环境科学  2021, Vol. 42 Issue (2): 850-859   PDF    
引用本文
周海东, 黄丽萍, 陈晓萌, 李丹妍, 李昕, 崔锦裕. 人工生态系统对城市河流中抗生素和ARGs的去除[J]. 环境科学, 2021, 42(2): 850-859.
ZHOU Hai-dong, HUANG Li-ping, CHEN Xiao-meng, LI Dan-yan, LI Xin, CUI Jin-yu. Removal of Antibiotics and Antibiotic Resistance Genes from Urban Rivers Using Artificial Ecosystems[J]. Environmental Science, 2021, 42(2): 850-859.
人工生态系统对城市河流中抗生素和ARGs的去除
周海东, 黄丽萍, 陈晓萌, 李丹妍, 李昕, 崔锦裕     
上海理工大学环境与建筑学院, 上海 200093
收稿日期: 2020-07-05; 修订日期: 2020-07-31
基金项目: 上海市自然科学基金项目(18ZR1426100)；上海理工大学科技发展项目(2018KJFZ117)
作者简介: 周海东(1971~), 男, 博士, 副教授, 主要研究方向为水环境修复与污水资源化, E-mail:zhouhaidong@usst.edu.cn
摘要: 通过室内模拟河道系统，以阿奇霉素(AZM)、磺胺甲唑(SMZ)、环丙沙星(CIP)和四环素(TCY)这4种抗生素和抗性基因(ARGs)：磺胺类(sul1和sul2)、四环素类(tetX和tetM)、喹诺酮类(qnrS和qnrD)、大环内酯类(ermB)和16S rDNA为目标物，研究2种挺水植物和铜绿微囊藻组合(菖蒲+灯芯草、藻+灯芯草、藻+菖蒲和藻+菖蒲+灯芯草)的人工生态系统不同介质(水相、泥相和植物)中抗生素的变化特性、对常规污染物(COD、NH4+-N、TP和TN)的去除效果以及在水相和泥相中ARGs的分布和去除效果.并通过物料衡算计算目标物的实际去除率，以及分析水相和泥相中ARGs丰度与环境因子之间的相关性.结果表明，所形成的人工生态系统对COD、NH4+-N、TP和TN去除率范围分别为60.2%~74.8%、63.4%~77.4%、64.0%~73.2%和46.8%~54.8%；对水相中抗生素有明显的去除效果，藻+菖蒲+灯芯草组合的人工生态系统对4种抗生素去除率最好；对泥相中抗生素去除率依次为TCY > CIP > AZM > SMZ，其中藻+菖蒲+灯芯草组合对TCY去除率达到53.5%；对抗生素的实际总去除率大小依次为藻+菖蒲+灯芯草>藻+灯芯草>藻+菖蒲>菖蒲+灯芯草.4类ARGs去除效果较明显，水相中的去除率要高于泥相；ARGs与常规污染物以及抗生素之间存在不同的相关性，其中水相中tetX与环境因子、泥相中AZM与之对应ARGs的相关性不显著，说明ARGs既可以在对应抗生素压力下选择，也可以在其他类型环境压力下选择，抗生素含量并不是直接影响ARGs的传播.本研究表明挺水植物和铜绿微囊藻组合的人工生态系统可作为净化水质和改善城市河流中抗生素环境风险的有效手段.
关键词: 挺水植物      抗生素      抗生素抗性基因      铜绿微囊藻      冗余分析      城市河流     
Removal of Antibiotics and Antibiotic Resistance Genes from Urban Rivers Using Artificial Ecosystems
ZHOU Hai-dong , HUANG Li-ping , CHEN Xiao-meng , LI Dan-yan , LI Xin , CUI Jin-yu     
School of Environment and Architecture, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China
Abstract: Four antibiotics[azithromycin (AZM), sulfamethoxazole (SMZ), ciprofloxacin (CIP), and tetracycline (TCY)], and the antibiotic resistance genes (ARGs)[sulfonamides (sul1 and sul2), tetracyclines (tetX and tetM), quinolones (qnrS and qnrD), macrolides (ermB), and 16S rDNA] were selected as target compounds. Artificial ecosystems were constructed with combinations of two emergent plants and Microcystis aeruginosa (Acorus calamus+Cordyceps, algae+Cordyceps, algae+Acorus calamus, and algae+Acorus calamus+Cordyceps) in an indoor-simulated river system. Throughout the artificial ecosystems, changes in antibiotic concentrations and other pollution indicators (i.e., COD, NH4+-N, TP, and TN) were monitored in different media (the aqueous phase, sediment phase, and in plants), and the distribution and removal of ARGs in aqueous and sediment phases were explored. Removal of the target compounds was calculated based on mass balance, and the correlation between ARG abundance and environmental factors in the aqueous and sediment phases was analyzed. The results showed that the constructed artificial ecosystem achieved removal rates of COD, NH4+-N, TP, and TN ranging from 60.2% to 74.8%, 63.4% to 77.4%, 64.0% to 73.2%, and 46.8% to 54.8%, respectively. The antibiotics in the aqueous phase were notably removed and the artificial ecosystem 'algae+Acorus calamus+Cordyceps' achieved the best removal efficiency for the four antibiotics. Removal rates of the antibiotics in the sediment phase were ranked in the order TCY>CIP>AZM>SMZ; the removal efficiency of TCY in the 'algae+Acorus calamus+Cordyceps' system reached up to 53.5%. The total removal rates of antibiotics obtained by the ecosystems were ranked in the following order:algae+Acorus calamus+Cordyceps > algae+Cordyceps > algae+Acorus calamus > Acorus calamus+Cordyceps. Removal of the four ARGs was very efficient and was higher in the aqueous phase than in the sediment phase. Correlations between the ARGs, the other pollution indicators, and the antibiotics were variable; tetX and environmental factors were correlated in the aqueous phase, while AZM and its corresponding ARGs were not significantly correlated in the sediment phase. The results showed that ARGs can be targeted under corresponding antibiotic pressure and other types of environmental pressure. In the study system, the concentrations of antibiotics did not directly affect the transmission of ARGs. Overall, this study shows that artificial ecosystems constructed with emergent plants and Microcystis aeruginosa can be effective at purifying water and reducing the environmental risks of antibiotics in urban rivers.
Key words: emergent plant      antibiotics      antibiotic resistance genes      Microcystis aeruginosa      redundancy analysis      urban rivers     

