环境科学  2021, Vol. 42 Issue (3): 1488-1495   PDF    
引用本文
贺赟, 李魁晓, 王佳伟, 王慰, 樊鹏超, 陈行行, 王军静. 不同季节城市污水处理厂微生物群落特性[J]. 环境科学, 2021, 42(3): 1488-1495.
HE Yun, LI Kui-xiao, WANG Jia-wei, WANG Wei, FAN Peng-chao, CHEN Hang-hang, WANG Jun-jing. Microbial Community Structure of Waste Water Treatment Plants in Different Seasons[J]. Environmental Science, 2021, 42(3): 1488-1495.
不同季节城市污水处理厂微生物群落特性
贺赟1,2,3, 李魁晓1,2,3, 王佳伟1,2,3, 王慰1,2,3, 樊鹏超1,2,3, 陈行行1, 王军静1,2,3     
1. 北京城市排水集团有限责任公司, 北京 100044;
2. 北京城市排水集团有限责任公司科技研发中心, 北京 100124;
3. 北京市污水资源化工程技术研究中心, 北京 100124
收稿日期: 2020-07-02; 修订日期: 2020-08-24
基金项目: 国家重点研发计划项目（2018YFC0406305）
作者简介: 贺赟(1992~), 女, 硕士, 主要研究方向为污水微生物学与资源化利用, E-mail: heyun1116@163.com
通信作者: 李魁晓, E-mail: kuixiao_li@163.com
摘要: 不同季节污水处理厂由于水质和温度等的变化而导致处理效果不同.为了解不同季节污水处理系统活性污泥中细菌群落结构及其多样性的变化规律，本研究选取了5座不同处理工艺的污水处理厂，分别在夏季（气温28℃±2℃，水温24.9℃±1.1℃）和冬季（气温0℃±3℃，水温16.8℃±1.3℃）两个时间点采集了60份活性污泥样品，采用高通量测序技术对其微生物群落结构特征进行了解析.结果表明，不同污水处理厂主要优势菌属的相对丰度存在极显著性差异，而同一污水处理厂不同处理单元（厌氧池、缺氧池和好氧池）中活性污泥细菌微生物群落结构相似.同时冬夏两季的优势菌属也存在差异，夏季主要优势菌属SJA-15、Ferruginibacter和Blastocatellaceae的相对丰度分别为6.07%、4.50%和4.44%，冬季主要优势菌属硝化螺旋菌属Nitrospira、甲基娇养杆菌属Methylotenera和RBG-13-54-9的相对丰度分别为10.17%、3.96%和3.28%.环境因子关联分析表明，温度、总氮、NH4+-N、总磷和化学需氧量是影响微生物群落结构的主要环境因子，并且在这些环境因子中，温度对群落结构影响最大，其次是总氮.同时，功能酶的预测分析表明，冬季污水处理厂活性污泥中参与氮循环关键酶相对丰度高于夏季.上述结果表明，温度、水质和处理工艺均会影响污水处理系统活性污泥中细菌群落结构，包括优势细菌及其丰度.
关键词: 污水处理厂(WWTPs)      活性污泥      微生物      群落结构      温度     
Microbial Community Structure of Waste Water Treatment Plants in Different Seasons
HE Yun1,2,3 , LI Kui-xiao1,2,3 , WANG Jia-wei1,2,3 , WANG Wei1,2,3 , FAN Peng-chao1,2,3 , CHEN Hang-hang1 , WANG Jun-jing1,2,3     
1. Beijing Drainage Group Co., Ltd., Beijing 100044, China;
2. Research and Development Center of Beijing Drainage Group Technology, Beijing 100124, China;
3. Beijing Wastewater Resourceful Engineering Technology Research Center, Beijing 100124, China
Abstract: Wastewater treatment plants (WWTPs) have different treatment effects during different seasons due to changes in water quality and temperature. To understand bacterial community structure and diversity dynamics in the WWTPs, this study employed high-throughput sequencing technology during winter and summer. A total of 60 activated sludge samples were collected in five WWTPs in Beijing with different treatment processes in summer (temperature=28℃±2℃, water temperature=24.9℃±1.1℃) and winter (temperature=0℃±3℃, water temperature=16.8℃±1.3℃). The relative abundances of dominant bacterial genera in activated sludge varied significantly between the WWTPs but microbial community structure was typically similar between different treatment units (i.e., the anaerobic tank, anoxic tank, and aerobic tank) at each WWTP. At the same time, different bacteria dominated in winter and summer, when the relative abundance of SJA-15, Ferruginibacter, and Blasocatellaceae was 6.07%, 4.50%, and 4.44% respectively, when the relative abundance of Nitrospira, Methylotenera, and RBG-13-54-9 in winter was 10.17%, 3.96%, and 3.28%, respectively. Correlation analysis showed that temperature, total nitrogen (TN), NH4+-N, total phosphorus (TP), and chemical oxygen demand (COD) were the main environmental factors affecting microbial community structure, of which temperature had the greatest effect on species composition followed by TN. Furthermore, a predictive analysis of functional enzymes indicated that the abundance of key enzymes involved in the nitrogen cycle in the activated sludge of WWTPs is higher in winter than that in summer. These results show that temperature, water quality, and treatment process affect bacterial community structure (i.e., dominance and abundance) in WWTP activated sludge.
Key words: wastewater treatment plants(WWTPs)      activated sludge      microorganisms      community structure      temperature     

