2021, Vol. 42
四环素类抗生素(tetracyclines, TCs)是全球范围内应用最为广泛的抗生素之一, 主要用于疾病治疗和动物促生长.由于TCs在动物体内不完全被吸收, 60%~90%以原药及代谢物的形式通过粪尿排泄出去[1], 作为有机肥施入农田, 造成土壤抗生素污染残留.我国是世界上生产和消费TCs量最大的国家, 2013年消耗的TCs达6 950 t[2].我国许多省份土壤TCs含量高达几十到几千μg·kg-1, 超过了欧盟规定的100 μg·kg-1的风险阈值[3~5].
有研究发现抗生素会影响蔬菜作物的生长发育, 在水培条件下外源添加抗生素, 对3种水生植物生长产生影响[6], 抑制番茄根系的生长[7], 对小麦幼苗产生生理胁迫[8].现有的报道大多是在营养液中添加高含量抗生素研究其对种子或幼苗的生理影响, 通过土培研究抗生素对植物后期生长影响和生理毒性的报道相对较少[9].
抗生素影响植物生长的同时, 也会被植物吸收富集, 通过食物链进入人体, 从而对人类健康造成威胁[10, 11]. Azanu等[12]在含有四环素的灌溉水中种植出的胡萝卜和生菜中检测出了四环素; Michelini等[13]的研究表明植物吸收的抗生素主要累积在根部, 而Hu等[14]的研究发现抗生素分布叶>茎>根, Ahmed等[15]的研究则发现蔬菜中抗生素分布根系＞叶片＞果实, 可见对于抗生素在植物的转运富集规律还需要进一步研究[16].人体通过食物链摄入的抗生素量高于每日允许摄入量(ADI)时会对健康产生风险[17], Ahmed等[15]在抗生素污染土壤上种植了黄瓜、番茄和生菜并测定了磺胺类和四环素类抗生素在可食部位中的含量, Azanu等[17]测定医院废水浇灌的莴苣可食部位抗生素含量, 结果均显示蔬菜可食部位积累的抗生素远低于安全限量, 对人体健康不会产生威胁.土壤中的抗生素含量达到多高水平时才能使得蔬菜富集抗生素含量到达威胁人体健康的触发值值得研究.
抗生素对土壤微生物和土壤酶活性也会产生影响, 并诱导产生抗性菌和抗性基因[18], 抗生素本身在土壤中也会发生降解[19].植物的根际效应是影响土壤生态的重要因素, 非常有必要对其在抗生素污染条件下的土壤生态变化及抗生素的降解作用进行研究.
生菜是人们喜爱生食的蔬菜, 且对抗生素更为敏感[9], 适合作为抗生素风险指示作物.因此, 本文以生菜为供试作物, 以3种典型的TCs(OTC、TC和CTC)为研究对象, 通过土培试验, 分析不同水平(0、50、150、450和1 350 mg·kg-1)的TCs对生菜的生长和生理影响, 及其在生菜体内的累积和转运特性, 并对可食部位TCs残留做了人体健康风险评估, 同时比较TCs对根际、非根际和对照土壤中酶活性及土壤可培养微生物数量的影响, 以期为抗生素对植物的毒性作用研究累积资料, 并为蔬菜生产中抗生素的健康风险控制提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 供试作物生菜(Lactuca sativa L. var. ramosa Hort.), 品种名为绿秀, 种子购买于北京东升种业公司.种子浸种消毒后在玻璃培养皿中培养, 发芽2 cm后移植到营养钵, 长至3叶一心后挑选生长一致的移栽.
1.1.2 供试土壤采自重庆市北碚区西南大学的国家紫色土监测基地旁边, 土壤类型为紫色土, 土壤采集后自然风干, 剔除石块等杂物, 磨碎过5 mm筛备用.土壤基础理化性质为：pH 5.23, 有机质8.87 g·kg-1, 全氮1.54 g·kg-1, 碱解氮、有效磷和速效钾分别为74.59、38.59和65.07 mg·kg-1, TCs含量低于检测限.
1.1.3 供试药品3种四环素类抗生素(TCs), 分别为土霉素(OTC)、四环素(TC)和金霉素(CTC), USP级(BBI Life Science, China).
1.2 试验设计与方法本试验于2016年4月19日~2016年6月9日在西南大学资源环境学院玻璃温室内进行.试验选用3种抗生素(TC、OTC和CTC), 每种抗生素设置5个污染水平, 分别为0、50、150、450和1 350 mg·kg-1, 每个处理重复4次, 随机排列.采用根袋法[20]把盆内土壤分为根际土和非根际土, 各处理再设置不种蔬菜的土壤作为对照土.
