸颗粒的认识有限.特别是基于粒径分化的菌群变化特点和其性能的联系认识较少, 这阻碍了AnGS系统在多种处理条件下的广泛应用.
因此, 本研究在ANAMMOX絮体污泥形成颗粒过程中, 选取广泛的粒径范围(R0:＜0.6 mm、R1:0.6~1.18 mm、R2:1.18~2.8 mm、R3:2.8~4.75 mm和R4:＞4.75 mm), 研究其形态和活性变化.采用高通量16S rRNA基因测序, 在分类学和代谢功能水平上阐明粒径分化带来的差异, 建立污泥特性与微生物组成之间的关系, 以期为高负荷AnGS废水处理系统的优化和基于粒径的反应机制提供有价值的信息.
1 材料与方法 1.1 污泥来源本研究ANAMMOX污泥收集自实验室稳定运行1 a的上流式生物滤池反应器[14].反应器有效容积10.89 L, 内径17 cm, 液体上升流速2.65 m·h-1, 总氮去除负荷(NRR)为(5.64±0.2)kg·(m3·d)-1.体系温度控制在25~28℃, 进水不进行除氧, pH值为7.6±0.2.
1.2 污泥的分组ANAMMOX污泥的分组采用湿式筛选法.收集反应器内污泥, 将它们经过目数为4、7、14和28的筛网, 得到4组不同粒径(R1:0.6~1.18 mm、R2:1.18~2.8 mm、R3:2.8~4.75 mm、R4:＞4.75 mm)的颗粒污泥和絮状污泥(R0:＜0.6 mm).收集5组污泥样本分别进行各项性能的实验研究.
1.3 检测项目及方法 1.3.1 水质指标测定水质测定采用国家标准方法[15]: NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法, NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法, NO3--N采用紫外分光光度法. 数码相机拍照观察颗粒形态.
1.3.2 厌氧氨氧化活性测定比厌氧氨氧化活性(SAA)根据混合液样品中NH4+-N和NO2--N随时间的消耗率进行分批测定.实验前用磷酸盐缓冲溶液清洗污泥样本2~3遍, 去除残留基质.将R0~R4分别加入120mL的血清瓶中, 调节瓶内MLVSS为1.5 g.分别在高和低底物浓度下进行活性测定, 反应液的NH4+-N和NO2--N初始浓度分别为200 mg·L-1和250 mg·L-1及100 mg·L-1和132 mg·L-1, 配合合成废水的组成[14]以及微量元素溶液Ⅰ和Ⅱ[16]各1.25 mL·L-1.加入稀硫酸溶液调节初始pH至7.5.通过取样管充氮5 min, 保证体系处于厌氧状态, 然后在(32±1)℃恒温摇床(ZHWY-2102C, China)中进行生化实验, 摇床转速为80 r·min-1.每隔2 h(高底物浓度)或1h(低底物浓度)测定反应液中氮素含量, 绘制底物的降解曲线, 斜率除以生物量浓度得到SAA.实验进行3次, 结果取平均值.
1.3.3 高通量测序及分析采用高通量Illumina MiSeq测序平台(Illumina, San Diego, USA)分析ANAMMOX污泥的微生物多样性及相互联系.
样本(R0~R4)用磷酸盐缓冲液洗涤3次, 经过液氮碾磨预处理后, 利用土壤DNA快速提取试剂盒(Bio101, Vista, CA)从样本中提取DNA.采用NanoDrop 2000分光光度计测量DNA浓度.对细菌16S rRNA基因V3-V4区进行扩增, 引物分别为341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R (GACTA CHVGGGTATCTAATCC).采用Illumina HiSeq 2500 PE250进行测序, 测序数据使用MEGAN软件进行微生物的16S分析, 按照97%的识别阈值分组为序列聚类操作分类单元(OTUs).得到的结果使用R软件的工具包进行分类学分析, 主要包括α多样性分析、物种多样性分析、功能预测分析和基于主坐标分析(Principal co-ordinates analysis, PCoA)的β多样性分析和菌群差异分析.利用Hemi软件获得样本中微生物各个水平上的物种组成和功能基因热图, 使结果可视化.
