2021, Vol. 42
2. Cooperative Research Center for Contamination Assessment and Remediation, University of South Australia Mawson Lakes, Australia
2. Cooperative Research Center for Contamination Assessment and Remediation, University of South Australia Mawson Lakes, Australia
水体富营养化是全球水资源管理所面临的最严重问题之一[1], 2019年生态环境部对我国110个重要湖泊或水库营养状态监测结果显示, 处于中营养状态的湖泊或水库占比为62.6%, 比上一年增加0.9%, 其中轻度富营养化水体有25处, 中度富营养化水体有6处[2].水体富营养化会导致藻类大量繁殖, 产生藻毒素等有害物质, 对水生生态系统造成巨大威胁[3, 4].目前对富营养化水体的治理多以去除或固定水中氮磷元素为目标[5~7], 主要方法包括物理法、化学法和生物法[8].理化方法如清淤疏浚与混凝沉淀等, 可以快速治理水华, 降低污染物浓度, 但工程量大, 存在二次污染风险, 且理化法对氮的去除效果一般较差.生物法利用水生生物的代谢活动去除氮磷, 抑制藻类生长, 典型技术如生态浮床[9]、人工湿地[10]、生物膜[11]及生物操纵[12]等.相较于理化法, 生物法具有成本低、环境友好和综合效益高等优点, 但治理周期长, 修复效果受外部环境影响大.另一方面, 生态浮床与人工湿地等生物修复法后期需要收割植物回收氮磷, 劳动强度较大, 而传统生物膜及生物操纵法只是将氮磷元素转移至生物体内, 存在二次释放的风险.因此, 对于富营养化水体中氮磷的去除, 需要将理化方法与生物方法结合使用.PhoslockⓇ是澳大利亚联邦科学与工业研究组织(CSIRO)于20世纪90年代开发的新型除磷剂, 其主要成分为镧改性膨润土, 通过镧离子与磷酸根离子反应形成磷镧镨矿等难溶化合物从而去除水体中的磷[13, 14].作为一种较为成熟的水体固磷产品, PhoslockⓇ已在全球300多个富营养化水体修复工程中得到应用[15, 16].PhoslockⓇ对水体中磷的去除效果较好, 但却不能有效去除水体中的氮.
本研究利用团队前期筛选的1株好氧反硝化细菌(AD-19), 构建固定化生物膜用于水体脱氮, 并与PhoslockⓇ联合去除富营养化水体中氮磷污染物, 探究了PhoslockⓇ控磷抑磷能力及AD-19菌的好氧反硝化脱氮性能, 并对二者联用处理富营养化水体的长期效能进行了研究, 以期为富营养化水体原位修复提供一些参考.
1 材料与方法 1.1 实验材料本实验所用原水及底泥取自武汉市某重度富营养化河流, 水体呈黑臭状态, 主要水质指标为(mg·L-1)：COD 126~178、TN 13.6~27.6、NH4+-N 9.2~24.3、TP 1.4~1.89和PO43--P 1.13~1.5; 底泥含水率55%, 密度为1.22 g·cm-3, TN和TP含量(干重)分别为5 600 mg·kg-1和1 130 mg·kg-1.所用富营养化模拟水体水质为(mg·L-1)：COD 150、TN 20、NH4+-N 15、NO3--N 5和PO43--P 1.5.
本实验中BC型生物膜填料购自宜兴阳源环境工程有限公司, 该填料主要成分为聚丙烯碳素纤维.填料宽度为70~80 mm, 中心绳两边碳素纤维丝的直径约50 μm, 填料的比表面积为500~600 m2·m-3.
本实验中所用的NaOH、K2Cr2O7及KH2PO4等化学试剂均为分析纯, 购自国药集团化学试剂有限公司.所用的锁磷剂PhoslockⓇ由澳大利亚环境污染评估与修复联合研究中心(CRC CARE)提供, 其中镧元素质量分数为5%.
1.2 实验装置湖泊模拟序批式生物膜反应器如图 1所示, 反应器由透明有机玻璃制成, 长×宽×高为0.5 m×0.3 m×0.5 m, 容积为75 L(有效容积60 L), 主要组成包括配水系统、生物膜反应系统和曝气系统.
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(a)反应器构成, (b)反应器实物; 1.储水桶; 2.进水泵; 3.流量计; 4.增氧泵; 5.固定化生物膜反应器; 6.出水泵; 7.集水箱 图 1 序批式生物膜反应器构成与实物 Fig. 1 Structure diagram and physical photo of experimental device |
底泥沉积物中含磷污染物的形态分为总磷(TP)、无机态磷(IP)、有机态磷(OP)、铁铝结合态磷(Fe/Al-P)及钙结合态磷(Ca-P)[17].不同形态磷的分离参照欧洲标准测试委员会推荐的SMT分离法[18].