抗生素通过逐级混匀的方法与土壤干拌混匀, 老化1 d.采用17~12 cm(上下口径)×15 cm(高)的塑料花盆, 每盆装入2 kg的土壤, 用500目尼龙网制成12 cm(高)×16 cm(周长)的根袋, 0.3 kg土装入根袋内, 1.7 kg土在盆内根袋外, 每盆定植三叶一心的生菜幼苗3株于根袋内.各处理分别以NH4NO3、KH2PO4和KCl作为基肥提供氮(N)180 mg·kg-1、磷(P2O5)100 mg·kg-1、钾(K2O)150 mg·kg-1, 第30 d以尿素(N)60 mg·kg-1追肥一次.作物生长期间定期灌溉, 使土壤田间持水量保持在70%左右.期间对照土壤的管理同种植生菜的土壤保持一致.
移栽后的第40 d测定生菜的光合系统参数, 第41 d取样测定光合色素含量, 第51 d收获, 测定植株根系和地上部分的生物量, 取一部分样品清洗后立即测定抗氧化酶活性, 另一部分样品反复用纯水清洗, 根系用超声波清洗去掉泥土, 然后冷冻干燥后研磨粉碎, 储存在-20℃下用于测定抗生素含量, 同时测定样品含水量.
分别采集根际土、非根际土和对照土.根际土采用抖根法[20]采集, 抖去根上土壤后, 用毛刷刷取根系表面附着的土壤作为根际土; 根袋外的土为非根际土壤; 未种植物的土壤为对照土.土样一部分4℃冷藏以备测定土壤酶活性、土壤微生物数量, 另一部分冷冻干燥后用于测定TCs含量.
1.3 样品分析方法 1.3.1 光合系统参数光合系统参数的测定使用便携式光合系统测定仪(Li-6400, LI-COR, USA), 在生菜生长旺期, 选一个天气晴朗的日子, 在09:00~11:00点, 测定各处理生菜中部叶片, 重复4次, 导出净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间二氧化碳(Ci)和蒸腾速率(Tr)等参数的数据.
1.3.2 光合色素含量采用丙酮提取-分光光度法[21], 用打孔取样器均匀取0.2 g生菜叶片, 在10 mL 95%的乙醇溶液中室温浸提18 h, 浸提液测定470、649和665 nm下吸光度, 计算叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和叶绿素总含量, 单位为mg·g-1(以鲜重计).
1.3.3 生菜抗氧化酶活性测定酶液的提取, 取生菜叶片或根系2 g, 在预冷的磷酸缓冲溶液(pH 7.8)研磨成匀浆, 低温离心获得提取液.超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性用氮蓝四唑光化学还原法测定, 以560 nm下的吸光值计算酶活性, 以抑制NBT光化学还原50%的酶量为一个酶活力单位, 单位为U·g-1; 过氧化物酶(peroxidase, POD)活性的测定采用愈创木酚, 以每分钟增加1.0 D470酶量为一个酶活力单位, 单位U·(g·min)-1; 过氧化氢酶(catalase, CAT)活性采用紫外分光光度法, 以240 nm下的吸光值计算酶活性, 每1 min减少0.01 D240的酶量为一个酶活力单位, 单位为U·(g·min)-1, 以上均以鲜重计[22].
1.3.4 植株和土壤中TCs含量测定样品前处理参照文献[23, 24]中的方法并进行优化, 具体过程如下：样品在冷冻干燥机(FD-1A-50, 上海争巧科学仪器有限公司)中冻干后, 研磨过1 mm筛, 准确称取匀质的土壤样品2.000 0 g或植株样品1.000 0 g于50 mL离心管中, 加入10 mL提取液(0.1 mol·L-1Na2EDTA-McIlvaine∶甲醇=1∶1), 漩涡振荡混匀1 min, 超声10 min, 然后在4 000 r·min-1下离心10 min, 收集上清液; 再分别用8 mL和6 mL提取液重复提取两次, 合并3次提取的上清液, 其中植物样品的上清液要用10 mL的正己烷反复洗涤, 静置后去除上层正己烷.上清液于40℃旋转蒸发至体积浓缩为12 mL左右.固相萃取小柱Poly-Sery HLB SPE[6 mL/500 mg, ANPEL Laboratory Technologies(Shanghai) Inc., China]依次用5 mL甲醇和5 mL超纯水活化, 提取液以1 mL·min-1的流速全部通过小柱, 然后分别用5 mL超纯水和5 mL 5%的甲醇溶液淋洗小柱, 真空抽干20 min, 以5 mL 0.01 mol·L-1的草酸甲醇溶液洗脱小柱, 收集洗脱液, 在40℃下氮吹至近干, 用甲醇定容至1 mL, 过0.22 μm滤膜, 存于自动进样瓶中.