2 结果与讨论 2.1 污泥性质 2.1.1 污泥形态图 1反映了ANAMMOX污泥样本的形态特征.可见, ANAMMOX絮体污泥及颗粒污泥均表现出AAOB典型的红褐色, 这说明AAOB富集程度较高.颗粒污泥结构密实, 轮廓清晰, 呈“铁红花椰菜”状.小颗粒较光滑, 质地较软, 大颗粒表面有菌簇形成.这意味着AAOB在胞外聚合物(EPS)创建的凝胶网络下聚集成团, 使粒径不断增加, 同时, 颗粒结构的稳定性得到增强[17, 18].并且, 未成熟的小颗粒颜色较浅, 而较大的颗粒颜色加深.分析由于大颗粒受底物供应限制, 饥饿状态下SO42-可以作为电子受体促进Limnobacter生长[19], 并产生FeS化合物所致, 这将在2.3.2节进一步解释.
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图 1 厌氧氨氧化絮体污泥和颗粒污泥 Fig. 1 Anaerobic ammonium oxide floc sludge and granular sludge |
样本SAA的变化如图 2所示(分别以NH4+-N、NO2--N和TN表示).总体来说, SAA随着AnGS的形成和粒径的增大而逐步提高.由图 2(a)可知, R0和R1的活性处于一个较低的水平, 仅为117.2mg·(g·d)-1(以下均以TN计)和131.2mg·(g·d)-1.R2~R3显著升高, 并且R3的SAA是R0的3倍.R4的SAA最高达到426.8mg·(g·d)-1, 但增长趋势略有下降.分析原因, 较大颗粒聚集了更多的AAOB, 其“密度效应”得以发挥, 代谢旺盛, 因此获得了更高的脱氮效能.
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图 2 比厌氧氨氧化活性与氮元素化学计量比 Fig. 2 SAA and stoichiometric ratio of nitrogen element |
然而, 此前研究认为[20], 厌氧氨氧化活性主要发生于颗粒污泥表面1 mm厚度的范围内, 当粒径过大时, 由于反应深度有限, 抑制了AAOB的活性[21].本研究AnGS的最大尺寸超过4.75 mm, SAA能持续提高或许是由于随着颗粒聚集, AAOB产气量增多, 颗粒内部形成的气穴孔隙的双重作用[10, 11].这些孔隙可以作为底物运输的通道, 有利于基质进入颗粒污泥内部, 在一定程度上缓解了传质作用的不利影响.但SAA增长趋势的减缓也预示着颗粒污泥结构的变化, 由此推测, 极大颗粒R4内部的底物分布是不均匀的: 靠近孔隙地带传质较好, 而颗粒深处的AAOB面临底物不足的危机, 限制了其活性的表达.
此外, 杨明明等[22]的研究指出, EPS的含量与厌氧氨氧化颗粒污泥的粒径大小呈正相关关系, 这表明较大的颗粒污泥会分泌更多的EPS.较多的EPS含量有利于AAOB细胞间的互相聚集及细胞交流[23, 24], 继而增强细胞的代谢和活性.据此推测, 伴随着R2~R3的ANAMMOX活性迅速提高, 黏性较强的EPS大量积累, 增加了基质向颗粒内部的传递阻力[25], 使SAA增长出现缓坡.这种限制更显著地反映在低浓度底物作用下SAA的变化[图 2(b)].对比高浓度底物, 大颗粒(R3和R4)在低浓度下的优势减弱.除了长期培养AnGS对高基质浓度环境的适应性外, EPS对底物运输的限制作用也值得考虑, 这使得颗粒污泥的基质亲和常数相对较高[26], 即需要较高的基质浓度来实现高效ANAMMOX反应速率.这也意味着, 粒径较大的AnGS拥有更强的抵抗负荷冲击的能力.综上, SAA随着AnGS粒径增加和结构的完善而提高, 但增长率不是一个定值.由于尺寸对传质的限制, 本研究中R4的增长率开始减缓.
进一步分析ΔNO2--N/ΔNH4+-N和ΔNO3--N/ΔNH4+-N的比值发现, 各样本的比值都略小于ANAMMOX反应化学计量比的理论值, 但R2~R4更为接近, 稳定在1.22和0.2左右.氮转化途径决定着化学计量比的差异, 这表明在以ANAMMOX为主反应的前提下, 还同时存在着硝化和反硝化作用等多种脱氮途径[27], 对氮转化过程产生影响, 这将在2.2.2节中进一步分析.