随着人口的增加、经济的高速发展和人民生活水平的提高, 我国污水排放总量不断增加.城市污水处理厂(wastewater treatment plant, WWTP)是保障水环境安全和实现城市可持续发展的重要基础设施.我国城市污水处理厂普遍采用活性污泥法处理污水, 例如A2/O法、氧化沟法和SBR法等活性污泥法.其中微生物是去除污水中污染物的主体, 是系统稳定运行的基础[1], 因此理解污水处理中微生物的群落结构和功能, 对控制和提高污水处理的稳定性具有重要作用[2].

微生物常以污泥状絮凝物的形式存在于城市污水生物处理系统中, 参与常规污染物(碳、氮、磷)和微量污染物的去除和代谢等过程.一个污水处理系统的性能与系统内微生物群落结构密切相关[2, 3].环境因素会影响生化处理工艺的运行效果, 如温度和进水水质等, 其中温度会影响活性污泥培养驯化效果和启动周期等[4], 低温会对微生物的数量和物种组成产生影响, 延长系统启动时间和限制系统处理效率[5].认识污水处理系统微生物群落是认识污水生物处理本质的前提, 有助于指导污水处理系统的优化设计.然而微生物具有数量巨大、个体微小、多样性丰富和可培养性低等特征, 导致经典培养法对微生物群落开展研究十分困难[6].现有的高通量测序技术促使了大量不可培养菌的发现, 生物信息学方法的发展为大数据处理提供了极大便利, 推动了微生物群落规律的揭示[7~9].近年来, 高通量解析技术开始被应用于微生物群落动态变化的研究, 不仅提供了总群落的结构变化特征, 也提供了微生物群落组和环境条件的变化信息[10, 11].

为了解不同季节污水处理系统活性污泥中细菌群落结构及其多样性的变化规律, 为污水处理系统稳定运行和精准调控提供理论依据[12].本研究选取了北京市不同处理工艺的5座污水处理厂, 采集污水处理厂生物池活性污泥, 采用高通量测序技术主要从不同温度条件(冬夏两季), 污水处理厂和水处理单元2个空间维度, 门和属两个水平对操作分类单元(operation taxonomy unit, OTU)所属的物种信息进行分析, 从而分析污水处理系统活性污泥中细菌微生物群落组成特征、研究环境因子对微生物群落的影响、对比功能微生物群落的特征及优势微生物并预测不同季节功能性酶丰度, 以期对污水处理厂的优化设计与运行提供基础数据和理论分析.

1 材料与方法 1.1 样品采集与理化分析

A、B、C、D和E为北京市的5座市政污水处理厂, 分布在北京市的北部、东部与南部区域, 样品采集时间为8月(夏季)和12月(冬季), 采样点在污水处理厂生物池不同处理单元：厌氧池、缺氧池和好氧池, 分别在每个处理单元中段取样, 每个点取500 mL活性污泥.共采集60个泥水混合样, 其中夏季30个, 冬季30个.采样点具体信息见表 1.

表 1 采样点信息及污水处理厂工艺 Table 1 Sampling point information and treatment technology of the studied WWTPs

水质指标使用多参数水质仪(HACH, 美国)现场测定, 包括温度(T)、pH值和溶解氧, 化学需氧量(COD)测定使用快速消解分光光度法(HACH, 美国), 总氮(TN)的测定使用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(GB/T 11894-1989), 总磷(TP)的测定使用钼酸铵分光光度法(GB/T 11893-1989), 氨氮(NH4+-N)的测定使用纳氏试剂比色法(HJ 535-2009).

1.2 样品预处理及高通量测序

将采集的活性污泥样取50 mL离心后得到固态污泥, 从污泥中提取样品总DNA后, 采用引物对338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)通过Illumina MiSeq测序平台完成样品细菌16S rDNA高通量测序.

