汞(Hg)是一种全球性的污染物, 能够长距离迁移, 且会造成持久的污染^[1~3]. 1956年日本发生水俣病事件后使人们认识到汞, 特别是甲基汞(methylmercury, MeHg)对人体的危害.汞在自然条件下会发生甲基化反应生成MeHg, 其生物毒性远高于无机汞, 已经被我国列入“中国环境优先污染物黑名单”^[4].在水生生物食物链中, 由于甲基汞的生物放大作用, 高营养级的水生动物体内往往能富集高浓度的MeHg^[5], 人群食用水产品则是甲基汞暴露的主要途径.然而有研究表明, 汞矿区稻米中汞, 特别是MeHg含量同样很高, 我国部分汞矿区污染土壤生产的稻米甲基汞含量高达180 μg·kg^-1[6], Horvat等^[7]调查贵州省万山汞矿区, 发现稻米中的总汞含量高达569 μg·kg^-1, 甲基汞含量为145 μg·kg^-1.Feng等^[8]和Zhang等^[9]的研究发现, 汞矿区居民食用大米是人体MeHg暴露的主要途径, 其摄入量占总摄入量的比例高达90%以上, 汞矿区居民从大米中摄取MeHg的量远高于其他食物^[10].

稻米是世界上最重要的粮食作物之一, 目前全球水稻种植面积大约有1.43×10⁹ hm^2[11], 全球有近一半的人口是以大米为主要膳食的.中国是全球最大的水稻生产国, 2017年水稻种植面积达到3×10⁷ hm^2[12].然而在中国有超过1.6%的耕地土壤的汞含量超标^[13], 但由于土地资源的匮乏, 中国许多地区仍然使用汞污染土壤来种植水稻.因此, 对于以大米为主食的国家, 汞污染大米的食用正成为一个亟待解决的健康问题^{[14, 15]}, 如何抑制MeHg在稻田中的生成及其在稻米中的富集, 是急需解决的重要问题.

传统的物理、化学和生物修复法可以修复土壤汞污染, 但由于处理效果不佳、易产生二次污染或者破坏土壤结构等缺点, 目前应用较少.而生物炭作为一种新型吸附材料, 具有较大的比表面积、丰富的表面含氧官能团以及吸附位点和大量的碳纤维素等特点, 使其受到众多学者的关注.生物炭不仅能有效地改善土壤的性质, 增加土壤的肥力, 还能改变土壤中重金属的形态, 固化活化态的重金属, 从而降低重金属在土壤环境中的生物有效性^[16~19].有研究表明, 当生物炭添加到汞污染土壤中后, 会通过化学吸附钝化汞, 降低有效汞的含量^[20]; 并且随着添加量的增加, 钝化的汞越多, 有效地降低了植物体内的汞含量^[21].这些研究都提供了生物炭可以将甲基汞固定在土壤中从而降低水稻可食用部分汞含量的初步证据.但是, 以往大部分的研究都局限于添加普通生物炭, 通常需添加较高量的生物炭(炭土比为3%~10%, 67.5~225 t·hm^-2)才显效果^[22~24], 治理成本极高, 难以推广应用.因此, 寻求高效和低成本的稻田甲基汞抑制方法极为重要.

壳聚糖是天然高分子材料甲壳素脱乙酰基的产物, 表面含有大量的氨基(—NH₂)、羟基(—OH)以及酰胺基(—CO—NH₂), 并且其聚合物链具有柔性结构, 使其对重金属离子有很强的吸附作用.目前将壳聚糖应用于含汞废水处理的研究较多^[25~27], 而在土壤汞污染修复中的应用相对滞后.相比于水体来说土壤是一个复杂的生态系统, 壳聚糖施于土壤后不仅能吸附土壤中的Hg²⁺, 而且还会改变土壤的理化性质甚至会改变土壤中微生物的群落结构, 从而影响植物对汞的吸附^[28].也有研究表明, 在模拟镉和汞复合污染的土壤中添加壳聚糖, 土壤中有效态的Hg²⁺和Cr⁴⁺都显著降低^[29].韩怡新等^[30]的研究发现, 在汞污染土壤中添加壳聚糖改性蒙脱土后, 土壤中MeHg含量最高可降低49.79%.由于天然壳聚糖机械强度较弱, 在水环境中的稳定性较差, 易于流失而无法成为高性能汞离子吸附剂.为此, 本研究以活性炭为载体, 将壳聚糖负载其上, 制备成壳聚糖改性生物炭, 尝试添加远低于已有研究中生物炭添加量(炭土质量比为3%~10%, 67.5~225 t·hm^-2)的壳聚糖改性生物炭(炭土质量比为0.2%, 4.5 t·hm^-2), 以期达到有效降低稻米MeHg富集的目标.