2.2 微生物群落结构变化 2.2.1 微生物多样性和丰富度对5个样本进行高通量测序, 共产生251 607个序列, 表 1列出了各样本OTUs的数量及多样性指数.
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表 1 ANAMMOX污泥菌群的多样性指数变化 Table 1 Diversity index changes in the ANAMMOX sludge microbial community |
R0~R3的Simpson指数(反映样本中微生物多样性的指数)逐渐增加, 表明随着颗粒污泥形成, 群落多样性降低, R3形成了功能专一的群落结构.而代表物种丰富度的ACE指数和Chao1指数先增加后减少, 这说明不同菌属经历了对环境的适应和被环境淘汰的过程, 完成了菌群的建立和统一.值得关注的是, R4菌群的复杂度升高.这表明颗粒内微环境的变化, 为其他菌株的繁殖提供了条件.
Venn图更直观地统计了各样本共有和独有的OTU数目(图 3), 以了解它们的组成相似性及重叠情况.5个样本共有的OTU仅为111个, 说明在AnGS形成过程中, 菌群结构发生了显著变化.其中R0、R1、R2、R3和R4的特有OTU呈现大幅降低→大幅升高→小幅降低→小幅升高的变化趋势.可见, 随着颗粒污泥形成, 絮体污泥中许多微生物被淘汰, 之后短暂出现了一些与AnGS相关的菌群, 在微环境的选择与调节下, 颗粒结构不断优化.而R4特有OTU的增加预示着专一的颗粒结构面临失稳.
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图 3 微生物群落Venn图 Fig. 3 Venn diagram of microbial community |
样本门和属水平的微生物群落多样性如图 4所示.从门水平看[图 4(a)], 浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿菌门(Ignavibacteriae)、绿弯菌门(Chloroflexi)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)等相对丰度≥1%的8个优势菌门占比达到菌群总数的94%以上, 即属于典型ANAMMOX系统[28, 29].R0和R1的组成较相似, 变形菌门丰度均略高于浮霉菌门, 并且拥有菌群种类较丰富.而R2~R4的菌群结构更加单一, 杂菌门占比减小, AAOB所属的浮霉菌门成为绝对优势菌, 在R3中占比最高达到53.27%.这表明, 与悬浮污泥相比, AnGS进一步提高了群落的专一性, 同时随着粒径增大, 实现了菌种的筛选富集, 与ANAMMOX脱氮无关的菌群被淘汰.这与污泥SAA的增长趋势相符, 体现了其功能和结构的统一.然而, R4中浮霉菌门的相对丰度稍有下降, 为48.02%, 同时绿弯菌门增加.这与上文分析吻合, 绿弯菌门在自养脱氮系统中较为常见, 可以清除ANAMMOX产生的代谢产物并降解胞外蛋白[30, 31], 颗粒内部分功能菌的凋亡和EPS的积累解释了其升高原因.
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图 4 门和属水平微生物群落的多样性 Fig. 4 Microbial community diversity at phylum and genus levels |
属水平的Heatmap聚类分析更清晰地显示出ANAMMOX污泥由絮体到成熟颗粒的过程中, 菌群组成由复杂变为简单.值得关注的是, R0中存在Candidatus Kuenenia和Candidatus Brocadia两种AAOB, 而R1~R4中Candidatus Brocadia的比例极低(≤0.06%).这表明Candidatus Brocadia在絮体污泥中更为丰富, 而Candidatus Kuenenia聚集在颗粒中.这与Zheng等[32]的研究结果并不一致, 反应条件可能是造成差异的原因.研究表明, Candidatus Kuenenia可以耐受亚硝态氮浓度至少180 mg·L-1, 而Candidatus Brocadia[33]则是在70 mg·L-1.本实验进水负荷较高, 由2.1.2节结果可知, 颗粒污泥对高负荷更耐受, 因此颗粒中也富集了更能够适应高浓度的进水NO2--N浓度的Candidatus Kuenenia.随着粒径增大, Candidatus Kuenenia占比由31.63%上涨为52.7%.据报道, AAOB偏爱相对较大的粒子[7], 因此更大的颗粒也导致了AAOB的高丰度, 这与本研究结果基本一致.R4中AAOB相对丰度的下降则归因于粒径过大对颗粒结构的负面影响.可以发现, R4中异养菌增多, 这从微生物角度验证了过大尺寸AnGS内部存在底物供应不足区域, 引起AAOB衰亡, 凋亡的AAOB细胞作为营养物质加速了异养菌繁殖.