1.3 数据分析

将所得序列进行相似性分析, 并划分OTUs(相似性大于0.97), 随后, 使用QIIME[13](version 1.8.0)软件中的UCLUST[14]对Tags在97%的相似度水平下进行聚类、获得OTUs, 有效序列与SILVA数据库(http://www.arb-silva.de)进行对比并对OTUs进行分类学注释, 并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成与OTUs信息.参考Fang等[15]的微生物α多样性指数算法计算Chao(物种丰度)指数、Shannon(物种多样性)指数和Coverage(覆盖度)指数.群落结构柱状图基于R语言工具作图.样本β多样性分析基于R语言主要坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)统计分析和作图.冬夏两季物种差异的两组比较基于Wilcoxon符号秩检验使用R的stats包和python的scipy包进行分析和作图.环境因子关联分析的冗余分析(redundancy analysis, RDA)基于R语言vegan包中RDA分析和作图.为了比较冬夏两季污水处理系统功能酶的差异, 通过PICRUSt软件对OTUs丰度表进行标准化并计算各功能类别丰度, 用于预测KEGG类别和功能酶[16].

2 结果与讨论 2.1 污水处理厂活性污泥中细菌群落的α多样性分析

本研究对北京市5座污水处理厂冬夏两季共计60个活性污泥样进行了高通量测序分析.夏季采样水温为24.93℃±1.12℃, 冬季采样水温为16.75℃±1.30℃.60个样本共计得到平均有效序列数60 190个, 构建OTUs并且获得注释信息的Tags数目30 714~49 279, 按最小样本序列数30 714进行抽平, OTUs平均有665个, 其中夏季样本特有OTUs 1 158个, 冬季样本特有OTUs 1 094个, 冬夏季共有的OTUs 3 434个.

不同污水处理厂在冬夏两季活性污泥中细菌群落的α多样性见图 1.图 1 (a)中随着样本读取数的增加, 观察到的OTUs数趋向平缓, 表明样本的测序深度足够.图 1(b)中所有样本的Coverage指数均大于0.98表明测序深度足够, 结果可靠.Chao指数与Shannon指数分别反映了群落丰富度[17]与群落多样性[18].冬夏两季的Chao指数不存在显著性差异, 冬季的Shannon指数显著低于夏季, 表明温度影响微生物群落多样性且低温降低活性污泥中微生物多样性[图 1 (c)和1 (d)].总体上, 各污水处理厂冬夏两季活性污泥中微生物α多样性较均匀, 表明各污水处理厂在长时间运行过程中形成了自我调节机制受温度波动影响较小[19].

(a) 观察到的OTUs数; (b) OTU水平的Coverage指数; (c) OTU水平的Chao指数; (d) OTU水平的Shannon指数 图 1 不同污水厂活性污泥样在冬夏两季的α多样性 Fig. 1 The α diversity of activated sludge samples from different WWTPs in winter and summer

2.2 污水处理厂活性污泥中细菌群落结构分析

本研究主要从不同温度条件(冬夏两季), 在污水处理厂和水处理系统处理单元这2个空间尺度, 门和属两个水平对OTU所属的物种信息进行分析, 从而揭示污水处理系统活性污泥中细菌群落组成特征.不同温度条件(冬夏两季), 在门水平下, 活性污泥中细菌群落结构见图 2(a).冬夏两季主要的优势菌门有：变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae), 此结果与Ma等[20]通过测序分析活性污泥中微生物群落的研究相似.其中Proteobacteria为最优势菌门, 在夏季和冬季的相对丰度分别为32.50%和41.34%, Proteobacteria是污水处理过程最主要的细菌类群[21, 22]. Chloroflexi和Bacteroidetes是继Proteobacteria之后的优势菌门, 普遍存在于污水处理厂生物池并参与有机物的降解[23].两个季节在门水平下, 相对丰度前7的菌门丰度均存在显著性差异(P < 0.05).结果表明在门水平下温度显著影响活性污泥中细菌群落结构.