样品使用HPLC-MS/MS(LCMS-8030, SHIMADZU, Japan)进行测定, 测定条件和参数如下.液相条件：柱温40℃, 流速为0.4 mL·min-1, 进样量2 μL, 梯度洗脱程序为：1~3 min, 15%~40% B相; 3~4 min, 40%~95% B相; 4~5 min, 95% B相; 5~5.1 min, 15%B相; 5.1~8 min, 15% B相, 其中A相为含0.3%甲酸的水溶液, B相为含0.3%甲酸的乙腈溶液.质谱条件, 离子源：电喷雾离子源(ESI); 扫描方式：正离子扫描; 监测模式为多反应监测模式(MRM); 干燥气：N2; 干燥气温度：400℃; 干燥气流速：15 L·min-1; 雾化器压力：30 psi; 毛细管电脉压：4500 V.该条件下OTC、TC和CTC的定量下限分别为14、7和21 μg·kg-1.
使用OTC、TC和CTC标品(Sigma公司, 美国, 纯度≥98.0%)配制溶液, 测定3种抗生素的回收率, OTC、TC和CTC在土壤和蔬菜中的回收率分别为82.1%、77.1%、72.1%和76.3%、77.0%、87.4%, 回收率满足分析要求.
1.3.5 土壤酶活性测定土壤过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定法, 以每g土1 min内分解H2O2的质量(mg)表示; 土壤脲酶活性测定采用靛酚蓝比色法, 以每g土24 h生成NH3-N的量(mg)表示[25].
1.3.6 土壤微生物和抗性菌数量测定细菌采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养, 真菌采用马丁-孟加拉红培养基培养, 放线菌采用改良高氏一号培养基培养, 以平板表面涂抹法计数[26].
1.4 数据分析用Excel 2010和SPSS 21.0对数据进行计算和统计分析, 对不同处理数据进行单因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比较.
植物对TCs的富集可以用生物浓缩系数(BCF)值, 采用公式(1)进行计算[9, 13, 27].TCs从植物根部向地上部的转运能力用转运系数(TF)值表示, 采用公式(2)计算[9, 13].人体对通过饮食对抗生素的每日预测摄入量(EDI)根据公式(3)计算, 抗生素对人体健康的风险商(HQ)根据公式(4)计算[28, 29].
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式中, C为食品中的抗生素含量(μg·kg-1, 以鲜重计), 鲜基含量以干基含量和含水量换算得到; FIR为每日摄取食物的量(kg), 世界卫生组织(WHO)建议每天摄入400 g蔬菜[30], 中国居民膳食指南(2016)[31]建议中小学生和成年人每人每天对蔬菜的需求量为300~500 g, 本文取每日摄食蔬菜400 g计算; BW为人体平均体重(kg), 参照文献[32]的规定, 分别设定成年人体重为65 kg, 儿童(7岁)体重为25 kg; ADI值参照WHO的规定[30].
2 结果与分析 2.1 土壤TCs对生菜生物量的影响由表 1可知, TCs对生菜的生长表现出抑制的作用.与对照(CK)相比, 生菜地上部、根系和总植株鲜重随着抗生素施加含量的升高而降低.同等含量下, 3种抗生素对生菜生物量的抑制作用也表现出一些差异性.主体间效应检验显示, TCs的种类和含量对生菜生物量均表现为极显著的影响(P＜0.001), 且两者存在交互作用.
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表 1 不同含量TCs对生菜生物量的影响1) Table 1 Effects of tetracycline treatments on lettuce biomass |
2.2 TCs对生菜光合作用的影响
如图 1(a)所示, TCs处理显著抑制了生菜的净光合速率(Pn), 生菜的Pn随TCs含量水平的升高而显著降低(除TC在50 mg·kg-1和OTC在1 350 mg·kg-1水平处理), 与对照相比, OTC、TC和CTC处理的Pn分别降低了0~54.6%、14.5%~45.5%和11.5%~54.8%; 生菜的Pn在同一含量不同种类TCs间, 50 mg·kg-1水平时, OTC＞CTC＞TC, 150 mg·kg-1和450 mg·kg-1时CTC显著高于OTC和TC, 1 350 mg·kg-1时TC显著高于OTC和CTC.生菜的胞间二氧化碳浓度(Ci)见图 1(b), 与对照相比, OTC和TC在50 mg·kg-1和150 mg·kg-1水平下均显著降低, CTC在150 mg·kg-1和1 350 mg·kg-1水平下显著降低, 而在50 mg·kg-1和450 mg·kg-1水平下和CK差异不显著.生菜的气孔导度[Gs, 见图 1(c)]和蒸腾速率[Tr, 见图 1(d)], 与对照相比, OTC和TC表现出先升高(50~450 mg·kg-1)再降低(450~1 350 mg·kg-1)的趋势, CTC在50和450 mg·kg-1时显著高于CK, 而在150和1 350 mg·kg-1时显著低于CK.