除AAOB外, AnGS中与氮转化有关的细菌还包括硝化细菌中的氨氧化菌(AOB)和反硝化细菌(DNB), 它们共同对脱氮过程产生影响.例如, AOB在R0和R1中含量较多, R2开始含量骤减, 可见AOB多以絮体形式存在, 也说明R2尺寸限制了氧传质[34].AOB包含的亚硝化单胞菌Nitrosomonas将NH4+-N转化为NO2--N, 这是使R0和R1中ΔNO2--N/ΔNH4+-N低于理论值的主要原因.此外, 短程反硝化菌Thauera(0.01%~0.3%)在厌氧条件下还原NO3--N为NO2--N, 亚氮积累也造成ΔNO2--N/ΔNH4+-N普遍偏小.出水NO3--N偏低则归因于具有部分反硝化作用的Pseudomonas, 其在R0中含量较高, 导致R0的ΔNO3--N/ΔNH4+-N偏离理论值最多(图 2).
同时, 各样本富含多种DNB, 并存在菌属的迁移与转化.R0和R1中含量极低的Limnobacter在R2和R4中增多, 即其在AAOB快速增长期和极大颗粒中出现.Limnobacter与硫相关, 饥饿状态下利用SO42-为电子受体生长[19], 由此, 在没有外部碳源的情况下, Limnobacter的富集一是源于AAOB代谢水平提高, 产物增多; 二是衰亡细菌产生的有机物, 二者作为内部碳源促进了异养菌生长.另一反硝化菌Ignavibacterium在R2和R3中占比减少, R4中增加.Ignavibacterium在ANAMMOX反应器普遍存在, 具有在好氧和厌氧环境中分解有机物的能力[35].这也为R4内部存在衰亡菌体提供了证据.另一方面, 这些潜在的DNB能生活在自养生物分泌的可溶性微生物产物上, 将有助于总氮的去除[36].菌属的广谱性提高了系统的稳定性, 专一性保证了脱氮效果, 二者在AnGS形成过程中实现了良好的平衡.此外, AAOB、AOB和DNB共存说明颗粒内部和表面微环境不同, 进而筛选出不同菌群.因此, 控制反应条件对调节颗粒污泥菌群结构十分重要.
2.2.3 微生物基因功能注释Wang等[34]的研究表明, 自养脱氮颗粒污泥床系统中, 小颗粒具有较大的功能基因转录水平.然而, AnGS形成过程中, 基于粒径分化的细菌群落如何影响其基因功能表达还知之甚少, 因此本研究进行了COG代谢功能分析, 并通过t检验找出典型样本具有显著差异的基因功能.COG代谢功能主要包括: 细胞结构和能动性、转运和代谢、信号传导和防御机制等相关细胞生化过程.
图 5(a)显示了5组样品基于COG的功能结构分布及丰度, R3总体功能优于其他4组, 特别是在: [C]能源生产和转换; [F]核苷酸运输和代谢; [G]碳水化合物的运输和代谢; [H]辅酶的运输和代谢; [L]复制、重组和修复; [J]翻译、核糖体结构与生物发生等方面.R4次之, 而R0和R1的功能基因丰度相对最弱.这说明在多种酶的调控下, R3中AAOB各功能体的联系更密切, 调节其更快地进行着基因构建与能量转换等生化反应, 进一步促进细菌细胞的增殖, 使其活性得到提高.此外, 核糖体是蛋白质产生的场所, 由此推断R3分泌大量蛋白进行细胞合成, 完成了良好的代谢和信号传输.R4由于尺寸过大, 传输受阻, 造成部分功能菌损失, 进而导致功能基因转录水平的下调, 影响了细菌细胞活动.R0和R1则因为完整的颗粒结构尚未建立, 因此微生物间协调和信息表达功能不佳.
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图 5 COG代谢功能分析 Fig. 5 Metabolic function analysis of COG |
进一步进行样本间差异对比发现[图 5(b)和5(c)], R3在基因复制, 重组和修复、能源生产转化和细胞壁和膜生物产生方面显著优于R0, 而在脂质、碳水化合物和氨基酸的转运代谢方面低于R0.分析由于粒径增加实现了功能菌积累, 进而抵抗性和细胞活性都得到增强, 但也限制了部分有机质的运输转化.R3和R4在信号转导、细胞运动、基因复制重组、能源生产转化、细胞内运输和碳水化合物以及离子的运输方面具有显著差异.这得益于R4内部的孔隙的双重作用, 部分缓解了底物的传输限制, 或者说这是以部分功能菌衰亡来平衡剩余菌体的运输代谢水平提高的一种调节机制, 应作为预警.