供试生物炭为松塔生物炭(贵州时科金年生物科技有限公司, 贵州省毕节市), 将壳聚糖按3%的量溶解于pH 4~5的酸性水溶液中搅拌2 h, 待完全溶解后, 将松塔生物炭与该溶液按顺序分别投入超临界二氧化碳(scCO₂)装置中, 在转速为120 r·min^-1, 温度为40℃, 压力为20 MPa的反应条件下反应2 h后, 快速泄压, 取出生物炭, 然后用乙醇反复清洗, 并于80℃的真空干燥箱中干燥12 h, 制得壳聚糖改性生物炭待用.

供试水稻品种为“丰优210”, 由隆平种业有限公司提供, 经大田育秧后, 选用大小基本一致的水稻幼苗供试.

供试土壤采集于西南大学试验农场耕地表层0~20 cm土壤, 该土壤为侏罗纪沙溪庙组紫色沙泥岩发育的中性紫色土, 供试土壤的基本性质如表 1所示.将供试土壤去除大颗粒砂石和植物残体后, 自然风干, 磨碎过2 mm筛, 并添加外源汞至土壤汞含量约为5mg·kg^-1后, 陈化备用.

表 1 (Table 1)

表 1 供试土壤基本性质 Table 1 Basic properties of tested soil 项目 pH SO42- /mg·kg-1 NH4+-N /mg·kg-1 有机质 /g·kg-1 THg /μg·kg-1 MeHg /ng·kg-1 土壤 7.5 22.4 43.3 9.1 169.1 26.8

表 1 供试土壤基本性质 Table 1 Basic properties of tested soil

本试验共设3个处理, 包括未添加生物炭的对照处理(CK1)、添加未改性生物炭的对照处理(CK2)和添加壳聚糖改性生物炭处理(CMBC), 每个处理均设6个平行, 共18盆.选择上口直径245 mm, 下口直径210 mm, 高245 mm的聚乙烯花盆作为盆栽容器.于2019年5月8日称取7 kg加外源汞陈化后的供试土壤18份, 每份土壤各添加N、P和K元素分别为150、100和85 mg·kg^-1的基肥, 其中6份混匀后装盆, 为CK1处理, 6份各添加未改性生物炭14 g(生物炭含量为2 g·kg^-1, 即炭土比0.2%), 混匀后装盆, 为CK2处理, 另6份各添加壳聚糖改性生物炭14 g(生物炭含量为2g·kg^-1, 即炭土比0.2%), 混匀后装盆, 为CMBC处理.每盆加水淹过土壤2 cm后稳定一周, 于2019年5月15日插秧, 每个盆栽中插入两株水稻幼苗, 在玻璃网室培养.在水稻的整个生长过程中定期用自来水进行浇灌, 且保持水位在土壤上方2 cm左右.

水稻生长过程中采集间歇水样品、土壤样品以及植物样品.水样在插秧之后每隔一周采集一次, 用间歇水采样器(购于SHANGHAI SAFE BIOTECH公司, 采样器自动过滤10μm滤膜)采集水稻间歇水样品, 采集后保存于4℃冰箱中.土样每隔两周采集一次, 用多位点采集法(两颗植株中间位点以及外围“十”字方向上4个位点)采集水稻土壤样品, 采集后用冷冻干燥机(ZX-LGJ-18, 上海知信实验仪器技术有限公司)冻干, 磨碎, 过100目筛, 用自封袋密封, 冰箱冷藏保存.在水稻生长过程中的第7(返青期)、35(分蘖期)、63(拔节期)、76(扬花期)和110d(成熟期)分别采集水稻的根(root)、茎(stem)、第一片叶(f-leaf)、第二片叶(s-leaf)、中间叶(m-leaf)、老叶(o-leaf)、稻壳(rice hull)和稻米(rice), 先用自来水冲洗, 再用纯水清洗干净后冻干称重, 粉碎, 过100目筛, 用自封袋密封, 冰箱冷藏保存.

MeHg：间隙水样酸化后150℃蒸馏, 水样被蒸出80%~85%时将蒸馏液倒入起泡瓶中, 用气相色谱-冷原子荧光光谱法测定^[31](CVAFS, Brooks Rand Ⅲ型, 美国); 土壤样品加入CuSO₄溶液(GR)和25%的硝酸(GR)浸提, 用二氯甲烷萃取, 之后用水相反萃取, 用GC-CVAFS法测定; 水稻样品先用KOH-甲醇(GR)在75~80℃水浴消解3 h, 用HCl(GR)调节至酸性, 之后用二氯甲烷萃取, 水相反萃取, 用GC-CVAFS法测定.