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不同小写字母代表所有处理间存在显著性差异(P＜0.05), 下同 图 1 不同含量的TCs对生菜Ci、Pn、Gs和Tr的影响 Fig. 1 Effects of tetracycline treatments on Ci, Pn, Gs, and Tr in lettuce |
由图 2可知, 在不同TCs处理下, 生菜叶绿素含量表现不同, 总体上显示抑制作用.与对照相比, OTC、TC和CTC处理下生菜叶绿素总量(Chl-t)分别降低24.6%~43.6%、15%~56.6%和2.7%~28%, 叶绿素a(Chl-a)含量降低27%~46.2%、15%~59.6%和4.2%~29.1%, 叶绿素b (Chl-b)含量降低18.7%~39.8%、15.3%~50.3%和0.6%~28.1%, 类胡萝卜素(Chl-c)含量降低28.6%~48.7%、15.4%~65.3%和4.2%~27.2%.与对照相比, 不同含量(50~1 350 mg·kg-1)处理下的TCs处理叶绿素总量分别降低15.1%~31.9%、16.4%~46.0%、2.7%~56.6%和13.0%~43.6%, 叶绿素a含量分别降低15.5%~33.8%、18.0%~48.0%、4.2%~59.6%和15.1%~46.2%, 叶绿素b含量分别降低15.4%~29.8%、14.5%~42.2%、0.6%~50.3%和10.6%~39.8%, 类胡萝卜素含量分别降低15.4%~32.5%、19.8%~49.4%、4.2%~65.3%和20.0%~48.7%.OTC处理的叶绿素总量、叶绿素a、叶绿素b和胡萝卜素这4项指标均比CK显著性降低, 但在50~450 mg·kg-1的3个含量梯度差异不明显, 在1 350 mg·kg-1水平下含量显著低于低含量水平处理; TC的4项指标都随着含量的增加表现先降低(0~450 mg·kg-1)后升高(450~1 350 mg·kg-1)的趋势; CTC处理在50~450 mg·kg-1的含量区间内4项指标均随含量的增加而增加, 在1 350 mg·kg-1含量处理下显著降低.不同种类抗生素间, 在低含量(50 mg·kg-1)处理时, 4项指标均表现TC显著高于OTC和CTC处理, 而在150和450 mg·kg-1含量时则显著低于OTC和TC处理, 在高含量(1 350 mg·kg-1)时CTC显著高于OTC和TC.
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图 2 不同含量的TCs对生菜光合色素的影响 Fig. 2 Effects of tetracycline antibiotic treatment on the chlorophyll content of lettuce |
抗氧化酶(SOD、POD和CAT)可以反映出生菜对TCs胁迫在生理上的响应, 不同TCs处理下, 生菜抗氧化酶活性变化如图 3所示.在低含量水平(50 mg·kg-1)时, SOD、POD和CAT含量和对照相比大部分未出现显著性增长, 而在含量水平高于150 mg·kg-1时, 所有TCs(除OTC 150 mg·kg-1)处理的3种抗氧化酶均显著高于对照处理, 且随着含量水平的增加, 3种抗氧化酶活性也增加.不同酶活性之间的增长幅度也不同, 不同含量TCs处理下SOD增长幅度地上部和根系分别为19.5%~179%和22.4%~143%, POD的增长幅度分别为5.1%~49.4%和4.2%~40%, CAT的增长幅度分别为0%~59.9%和32.6%~99.2%, 总体上看所有TCs处理下各种酶的增长幅度SOD＞CAT＞POD, 生菜不同部位的敏感度根系＞地上部.
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图 3 不同含量的TCs对生菜抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性的影响 Fig. 3 Effects of different tetracycline antibiotic treatment on antioxidative enzymes (SOD, POD, and CAT) activities in lettuce |
由表 2可知, 生菜根系和地上部分对TCs具有吸收能力, 生菜抗生素含量随土壤施加的抗生素含量增加而增加; 不同部位的TCs含量根系＞地上部分; 在50~150 mg·kg-1水平下, 生菜对抗生素的吸收量CTC＞OTC＞TC, 在450~1 350 mg·kg-1水平下, CTC＞TC＞OTC.生菜地上部对TCs的生物富集系数在0.002 9~0.016 1之间, 根系的富集系数在0.014 9~0.055 2之间, 根系富集能力强于地上部, 随着土壤TCs含量升高, 生菜对TCs的富集系数呈现降低趋势, 从50 mg·kg-1时TCs在地上部和根系的富集系数在0.008 1~0.016 1和0.026 5~0.055 2, 降低至1 350 mg·kg-1时的0.001 1~0.002 9和0.015 3~0.022 6.不同TCs种类之间CTC的富集能力显著高于OTC和CTC.生菜对TCs的转运系数在6.1%~30.5%之间, 转运系数随着土壤TCs含量升高而显著降低, 不同种类TCs的转运系数在不同含量水平下表现不同, 在50 mg·kg-1时, 3种TCs的转运系数没有表现出显著性差异, 在150 mg·kg-1和1 350 mg·kg-1时CTC的转运系数显著高于TC和OTC, 在450 mg·kg-1时OTC转运系数显著低于TC和CTC.TCs的种类和含量对植株TCs含量、生物富集系数和转运系数均有显著性影响, 且两者对植株TCs含量、生物富集系数和转运系数存在交互作用.