1.3.2 PhoslockⓇ控磷实验(1) 于1 L锥形瓶中加入0.6 L氮磷混合溶液(其中PO43--P质量浓度为1.5 mg·L-1, NH4+-N质量浓度为25 mg·L-1, pH调至7.0±0.2), 分别向锥形瓶中投加一定质量的PhoslockⓇ, 使得溶液中PhoslockⓇ与PO43--P质量比分别为0、20、40、60、80、100、120和140, 搅拌均匀置于20℃水浴振荡24 h后取上清液测PO43--P的质量浓度.
(2) 取富营养化水体上覆水与底泥分别置于3个烧杯(编号Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ, 容积均为2 L)中, 其中Ⅰ加入1.2 L原水+PhoslockⓇ; Ⅱ加入1.2 L原水+0.2 L底泥+PhoslockⓇ; Ⅲ加入1.2 L原水+0.2 L底泥.PhoslockⓇ的投加量根据步骤(1)所得的最佳质量比确定, 每组设置3个平行样, 测定不同烧杯上覆水中PO43--P质量浓度随时间变化情况.
1.3.3 好氧反硝化菌脱氮性能测试及挂膜驯化（1）以250 mL锥形瓶为反应器, 加入100 mL异养硝化-好氧反硝培养液(其中NH4+-N及NO3--N质量浓度均设置为100 mg·L-1, 其他组分参照文献[19]设置), 接种2 mL AD-19菌液(D600=1.0, 菌活数约为2×108 CFU·mL-1, 下同)后放入恒温振荡器, 在30℃与120 r·min-1条件下培养56 h, 设置3组平行样, 每隔一定时间取样检测上清液中NH4+-N、NO3--N、NO2--N、TN和COD等指标的质量浓度.
（2）在序批式反应器中布设BC型生物膜填料, 然后向反应器中加入45 L富集培养液(组分参照文献[19]), 按2%比例接种AD-19菌液进行挂膜, 水温为室温(12~18℃), 对反应器进行间歇曝气, 保持水中DO质量浓度在1.5~4.0 mg·L-1之间.每隔3 d更换培养液并接种好氧反硝化菌后继续挂膜, 根据生物膜的成膜情况确定挂膜周期.待挂膜结束后, 以模拟富营养化水体替代培养液, 并连续取样检测模拟水体中COD、TN、NH4+-N及PO43--P的质量浓度变化.模拟进水分3批次投加, 每次加入45 L, 处理48 h后进行换水.
1.3.4 PhoslockⓇ-固定化菌膜处理富营养化水体设置3组序批式反应器A、B及C, 每个反应器中加入富营养化原水45 L, 并在反应器底部铺设5~7 cm底泥, 其中A反应器同时加入PhoslockⓇ与驯化好的生物膜, B反应器单独投加生物膜, C为空白对照, 加入未挂膜的填料.对反应器进行间歇曝气, 维持系统内DO质量浓度在1.5~4.0 mg·L-1之间.每隔1 d换一次水并取样检测TN、TP等水质指标, 考察连续进水条件下系统对氮磷的去除能力, 整个过程持续30 d.PhoslockⓇ的用量根据进水所含总磷量与底泥含磷量计算, 一次性投加至反应器中.
1.4 分析测试方法COD、NH4+-N、NO3--N、NO2--N、TN及TP等水质指标分别采用重铬酸钾法、纳氏试剂分光光度法、紫外分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺光度法、碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法及钼酸铵分光光度法等方法测定, D600采用分光光度计(UV-1100, 中国上海)测定.菌株鉴定及生物膜的群落构成采用高通量测序(Illumina MiSeq, 美国)进行分析, 测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司完成.菌株的16S rDNA测序结果递交至NCBI数据库进行比对并利用MEGA5.0软件, 以Neighbor-joining法构建系统发育树.
2 结果与讨论 2.1 PhoslockⓇ控磷效能分析从图 2可知, 底泥沉积物中磷的形态主要包括无机态磷(IP)、铁铝结合态磷(Fe/Al-P)、钙结合态磷(Ca-P)及有机态磷(OP).一般情况下, Ca-P结构稳定, 不溶于水, 而Fe/Al-P由于易受水体pH与温度等环境因素影响, 多数研究认为其属于可释放形态的磷[20], 因此本文在计算内源磷释放时主要考虑IP及Fe/Al-P的影响.