THg：水样酸化后加入200 μL BrCl(GR)氧化至少12 h, 将水中各种形态的Hg氧化为Hg²⁺, 在测定前30 min加入200 μL盐酸羟胺(GR)还原多余的BrCl, 起泡瓶中加入2 mL SnCl₂(GR), 取适量样品加入起泡瓶中, 将Hg²⁺全部还原为Hg⁰, 再用冷原子荧光光谱法测定^[32](Model 2500型, tekran, 美国); 土壤样品中加入现配的王水5 mL, 水浴95℃加热5 min后再加1 mL BrCl继续水浴30 min, 定容放置24 h, 测定前30 min加200 μL盐酸羟胺, 用SnCl₂还原, 用冷原子吸收测汞仪(F732-VJ型, 上海华光仪器仪表厂)测定; 水稻样品加入现配的HNO₃(GR)/H₂SO₄(GR)(体积比4∶1), 95℃水浴消解3 h, 加500 μL BrCl氧化, 定容放置24 h, 测定前30 min加200 μL盐酸羟胺, 用2 mL SnCl₂还原, 用冷原子吸收测汞仪测定.

本试验所用的玻璃器皿均用硝酸(25%体积比)浸泡24 h, 超纯水(Milli-Q)洗净后, 在马弗炉内500℃高温灼烧30min, 在无汞环境中冷却.分析过程中采用空白试验和平行样品试验, 用GSB04-1729-2004[Hg(NO₃)₂ standard solution]进行加标回收.土壤及水稻植株样品MeHg和THg测定中分别使用TORT-2(National Research Council Canada)和GBW 10016(GSB-7, 地球物理化学勘查研究所)进行质量控制, 加标回收率分别在89%~105%和83%~106%.测定方法检出限分别为0.002 μg·kg^-1和0.01 μg·kg^-1, 样品重复测定相对标准偏差(RSD)分别不超过5%和8%

用Excel 2019和SPSS 23.0进行数据分析, 并用Origin 2018绘图.

如图 1所示, 在水稻整个生长过程中CK1、CK2和CMBC这3个处理中间隙水THg质量浓度分别在0.29~5.01、0.41~4.63和0.35~3.48 μg·L^-1范围内, 3个处理之间差异显著(P < 0.05); 5月22日时3个处理THg质量浓度分别为5.01、1.88和1.27 μg·L^-1, 其中CMBC处理THg质量浓度最低(P < 0.05), 这是由于在5月8日装盆时同时添加生物炭, 生物炭对Hg²⁺有一定量的吸附; 在扬花期之后THg质量浓度波动较小并且整体浓度也较小, 到9月2日, 即水稻生长的第110 d, 3个处理THg质量浓度分别为1.05、1.21和0.67 μg·L^-1.各处理MeHg质量浓度在6月26日时, 即水稻生长的第42 d达到最大; 在7月17日拔节期之前MeHg质量浓度较高, 但波动较大; 在7月30日扬花期前后MeHg质量浓度明显降低, 并趋于稳定.在水稻整个生长过程中, 3个处理MeHg质量浓度分别在0.054~1.09、0.035~1.03和0.028~0.61 μg·L^-1的范围内, 其中CMBC的MeHg质量浓度显著低于CK1(P < 0.05)及CK2(P < 0.05), 表明壳聚糖改性生物炭能够抑制间隙水中MeHg的生成.

图 1

Fig. 1

图 1 2019年水稻生长周期不同处理土壤间隙水汞浓度变化 Fig. 1 Hg concentration of interstitial water under different treatments in the rice growth period in 2019

水稻生长期间, 不同处理土壤THg、MeHg含量及甲基化率变化特征如图 2所示.从图 2(a)可知, CK1处理中土壤THg含量变化不大, 在2.79~3.79 mg·kg^-1范围内; 除去7月的17日及30日两个异常点之外, CK2处理土壤THg含量波动也较小, 在2.59~3.55 mg·kg^-1范围内; CMBC处理THg含量在2.76~4.35 mg·kg^-1范围内.从图 2(b)中可以看出3个处理中土壤MeHg含量相差较大, 分别在5.78~161.15、14.63~203.22和1.42~82.62 μg·kg^-1的范围内, CMBC的MeHg含量显著低于CK1(P < 0.05)及CK2(P < 0.01), 但土壤MeHg含量变化趋势基本一致, 都随着种植时间的推移, 土壤中MeHg含量逐渐升高.成熟期时3个处理的土壤MeHg含量分别为161.15、203.45和59.59 μg·kg^-1, CK2的MeHg含量极显著高于CK1(P < 0.01), 可能是由于生物炭会增加土壤中溶解性有机碳的含量, 可以提供微生物所需要的营养物质, 促进微生物的活性, 促进汞的甲基化, 以致添加未改性生物炭后土壤甲基汞含量高于未添加生物炭的对照组, CMBC处理中土壤MeHg含量极显著低于CK1(P < 0.01)和CK2(P < 0.01), 这是由于壳聚糖表面含有大量活性强的—NH₂和—OH, 可以螯合二价汞离子, 从而抑制MeHg的生成.图 2(c)为3种处理不同时期土壤中汞的甲基化率, 可见3个处理汞甲基化率都是逐渐增大的, 甲基化率分别在0.16%~4.41%、0.48%~6.74%和0.034%~2.16%的范围内, 可以看出CMBC处理土壤汞甲基化率低于CK1(P < 0.01)及CK2(P < 0.01).CMBC处理土壤汞甲基化率相比CK1降低了51.1%~79.1%, 说明土壤中添加壳聚糖改性生物炭可有效抑制汞的甲基化.