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表 2 生菜对TCs的吸收和生物富集系数(BCF)及转运系数(TF) Table 2 Concentration, bioconcentration factors, and translocation factors of tetracyclines in lettuce |
2.6 TCs健康风险评估
由表 3可知, 随着土壤中添加TCs含量的提高, 生菜可食部位的残留的TCs含量随着升高, TCs的人体预测每日摄入量(EDI)以及暴露的人体健康潜在风险值(HQ)也会相应增加.由于儿童每日食用的蔬菜相对于自身体重比值更高, 因此儿童的健康比成人更容易受到抗生素暴露的威胁, 数据显示, CTC在土壤中的含量达到1 350 mg·kg-1 时成人HQ＞0.1, 3种TCs分别在450 mg·kg-1以上, 儿童HQ＞0.1, 其余处理均＜0.1, 而所有的处理下的HQ均不超过1. 3种抗生素的HQ大小为CTC＞TC≈OTC.
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表 3 通过摄食生菜摄入的四环素类抗生素对人体健康的潜在风险 Table 3 Potential health risks from exposure to tetracycline residues via lettuce consumption |
2.7 TCs在土壤和植物中的含量与植物生理指标的相关性
相关性分析的结果如表 4所示, 在土壤中添加不同水平的TCs与生菜生物量呈显著负相关(地上部r=-0.852, P < 0.01; 根系r=-0.769, P < 0.01), 与Pn呈显著负相关(r=-0.808, P < 0.01), 与地上部和根系抗氧化酶活性均呈现正相关(P < 0.01), 与植株TCs含量呈显著正相关(地上部r=0.640, P < 0.05, 根系r=0.947, P < 0.01).地上部TCs含量与地上部生物量呈显著负相关(r=-0.584, P < 0.05), 与根系TCs含量呈显著正相关(r=0.824, P < 0.01), 根系TCs含量与生菜生物量呈显著负相关(地上部r=-0.811, P < 0.01; 根系r=-0.682, P < 0.05), 与地上部和根系SOD、POD和CAT均呈显著负相关.
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表 4 生菜不同部位生物量、TCs含量与其生理特性的相关性 Table 4 Correlation analysis of biomass, tetracyclines content in different part of lettuce, and physiological characteristics |
2.8 TCs在根际土中的残留与降解
如图 4所示, 在经过了51 d的培养之后, 土壤中的TCs自然降解使得其含量比初始施加量大幅度降低(CK处理没有抗生素检测出来所以数据不展示), TCs残留量在根际、非根际和对照种土壤之间比较, 对照土在各TCs处理下均显著低于根际土和非根际土, 根际土的TCs残留量在OTC含量≥450 mg·kg-1及TC 1 350 mg·kg-1水平下显著高于非根际土, 其余处理下残留量均低于非根际土壤, 总体上比较, TCs在3种土壤上的残留非根际土＞根际土＞对照土, 降解速率对照土＞根际土＞非根际土.不同种类TCs之间, OTC降解速率显著低于TC和CTC, 培养结束时OTC在各含量水平的残留量平均是TC和CTC的4.41倍和4.56倍.
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图 4 根际土、非根际土和对照土中TCs残留量 Fig. 4 Concentrations of tetracyclines in rhizosphere, bulk, and control soils |
如图 5所示, 土壤过氧化氢酶在3种土壤中的活性大小依次为：根际土＞非根际土＞对照土.与对照相比, 根际土中的过氧化氢酶活性在不同含量OTC处理先随含量升高而显著增加, 然后在450~1 350 mg·kg-1时降低, TC各含量处理差异不显著, CTC处理在50 mg·kg-1时显著增加, 在150 mg·kg-1和1 350 mg·kg-1时显著降低.
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图 5 TCs对根际土、非根际土和对照土中过氧化氢酶和脲酶活性的影响 Fig. 5 Effects of tetracyclines on soil enzyme activity in rhizosphere, bulk, and control soils |
土壤脲酶活性, 非根际土＞根际土＞对照土, 在根际土中, TCs在根际土和非根际土各处理脲酶活性显著低于CK处理.