综上, 不同尺寸AnGS基于不同菌群分化, 会产生不同的基因功能表达水平, 粒径增加在提高能量转换水平的同时也限制了运输.总的来说, R3在二者间达到了良好平衡, 积极作用占主导而呈现出最佳的功能表达, R4则有超越平衡失稳趋势.由此, 保持合理的微生物群落组合模式至关重要.
2.2.4 组间差异分析和进化矩阵为了考察群落差异, 将样本进行基于OTU的PCA分析(图 6).根据样本在主坐标轴的投影和位置分布, 将它们分为3个递进组: 颗粒污泥(G)和絮体污泥(S); 较成熟颗粒污泥(R2~R4); 成熟颗粒污泥(R3和R4).3组范围区域不断缩小, 最终在图像左上方聚集, 代表组间样本相关性提高.R4的进化方向并未延续R3而是偏向R2, 即其与PCA1的相关性减弱, 也表明粒径过大对AnGS结构的负作用.
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图 6 基于OTU的PCA图 Fig. 6 PCA diagram based on OTU |
不同种类细菌的相对丰度对于描述群落变化至关重要, 进一步对OTU分类, 通过加权UniFrac算法, 根据丰度信息对分支进行权重, 以检测每个谱系中存在的生物体的变化.计算样本间的距离矩阵, 如表 2所示.间距较短的样本代表相似序列较多, 例如R0和R1, R2和R3, 这说明粒径接近的AnGS具有相似的菌群丰度.但R1与R2距离较远, 预示着群落结构发生了明显变化.通过上文分析, R2中AAOB开始积累, 活性迅速提高, 即1.18~2.8 mm意味着颗粒结构初步建立, 产生明显区别于絮体污泥的性能.与图 6结果一致, 距离最短的是R3和R4, 它们谱系之间的相似性最高, 表现为完整AnGS功能结构形成.最长的是R0和R3, R3具有最专一的菌群组成, 相反絮体污泥菌群组成较复杂, 这种差异代表了由ANAMMOX污泥形态由絮体向颗粒演化的过程.综上, 絮体污泥形成颗粒污泥是OTU逐级进化的过程, 伴随着粒径的增加, 实现了功能菌富集和杂菌淘汰, 菌群组成趋于专一.R3已具备完整颗粒功能结构, 尺寸的进一步增加会破坏这种稳定.
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表 2 样本间的距离矩阵 Table 2 Distance matrix between samples |
3 结论
(1) ANAMMOX活性与粒径成正相关, R4(＞4.75 mm)的SAA最高达到426.8mg·(g·d)-1, 是絮体污泥的近4倍.粒径增长增强了AnGS对负荷冲击的抵抗性, 但也阻碍了传质.
(2) 不同尺寸颗粒内部微环境不同, 引起微生物分化, 絮体富含AOB, 而AAOB在颗粒中富集.R3(2.8~4.75 mm)功能菌Candidatus Kuenenia占比达到52.7%, 但R4粒径过大, 有限的传质导致功能菌减少, 异养菌增多.
(3) 颗粒污泥形成过程中, 群落组成趋于专一, 但菌属间迁移转化普遍存在.菌群差异对ANAMMOX脱氮的化学计量比产生影响.亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)和短程反硝化菌(Thauera)的存在导致AnGS脱氮比偏小.
(4) 稳定的菌群结构是促进AnGS性能提高的关键因素.R3具有最高的功能菌占比和群落专一性, 有利于上调微生物的功能基因表达水平, 使其在能源生产和转换、物质运输和代谢基因重组修复等方面显著优于小颗粒.
(5) 絮体污泥形成颗粒污泥是OTU逐级进化的过程, 随着粒径的增加, 实现了功能菌富集和杂菌淘汰.R2(1.18~2.8 mm)颗粒结构初步建立, 产生明显区别于絮体污泥的性能.R3已具备完整功能颗粒结构, 尺寸的进一步增加会对AnGS产生负作用.
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