图 2

Fig. 2

图 2 2019年水稻生长周期不同处理土壤汞含量变化 Fig. 2 Hg content of soil under different treatments in the rice growth period in 2019

从表 2中可以看出, 添加生物炭的两个处理, 其植物干重都大于空白处理.CK2处理的根、茎、叶、籽粒干重分别是CK1处理的3.3、1.3、1.1和2.1倍, CMBC处理的根、茎、叶和籽粒干重分别是CK1处理的2.5、1.2、1.4和2.2倍.添加生物炭改善土壤性质, 可以在一定程度上增加水稻的生物量, 促进水稻植株的生长发育, 这与Shu等^[13]的研究结果相似.

表 2 (Table 2)

表 2 成熟期3种处理水稻植株各部位重量/g Table 2 Weight of different parts of the rice plant in three treatments in the ripening-stage/g 处理 根 茎 叶 籽粒 总量 CK1 7.2 27.1 17.2 15.5 67.0 CK2 23.4 35.9 18.6 33.2 111.1 CMBC 17.8 32.1 23.7 34.4 108.0

表 2 成熟期3种处理水稻植株各部位重量/g Table 2 Weight of different parts of the rice plant in three treatments in the ripening-stage/g

成熟期不同处理水稻根、稻米及稻壳中甲基汞含量如图 3所示, 由图 3(a)可知, CK1处理根部MeHg含量为(3.46±0.34)mg·kg^-1, CK2处理根部MeHg含量为(2.45±0.065)mg·kg^-1, 显著低于CK1处理(P < 0.05), 这是由于生物炭对甲基汞有一定的吸附能力, 从而减少了植物根系对甲基汞的吸收量, 尽管添加未改性生物炭之后土壤MeHg含量略微增加, 但水稻根部甲基汞含量仍低于未添加生物炭的对照处理.CMBC处理水稻根部MeHg含量为(0.93±0.046)mg·kg^-1, 比CK1(P < 0.05)低73.1%, 比CK2(P < 0.05)低62.0%, 这可能是由于添加壳聚糖生物炭后, 其表面的氨基和羟基能将土壤中的Hg²⁺固定, 抑制土壤中汞的甲基化, 从而降低了水稻根部MeHg的含量.

图 3

Fig. 3

图 3 成熟期不同处理水稻根及籽粒中汞含量变化 Fig. 3 Hg content of root and grain under different treatments in the rice growth period

从图 3(b)中可知, CK1、CK2和CMBC这3个处理水稻稻壳MeHg含量分别为(3.98±0.32)、(1.42±0.035)和(0.89±0.11)mg·kg^-1, CMBC处理稻壳中MeHg含量显著低于CK1(P < 0.05)和CK2(P < 0.05)处理, CK1处理MeHg含量是添加CMBC处理的4.47倍, CK2处理MeHg含量是CMBC处理的1.60倍.从3(c)中可知, 3个处理稻米MeHg含量分别为(11.69±1.34)、(10.54±0.050)和(2.86±0.10)mg·kg^-1, CMBC处理稻米中MeHg甲基汞显著低于CK1(P < 0.01)和CK2(P < 0.05), 比CK1低75.8%, 比CK2低72.9%.由此可见, CMBC处理能显著降低稻壳和稻米中MeHg的含量.

因此可以得出, 添加生物炭能抑制水稻可食用部分甲基汞的富集, 而添加壳聚糖改性后的生物炭对甲基汞富集的抑制能力更强.

(1) 生物炭能改善土壤性质, 在一定程度上增加水稻的生物量, 促进水稻植株的生长发育.

(2) 壳聚糖改性生物炭能有效地抑制水稻土中甲基汞的生成, 降低稻米甲基汞的含量.