2.10 TCs对土壤微生物数量的影响由表 5可知, 根际土壤中的细菌数量和放线菌数量显著高于非根际土壤和对照土壤, 根际土壤中, OTC和TC处理的细菌数量随TCs含量的增加而降低, CTC处理的细菌数量随含量增加先增加(50~150 mg·kg-1)后降低(150~1 350 mg·kg-1), 非根际土中OTC和CTC在50~150 mg·kg-1的范围内细菌数量差异不明显, 但在150~1 350 mg·kg-1及TC在50~1 350 mg·kg-1的范围内随TCs施加水平升高而降低.土壤真菌数量在CK、OTC 50 mg·kg-1及CTC 50、150和1 350 mg·kg-1水平下, 均表现出对照土＞非根际土＞根际土, TCs显著降低了土壤中真菌的数量(对照土在OTC 50 mg·kg-1及非根际土在OTC 150mg·kg-1), 不同种类TCs处理下的真菌数量在不同含量水平表现不一.随着TCs含量的升高, OTC和CTC处理的3种土壤真菌数量均显著降低.
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表 5 TCs对根际土、非根际土和对照土中微生物数量的影响 Table 5 Effects of tetracyclines on microbial populations in rhizosphere, bulk, and control soils |
3 讨论 3.1 TCs对生菜生物量的影响
抗生素通过抑制植原体活性[33]、叶酸[34]和营养物质吸收[13]等而抑制植物的生长.Michelini等[13]研究磺胺类抗生素对玉米和柳树的生物量影响时, 含量为10 mg·kg-1时对两种植物的影响和空白对比没有显著性差异, 而在200 mg·kg-1时两种植物的生物量显著降低; 鲍艳宇[35]的小麦发芽试验中, 土壤中TC和OTC在250~2 500 mg·kg-1对小麦芽呈促进作用, TC在5 000~25 000 mg·kg-1及OTC在10 000~25 000 mg·kg-1范围内芽伸长受到抑制.本研究中, TCs在50 mg·kg-1时即开始对生菜的生长产生抑制作用, 且生物量随着TCs含量的升高而降低.抗生素对植物的影响受抗生素种类、含量和植物种类、生长介质等多种因素影响[9, 35, 36], 在低含量时往往对植物无影响或产生促进作用, 在高含量时表现抑制现象.
3.2 TCs对生菜光合作用和叶绿素含量的影响本研究中, TCs处理显著抑制了生菜的Pn, 对Gs、Ci和Tr的影响规律不明显.张继旭等[37]的研究指出随着烟草的生育进程, TC对光合作用先表现出抑制作用, 到了成熟期后表现促进作用.TCs能够影响光合电子传递速率以及光合色素的合成[38].3种TCs中, TC对生菜Pn的抑制作用最强, 可能是同类抗生素下的不同抗生素含有的不同官能团, 而不同程度地抑制光合过程中某些关键酶的活性[39].
Bradel等[33]的研究发现, 当OTC含量升高时, 紫花苜蓿的叶子泛黄.在本研究中, TCs处理下叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和叶绿素总量分别降低4.2%~59.6%、0.6%~50.3%、4.2%~65.3%和2.7%~56.6%.TCs抑制叶绿素含量可能是因为TCs与叶绿体合成酶结构相似, 因此TC抑制了叶绿体合成酶的活性[33, 40].
3.3 TCs对生菜抗氧化酶活性的影响植物遭受胁迫时会产生大量的活性氧从而导致SOD、POD和CAT含量升高.Ma等[41]的研究发现在土壤中添加的OTC含量为25 mg·kg-1时, 空心菜根的SOD显著增加.本研究中, 生菜在遭受TCs胁迫时, 在50 mg·kg-1含量条件下生菜的抗氧化酶的含量变化不一致, 而在150 mg·kg-1及以上含量时3种抗氧化酶含量均比对照显著性增高.但大多数抗生素对植物抗氧化酶影响是在水培条件下进行的, Xie等[42]在水培条件的小麦种植试验中, TC在0~25 mg·L-1的范围内对根系抗氧化酶活性无显著影响, 而在25 mg·L-1以上时, 根系抗氧化酶活性随着TC含量升高而升高; Vilvert等[6]采用OTC处理3种水生植物24 h后, 在0.5~2.5 μg·L-1的范围内大部分处理的POD和CAT含量即显著性高于对照; 这些研究植物对抗生素的敏感性因抗生素种类、含量以及培养介质等因素的不同而异[35, 36].本研究中TCs对生菜不同部位的POD和CAT活性影响有差异, 可能是由于抗生素会损害呼吸电子传递链中的正常电子流等代谢过程, 也会诱导产生H2O2而干扰POD和CAT的活性[43].由此可见, TCs会对植物生长产生氧化胁迫, 但其作用机制和影响因素还需要进一步地研究.