(a) 冬夏两季, 门水平; (b) 夏季, 属水平(丰度前10); (c) 冬季, 属水平(丰度前10); (d) 不同污水处理厂, 属水平; (e) 不同处理单元, 属水平; (a)和(e)相对丰度 < 1.0%的归为others, (d)相对丰度 < 2.0%的归为others 图 2 不同温度、维度、水平下活性污泥中细菌微生物群落结构 Fig. 2 Structure of bacterial microbial communities in activated sludge at different temperatures, scales, and levels

在属水平下, 夏季和冬季活性污泥中细菌群落结构见图 2(b)和2(c).夏季主要优势菌属SJA-15、Ferruginibacter和Blastocatellaceae的相对丰度分别为6.07%、4.50%和4.44%; 冬季主要优势菌属硝化螺旋菌属(Nitrospira), 甲基娇养杆菌属(Methylotenera)和RBG-13-54-9的相对丰度分别为10.17%、3.96%和3.28%.且Nitrospira、Ferruginibacter和RBG-13-54-9的相对丰度在冬夏两季存在极显著性差异(P < 0.001).图 2(a)~2(c)结果表明, 温度显著影响微生物群落结构, 冬季丰度较高菌属或具有更强的低温功能性, 例如检测到的Nitrospira是氨氧化细菌(AOB)和亚硝酸盐氧化细菌(NOB)中的主要菌属且具有低温脱氮性能[24, 25], 进一步分析这些微生物的特性和性能可以对污水处理系统低温条件运行提供优化指导或低温应急方案[26].

不同污水处理厂, 属水平下[图 2(d)], 活性污泥细菌微生物群落结构存在显著性差异, 例如Blastocatellaceae、RBG-13-54-9、Saprospiraceae和SJA-15等的相对丰度在不同污水处理厂中存在极显著性差异(P < 0.001), 表明处理工艺和进水水质会影响微生物群落结构.不同处理单元, 属水平下[图 2(e)], 厌氧池、缺氧池和好氧池这3个污水处理单元的活性污泥中, 丰度在前100的菌属中, 只有丰度排名25的Methylotenera菌属在不同处理单元存在显著性差异(P < 0.05), 表明不同处理单元的细菌种群组成相似, 微生物群落结构较为稳定.污水处理过程中活性污泥经厌氧池、缺氧池和好氧池后到二沉池又回流部分至厌氧池形成一个大的循环体系, 因此微生物种群组成相似, 但在不同的处理单元不同的微生物占据优势功能作用.这和Zhang[27]等及马美玲等[28]分析的污水处理系统(厌氧池、缺氧池和好氧池)中微生物群落结构结果类似, 这3个处理单元中优势菌属相同, 微生物群落演替不明显.

污水处理厂活性污泥中细菌群落物种组成分析表明, 细菌群落物种组成受温度、污水处理厂处理工艺和进水水质的影响, 而在生物池不同处理单元中活性污泥细菌微生物种群组成相似.

2.3 污水处理厂活性污泥中细菌群落差异分析

基于PCoA方法在门、纲和属水平下对冬夏两季不同污水处理厂的样品进行了群落结构分析, 结果如图 3所示：整体上, 夏季和冬季两个季节的活性污泥中细菌群落倾向于各自聚为一类, 表明温度影响活性污泥中细菌微生物群落.具体看, 各污水处理厂内部的活性污泥中细菌微生物群落聚类在一起, 同时来自A、B、C和E这4座污水处理厂的细菌微生物群落聚类在一起, D污水处理厂的微生物群落聚类在一起, 即各污水处理厂不同处理单元的微生物群落具有很强相似性, 其次A、B、C和E这4座污水处理厂的微生物群落具有较强相似性, D污水处理厂和其它4厂的微生物群落结构存在差异.此结果和上述群落结构分析结果类似, 温度、水厂工艺和进水水质均会影响活性污泥中微生物群落[29].同时推测D水厂和其它水厂细菌微生物群落差异性较大的原因, 可能为全地下式水厂的暗环境影响了群落结构, 有研究表明暗环境会影响细菌微生物群落多样性和群落组成[30]; 同时全地下式的D水厂水温温差较其它水厂低3℃左右, 这也是导致D水厂和其它水厂微生物群落存在较大差异的另一原因.

图 3 基于PCoA的污水处理厂活性污泥细菌微生物群落差异分析 Fig. 3 PCoA-based analysis of bacterial community differences in activated sludge in WWTPs

2.4 污水处理厂活性污泥中细菌微生物与水环境因子的相关性

采样点水温及采样当月污水处理厂进出水水质见表 2, 各污水处理厂污染物处理效率均较高且在冬夏两季均可达标排放.结合采样点水质, 对属水平的细菌与水环境因子进行RDA分析.