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图 2 底泥沉积物中不同形态磷的分布 Fig. 2 Distribution of different forms of phosphorus in sediment |
图 3揭示了PhoslockⓇ投加量对水体中可溶性磷酸盐的去除能力, 可以看出, 水中PO43--P质量浓度随着PhoslockⓇ投量增加而降低, 当PhoslockⓇ与PO43--P质量比(PO43--P质量以P计)达到80时, 进一步提高PhoslockⓇ投加量, PO43--P质量浓度基本不变, 此时PO43--P的去除率为96.9%. PhoslockⓇ对NH4+-N去除效果很弱, 最大去除率在0.7%~1.5%之间.综合考虑去除效率和经济成本, PhoslockⓇ最佳投加比例为80(PhoslockⓇ与PO43--P的质量比).
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图 3 PhoslockⓇ投加比例对PO43--P及NH4+-N去除效果的影响 Fig. 3 Effects of PhoslockⓇ dosing ratios on the removal of PO43--P and NH4+-N |
图 4反映了PhoslockⓇ的控磷效果, 从中可知, Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ这3种条件下上覆水中PO43--P质量浓度均呈下降趋势.Ⅰ和Ⅱ条件下, PO43--P质量浓度迅速下降, 随后基本稳定在0.05 mg·L-1左右, 而在Ⅲ条件下由于扰动, PO43--P质量浓度先上升至1.52 mg·L-1, 然后下降至1.28 mg·L-1, 最后在1.25~1.42 mg·L-1之间波动.这种现象说明, 在不加PhoslockⓇ条件下, 上覆水中PO43--P质量浓度受底泥内源磷释放的影响较大, 而加入PhoslockⓇ后既可以降低上覆水中PO43--P质量浓度, 又能抑制底泥内源磷释放, 最终使水体中PO43--P保持在较低浓度水平.
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图 4 PhoslockⓇ控磷抑磷效果 Fig. 4 Effect of PhoslockⓇ on phosphorus control |
本实验所选菌种来自于团队前期筛选的好氧反硝化菌, 命名为AD-19, 其最适生长温度为30℃, 在4~14的C/N范围内能良好生长, C/N为10时脱氮效率最佳.将AD-19的部分16S rDNA序列(1350 bp)提交至GenBank, 并与已知基因序列进行BLAST同源性分析.结果表明, 该菌株与假单胞菌属(Pseudomonas sp.)最为接近, 同源性达到98.4%, 系统进化树分析也显示该菌株与Pseudomonas mendocina(Accession：NZ 134290.1)具有较近的亲缘关系(图 5).因此, 初步鉴定该菌株属于假单胞菌属, 并在GenBank上进行注册, 登记号为MT898541.
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图 5 菌株AD-19系统进化树分析 Fig. 5 Phylogenetic tree analysis of strain AD-19 |
图 6反映了AD-19在以NH4+-N或NO3--N为唯一氮源时的生长情况及对氮的去除能力.从中可知, AD-19在以NH4+-N或NO3--N为唯一氮源时均能较好地生长, 在48 h内对NH4+-N及NO3--N的去除率分别为97.8%和99.5%.当以NH4+-N为氮源时, 经过24 h后D600从最初的0.006增加至1.54, 在8~16 h之间达到最大生长速率0.103 h-1; NH4+-N质量浓度则不断下降, 在16~24 h之间达到最大去除速率4.63 mg·(L·h)-1, 之后由于细菌进入稳定期, NH4+-N质量浓度在继续降低至2.2 mg·L-1后趋于稳定.随后由于细菌进入衰亡期, 反硝化能力下降, 且死亡的细菌释放出NH4+-N, 导致NH4+-N质量浓度出现回升[21]. 在接种AD-19后32 h内约95%左右的NH4+-N被去除, 平均去除速率为2.97 mg·(L·h)-1, 高于先前报道的Diabolicus SF16 [2.29 mg·(L·h)-1][22]和Pesudomonas sp. ADN-42 [1.38 mg·(L·h)-1][23]等细菌.在NH4+-N去除整个反应过程中未检测到NO3--N, 而NO2--N质量浓度在短暂上升后迅速下降趋于0, 这与琼氏不动杆菌YB (Acinetobacter junii YB)[24]和贪铜菌S1 (Cupriavidus sp. S1)[25]对于NH4+-N的去除情况类似, 可能的原因是NH4+-N被氧化为NO2--N后迅速通过反硝化作用转化为含氮气体[26].当以NO3--N为氮源时, AD-19能很快地生长并对NO3--N进行去除, 在接种32 h后其对NO3--N去除率接近99%, 且在反应过程中几乎未观察到NO2--N的积累, 证明了AD-19具有较强的好氧反硝化能力[27].以NH4+-N和NO3--N为氮源时, AD-19胞内氮占TN最大质量分数分别为14.8%与14.2%, 说明大部分氮通过反硝化作用被去除, 微生物同化的氮只占一小部分, 避免了后期生物膜脱落与分解导致大量氮释放.