3.4 TCs在蔬菜体内的吸收和富集转运特征TCs被植物吸收后可以通过食物链进入人体, 从而对人体健康产生威胁.本研究中, 3种TCs在植物体内的含量为0.406~30.535 mg·kg-1(以鲜重计), 远高于Boxall等[23]的研究结果[3~38 μg·kg-1(以鲜重计)]和Dolliver等[44]的研究中磺胺嘧啶在植物体内的含量[8~100 μg·kg-1(以鲜重计)]; 但低于Michelini等[13]报道的施加200 mg·kg-1磺胺嘧啶时玉米根、茎和叶磺胺嘧啶含量分别是5 464、113和665 mg·kg-1, 柳树根和茎磺胺嘧啶含量分别是5 331 mg·kg-1和708 mg·kg-1; 与迟荪琳等[45]的研究结果比较接近.有研究表明, 抗生素通过被动扩散被植物吸收, 通过根系中的凯氏带运输, 然后通过木质部和韧皮部分别转运至茎叶和果实[46].TCs的吸收累积不仅取决于作物的种类和品种, 还与土壤性质及抗生素本身的性质密切相关, 本研究及相关研究均证明有机肥源抗生素存在向高等植物迁移累积的现象, 而这种累积可随食物链的传递最终进入人体.
3.5 TCs残留通过饮食摄入人体的健康风险对于非药用抗生素在通过饮食长期低剂量暴露对人体健康造成的威胁, 通常采用风险商法(HQ)进行评估[15, 28, 29, 47].该方法同时适用于饮用水、动物性食品、蔬菜和粮食等, 通常认为HQ＞1时存在风险[15, 47, 48], 但也有学者认为HQ＞0.1时便有潜在的风险[28, 29].在已有的调查研究中, 饮用水和动物性食品有部分样品抗生素超标[28, 29], 但在查阅的研究中尚未发现有蔬菜抗生素超标现象.如Hanna等[49]对山东省的菜田蔬菜中的10种抗生素进行了风险评估, 结果各种蔬菜中的HQ值均低于0.03, 即均没有表现出健康风险.也有学者通过盆栽试验外源添加抗生素对蔬菜安全性进行风险评估, 如刘娣[47]对不同类型的土壤中添加20mg·kg-1 的TC、CTC和OTC, 生长出的小白菜HQ值均低于0.002; Ahmed等[15]也对含有20 mg·kg-1的TC、CTC和OTC土壤种植出的黄瓜、西红柿和生菜进行测定, 结果同样是蔬菜中的抗生素含量远低于ADI标准, 对人体健康不构成威胁.本试验在土壤中添加的TCs含量均远高于土壤背景值, 但是在收获的生菜通过健康风险评估得到的HQ值也均＜1, 只有CTC在土壤中的含量达到1 350 mg·kg-1 时成人HQ＞0.1, 3种TCs分别在450 mg·kg-1以上, 儿童HQ＞0.1, 其余处理均＜0.1, 因此, 可以认为, 当TCs在土壤中的含量不超过150 mg·kg-1时, 抗生素通过蔬菜的途径对人体健康的威胁可以忽略不计.虽然如此, 也不能排除有别的蔬菜对抗生素的富集能力更强, 风险更高, 如小白菜在土壤TCs含量为150 mg·kg-1时TCs的富集能力接近生菜的5倍[45].此外, 盆栽试验虽然可以很好地模拟蔬菜对抗生素的富集, 但在实际生产中仍需要大田试验去验证蔬菜通过有机肥施入导致的抗生素残留的风险.
需要说明的是, 使用该方法进行评估时, 每日食用蔬菜的量和人体体重是影响HQ结果的重要参数. Hanna等[49]采用的蔬菜消费量为成人276g·d-1, 儿童228.8g·d-1, 该数值参考的是2002年中国国家统计局公布的居民蔬菜日均消费量, 与目前中国居民蔬菜消费值相差较大; 也有学者采用生菜消费2.3 g·d-1进行计算[15], 该方法适宜于对多种蔬菜同时评估是进行加权计算, 对单一蔬菜进行评估时显然会使结果偏低; 本文参考的是中国膳食指南(2016)[31]的推荐值, 这和刘娣[47]所采用的标准是一致的, 该指南中成人和青少年对蔬菜的消费为300~500 g·d-1, 本文取平均值400 g·d-1, 该数值同WHO推荐值(400 g·d-1)一致, 也便于进行国际间比较.对人体体重选择上, Mahmoud等[29]采用成人60 kg儿童10 kg进行计算, Prosser等[28]和Liu等[48]则采用成人70 kg, 儿童12 kg, 其中儿童体重为1~3岁的幼儿体重参考值, 该年龄段人群对蔬菜的食用量非常少且缺少参考数据, 因而不适用于蔬菜抗生素风险评估, 本文采用的是中国7岁儿童平均体重(约25 kg)作为参考值, 对应的蔬菜摄食量为中小学青少年的膳食指南中的400 g·d-1, 由于7岁以上的儿童青少年体重逐年增大, 因而得到的风险值为该年龄段的最高值, 也最为保险.