表 2 污水处理厂进出水水质 Table 2 Water quality of WWTPs

反映菌群与环境因子之间关系的RDA分析结果见图 4.经过方差膨胀系数(variance inflation factor, VIF)检验, TN、NH4+-N、TP、COD和温度(T)这5个环境因子均能影响微生物群落分布, Wang等[31]的研究也表明, 进水水质特征会影响污水处理系统中微生物群落结构.图 4中环境因子之间夹角大多 < 90°, 表明环境因子之间除COD与温度是负相关, 其它两两之间都是自相关的, 自相关的环境因子对微生物群落产生协同作用, 且在这些环境因子中根据箭头长短可以看出, 温度对物种组成影响最大, 其次是TN.细菌微生物与水环境因子的RDA分析进一步表明, 温度和污水处理厂进水水质均会影响污水厂活性污泥中细菌微生物群落.除D水厂样本, 其它水厂夏季样本与COD负相关与其它理化因子正相关, 而冬季的大部分样本与进水污染物浓度正相关与温度负相关.硝化螺旋菌属(Nitrospira)、SJA-15和COD正相关, 与其它理化因子负相关, Nitrospira与TN的浓度呈负相关的原因可能是Nitrospira类NOB在底物氮浓度非常低的时候更有竞争力[32]; Blastocatellaceae和甲基娇养杆菌属(Methylotenera)等更多菌属和COD负相关, 与其它理化因子正相关.

图 4 属水平的细菌微生物与水环境因子的RDA分析 Fig. 4 RDA analysis of genus-level bacterial microorganisms and water environmental factors

2.5 温度对污水处理厂活性污泥中关键功能酶的影响

图 5展示了基于PICRUST预测分析的冬夏两季污水处理所关注的5种代谢功能酶的相对丰度.基于氮和磷去除相关功能酶预测, 与氨氧化细菌相关的羟胺氧化酶(hao)的相对丰度在冬夏两季无显著性差异, 但是冬季与反硝化相关酶的相对丰度有两组更高.对于磷的去除, 多磷酸盐形成酶的相对丰度在冬夏两季无显著性差异, 聚3-羟基丁酸酯(PHB)降解的酶在冬季相对丰度更高.冬季北方污水厂活性污泥浓度在4 500 mg·L-1左右, 夏季污泥浓度在3 500 mg·L-1左右, 有研究表明污泥浓度会影响活性污泥中微生物功能基因丰度, 具有高污泥浓度的活性污泥中硝化酶、反硝化酶、氨化酶的相关功能基因高于低污泥浓度污泥[25].功能酶的预测分析表明, 冬季污水处理厂活性污泥中参与氮循环关键酶丰度要高于夏季, 一方面是因为冬季活性污泥浓度较高, 另一面是参与氮循环的一些菌属如Nitrospira等生长温度较广[24].在此基础, 通过微生物群落结构分析及功能预测剖析污水处理厂性能仍需进一步研究.

硝化作用：hao(羟胺氧化酶); 反硝化作用：nar(硝酸还原酶), nir(亚硝酸盐还原酶), nor(一氧化氮还原酶), nos(一氧化二氮还原酶); 多磷酸盐形成：ppk(多磷酸盐激酶); 聚3-羟基丁酸酯(PHB)降解：phdp(聚-β-羟基丁酸酯聚合酶), hdh(3-羟基丁酸脱氢酶), hh(羟基丁酸二聚体水解酶) 图 5 冬夏两季5种代谢功能酶相对丰度的预测分析 Fig. 5 Prediction and analysis of the relative abundance of five metabolic functional enzymes in winter and summer

3 结论

(1) 细菌群落的α多样性分析表明, 温度影响污水处理厂活性污泥中细菌微生物群落多样性且低温降低微生物多样性.

(2) 微生物群落物种结构分析表明, 细菌群落物种组成受温度、污水处理厂处理工艺和进水水质的影响, 不同污水处理厂主要优势菌属的相对丰度存在极显著性差异, 而同一污水处理厂不同处理单元(厌氧池、缺氧池和好氧池)中活性污泥细菌微生物群落结构相似.夏季主要优势菌属SJA-15、Ferruginibacter和Blastocatellaceae的相对丰度分别为6.07%、4.50%和4.44%, 冬季主要优势菌属Nitrospira、Methylotenera和RBG-13-54-9的相对丰度分别为10.17%、3.96%和3.28%.

(3) 环境因子关联分析表明: 温度、TN、NH4+-N、TP和COD是影响微生物群落结构的主要环境因子, 并且在这些环境因子中, 温度对物种组成影响最大, 其次是TN, 此结果进一步表明, 温度和污水处理厂进水水质均会影响细菌群落.

(4) 功能酶的预测分析表明冬季污水处理厂活性污泥中参与氮循环关键酶丰度要高于夏季.

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