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图 6 菌株AD-19的异养硝化与好氧反硝化测试 Fig. 6 Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification of strain AD-19 |
挂膜初期, 生物膜填料无明显变化, 之后载体表面颜色逐渐加深, 当挂膜实验持续至第3周期时, 填料呈淡黄色, 表面出现较多黏稠状絮体(图 7), 此时挂膜工序完成.
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(a)挂膜前的BC型填料; (b)挂膜9 d后的BC型填料 图 7 挂膜前后填料外观 Fig. 7 Appearance of fillers before and after biofilm formation |
图 8反映了批次换水条件下AD-19菌膜对污染物的去除效果, 从中可知, 菌膜固定化装置对3批次模拟富营养化水体中COD的去除率约为74.3%~83.9%, 对NH4+-N去除率约为85.3%~89.5%, 对TN去除率约为88%~91.4%, 但对TP去除效果较差, 最大去除率小于2%, 并且在第3次换水后TP去除率出现负值.这是因为挂膜结束后填料上的生物膜基本稳定, 后续只有少量生物膜脱落和生长, 因此对磷的需求量较少, 另一方面脱落的生物膜不断积累并分解, 释放的磷进入水体导致TP质量浓度升高.COD和氮的去除主要通过生物膜上细菌的呼吸作用和反硝化作用, 稳定期的生物膜上微生物新陈代谢较强, 因此COD和氮的去除效率较高.对每次换水后出水中COD、NH4+-N及TN等指标进行差异性分析, 结果显示换水对出水水质指标无明显影响(P＞0.05), 说明菌膜固定化装置在实际应用中可多次循环利用.
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图 8 批次进水时菌膜对污染物的去除效果 Fig. 8 Removal efficiency of nutrients by biofilm with batch influent |
图 9揭示了PhoslockⓇ联合固定化菌膜对富营养化水体的长期修复效果.从中可知, PhoslockⓇ的投加在初期降低了生物膜的脱氮效率, 可能原因是一些PhoslockⓇ吸附到生物膜表面, 造成生物膜与水体物质交换能力下降, 但经过短暂调整后, 生物膜脱氮能力得到恢复, 并最终与单生物膜组效果相当.对照组的TN质量浓度波动较大, 前期以下降趋势为主, TN去除率＜20%, 后期出水TN质量浓度出现上升, 这是因为对照组填料上初期会有大量微生物附着形成生物膜, 消耗一部分氮, 随着成熟生物膜脱落与分解, 导致出水TN质量浓度升高.PhoslockⓇ的投加可使出水TP质量浓度长时间保持在0.2 mg·L-1以下, 但由于脱落生物膜分解释放出磷, PhoslockⓇ的磷吸附容量在一段时间后趋于饱和, 导致出水TP质量浓度上升, 并最终在第28 d达到0.4 mg·L-1.而未加PhoslockⓇ的单生物膜组和对照组对TP去除效果均较差, 单生物膜组在前期由于新的微生物生长, 出水TP出现下降, 但随着膜的成熟与脱落, 出水TP质量浓度不断升高, 对照组与单生物膜组变化趋势类似, 二者在第30 d时出水TP质量浓度均超过进水.
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图 9 PhoslockⓇ+菌膜联合修复富营养化水体 Fig. 9 Combined remediation of eutrophic water by PhoslockⓇ and biofilm |
采用高通量测序方法对几种生物膜上的菌群结构进行分析(图 10), 结果表明, 利用富集培养液挂膜(FJGM)后, 填料上主要微生物菌属为Pseudomonas, 相对丰度占整个菌群比例达到95.6%.单独使用菌膜(JM)及使用菌膜+PhoslockⓇ(SL+JM)对富营养化水体进行处理时, 生物膜上主要菌群种类变化不大, 但JM上Pseudomonas属细菌占比明显多于SL+JM, 说明PhoslockⓇ对AD-19的生长可能存在抑制作用.相较于FJGM, JM及SL+JM上Pseudomonas属细菌相对丰度均大大降低, 分别为9.16%和7.12%, 这是因为填料是一种良好的生物载体, 随着水质变好, 底泥中丰富的微生物附着在填料上并生长繁殖, 导致生物膜上生物种类及生物量增多[28], 另一方面其他微生物的生长对AD-2可能产生抑制作用, 最终导致AD-2在整个菌群中占比降低.与JM及SL+JM相比, 空白对照组生物膜(KBDZ)上生物多样性较低, Pseudomonas属细菌占比仅为0.2%, 优势菌属Trichococcus与Hydrogenophaga占比接近80%, 对其他物种产生明显抑制作用.高通量测序结果表明, AD-19菌经过富集挂膜后能在富营养化水体中长期生存, 并能显著提高生物膜上物种多样性, 强化生物膜对水体污染物的处理能力.