3.6 TCs在土壤中的降解抗生素可以通过光解、水解、氧化降解和生物降解等多种途径发生降解[50], 本研究中盆栽土壤在培养期间发生了自然降解, 其中OTC降解速率显著慢于TC和CTC, 这和Chen等[51]的研究结果类似.不同土壤中的TCs降解速率对照土＞根际土＞非根际土, 这可能是因为抗生素降解受到多种因素的影响, 除了植物直接吸收的因素外, 根际土壤生物活性强, 抗生素容易发生生物降解而含量降低; 对照土由于没有植物的郁闭, 土壤受到更多的阳光照射, 抗生素很容易发生光解; 而非根际土中的抗生素可能溶解在水分中, 随着根系吸收水分而迁移至根际土壤.Michelini等[13]通过类似的方法研究玉米和柳树根际土壤磺胺类抗生素的降解, 结果在根际土、非根际土和对照土中抗生素并没有表现出规律性的降解速率.土壤是一个非常复杂的环境, 要了解抗生素在土壤中的降解规律需要进一步开展研究.
3.7 TCs和生菜对土壤酶活性的影响土壤酶活性对外来有机污染物具有高度的敏感性, 因而常作为一项生态毒理学指标.本研究中, TCs对土壤过氧化氢酶的影响有些表现促进, 一些无显著影响或抑制, 这和施加抗生素种类和含量有关系.对脲酶表现出抑制的作用.这可能因为TCs加入土壤后, 与土壤脲酶分子中的活性部位巯基接合, 形成较稳定的化合物, 抑制了脲酶的活性[52].研究外源添加四环素时, 在较低含量下即引起了土壤过氧化氢酶和脲酶的较大波动, 但随着时间的推移, 在第50 d时对土壤酶活性没有显著影响, 一方面因为土壤中抗生素降解致使含量较低, 另一方面因为土壤微生物对抗生素产生适应性.本研究中, 土壤过氧化氢酶活性根际土＞非根际土＞对照土, 这是因为根际土壤根系分泌物和残渣使得微生物数量多, 活性高, 而土壤脲酶活性非根际土＞根际土＞对照土, 这可能和土壤追施尿素与采样测酶的间隔时间有关系.
3.8 TCs和生菜对土壤微生物丰度的影响细菌、真菌和放线菌数量是比较直观和快捷反映土壤微生物丰度的指标.本试验测定了3种TCs在不同含量梯度下对根际土壤、非根际土壤和空白土壤中的3类微生物数量. 结果显示：3类微生物在土壤中的数量细菌＞放线菌＞真菌, 与Mancini等[53]的研究结果类似.细菌和真菌数量在不同土壤中：根际土＞非根际土＞对照土.在根际土和非根际土中, 3种TCs在150~1 350 mg·kg-1的含量区间细菌和真菌数量均随着含量的升高而降低.抗生素进入土壤后, 通常会对土壤微生态系统产生破坏, 抑制土壤微生物的生长与繁殖[54, 55].四环素类抗生素对微生物的生态毒性体现在, 四环素类抗生素通过同细菌核糖体30S亚基A位点的结合, 从而阻止酰胺基-tRNA与该位点的结合, 抑制细菌翻译过程进而影响菌体蛋白质的合成, 从而抑制细菌的生长繁[56].四环素类抗生素对微生物毒性效应的高低主要取决于抗生素、微生物和土壤的种类, 以及抗生素的剂量和作用时间等.
4 结论(1) TCs可以降低生菜光合色素含量, 抑制生菜光合作用, 同时激发抗氧化酶活性升高, 继而减少生菜的生物量.生菜的生物量、净光合速率会随着土壤TCs含量的升高而降低, SOD、POD和CAT会随着土壤TCs含量的升高而降低, 根系的抗氧化酶活性敏感程度高于地上部分, 不同种类的TCs在不同的含量水平下的毒性效果表现不同.
(2) 生菜对TCs的吸收量随土壤TCs含量增加而增加, 富集能力和转运系数随土壤TCs含量增加而降低; 不同部位的TCs富集系数根系＞地上部分; 不同种类TCs的转运系数在不同含量水平下表现不同.
(3) TCs残留通过生菜摄入人体所构成的安全风险非常小.土壤TC、CTC和OTC含量≤150 mg·kg-1时生长的生菜对儿童没有健康风险(HQ＜0.1), CTC含量≤450 mg·kg-1时、TC和OTC含量≤1 350 mg·kg-1时对成人没有健康风险(HQ＜0.1).
(4) TCs在盆栽土壤中会发生自然降解, 不同土壤中的降解速率：对照土＞根际土＞非根际土, OTC在土壤中的降解速率显著低于TC和CTC.
(5) 高含量的TCs(150~1 350mg·kg-1)处理显著抑制土壤中的脲酶和根际土中的过氧化氢酶活性, 减少土壤细菌和真菌的数量.
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