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图 10 不同样品属水平菌群分析 Fig. 10 Analysis of flora in different samples |
中试研究于2019年10月开展, 修复水体为武汉市某公园内的一个池塘, 面积约300 m2, 平均水深0.6 m.由于水域封闭, 周边枯枝落叶在池底积累, 导致水体水质变差, 主要水质指标(mg·L-1)：COD 72、TN 2.56、NH4+-N 2.35及TP 1.05.底泥平均厚度为0.25 m, 含水率68.4%, 密度1.18 g·cm-3, 底泥(烘干)中TP含量为920 mg·kg-1, 其中IP及Fe-Al/P占比分别为52.3%与9.8%, 通过静态释放实验得到底泥(含间隙水)最大释磷量为3.6 mg·kg-1.经过计算, 设置8组菌膜固定化好氧反硝化处理装置, PhoslockⓇ用量为54.6 kg, 平均每m2水域投加182 g, 投加量与Meis等[29]修复Loch Flemington湖时的投加量200 g·m-2相当.采用微型太阳能曝气装置对生物膜供氧, 使处理装置周围水体DO质量浓度保持在1.5~4.0 mg·L-1.中试期间对水体中COD、TN及TP监测结果如图 11所示, 从中可知, 第1 d由于布设反应装置对水体底泥产生扰动, 水体TN及COD质量浓度升高.PhoslockⓇ投加后池塘水体中TP质量浓度迅速由1.05 mg·L-1降至0.02 mg·L-1, 并长期维持在0.2 mg·L-1以下.TN质量浓度降低较慢, 在第16 d降至1.0 mg·L-1以下, 这可能是因为水温较低, 导致脱氮微生物活性降低, 脱氮效率下降.随着时间推移, TN质量浓度最终维持在0.6 mg·L-1左右.在第181 d时, 由于水温持续升高, 内源性氮磷释放速率加快, 水体氮磷质量浓度上升, TN质量浓度依旧小于1.0 mg·L-1, 但TP质量浓度超过0.25 mg·L-1, 处于劣Ⅴ类水平.因此在第182 d时以18 g·m-2的投加量补充PhoslockⓇ, 水中TP迅速降低至0.04 mg·L-1并维持到第270 d.中试中未出现生物膜脱落导致氮磷质量浓度上升的现象, 这可能是因为池塘中鱼类等水生动物摄食脱落的生物膜并将氮磷以有机体形式储存.整个处理期间, COD质量浓度始终保持在50 mg·L-1左右, 去除率约30%, 可能是因为底泥中积累了较多的枝叶, 有机质不断分解并释放至上覆水[30], 因此针对COD的治理还需要结合底泥清淤处理.
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图 11 PhoslockⓇ联合好氧反硝化菌修复富营养化池塘水体 Fig. 11 Combined remediation of eutrophic water in a pond with PhoslockⓇ and biofilm |
(1) PhoslockⓇ对水中PO43--P去除效果较好, 在PhoslockⓇ投加量与水中PO43--P质量比为80时, 其对富营养化模拟水体中PO43--P去除率为96.9%.但PhoslockⓇ对模拟富营养化水体中NH4+-N去除效果较差, 最大去除率仅为1%左右.
(2) 16S rDNA鉴定表明AD-19菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.), 当以100 mg·L-1的NH4+-N或NO3--N为唯一氮源时其在48 h内对二者的去除率分别为97.8%和99.5%, 表明其具有较好的异养硝化-好氧反硝化能力.AD-19经过挂膜后对模拟富营养化水体中COD、NH4+-N及TN去除效果较好, 但对TP去除效果较差, 最大去除率小于2%.
(3) 本实验结果表明, PhoslockⓇ联合固定化菌膜对富营养化水体中氮磷等营养元素去除效果较好, 经过修复后氮磷质量浓度可长期维持在地表水Ⅲ类水平.对生物膜的高通量测序结果表明, 尽管由于其他细菌的竞争, AD-19并未成为明显优势菌, 但其较强的好氧反硝化能力依然能够保证对水中氮的去除效果, 并能改善生物膜上菌群结构, 强化生物膜的脱氮性能.
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