抗生素是一类具有抗病原体且能影响其他细胞生长发育的天然、半合成或人工合成的化合物, 水环境中抗生素主要来源于医疗、畜禽和水产养殖用药[1, 2].虽然其残留含量不高且半衰期短, 但由于抗生素的滥用, 使得抗生素在水体中表现出“假持续”的现象, 在不同物种、介质和区域中传播和迁移[3], 诱导环境中耐药菌及抗性基因(ARGs)的出现, 对人体健康和整个水生生态系统构成长期的潜在威胁[4~6], 严重的有致癌、致畸和致突变作用, 干扰人体各系统生理功能[7]还可能引起水体里的微生物等慢性中毒[8].

目前, 在全球各地地表水和地下水中都有检测到不同含量的抗生素和ARGs[9].人工生态系统是一种由水生植物搭建的漂浮结构, 利用水生植物及微生物净化水体的一种无污染、投资少和见效快的原位生态修复技术[10~13].有研究表明藻类对抗生素的去除有一定的影响[12].因此, 水生植物和藻的组合对抗生素的去除需进一步探究, 本文以阿奇霉素(AZM)、磺胺甲唑(SMZ)、环丙沙星(CIP)、四环素(TCY)和磺胺类ARGs(sul1和sul2), 四环素类ARGs(tetX和tetM)、喹诺酮ARGs(qnrS和qnrD)、大环内酯类ARGs(ermB)以及16S rDNA为目标物, 研究2种挺水植物和铜绿微囊藻组合(菖蒲+灯芯草、藻+灯芯草、藻+菖蒲和藻+菖蒲+灯芯草)的人工生态系统中抗生素含量(水相、泥相、水生植物)和ARGs(水相、泥相)的变化特性, 以期为验证利用藻和水生植物组合的人工生态系统改善城市河流水质及降低抗生素和ARGs风险的可行性, 也为后续深入研究城市地表水中抗生素环境风险提供理论依据及技术支持.

1 材料与方法 1.1 试剂与材料

4种抗生素标准品、内标物磺胺甲唑-D4标准品, 均购自德国Dr.Ehrenstorfer, Augsburg, 纯度高于95.0%;所有目标抗生素1g·L-1和10mg·L-1的内标物的储备液均在甲醇中制备, 储存于棕色玻璃瓶中, 并在-20℃的黑暗环境中保存.甲醇、丙酮、甲酸、二氯甲烷以及乙腈为HPLC级, 酒石酸钾钠、过硫酸钾、抗坏血酸、钼酸铵、盐酸、氢氧化钠和硫酸均为分析纯; 以上试剂、0.45 μm玻璃纤维滤膜(GF/B)及0.45 μm和0.22 μm针式过滤滤头(聚醚砜材料)都购自国药集团.水生植物:灯芯草选取高80 cm健康挺拔的植株, 菖蒲选取高90 cm完整健康的植株.铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)(购于中科院武汉水生生物研究所).

固相萃取柱选用Poly-Sery HLB SPE Cartridge(ANPEL, 美国).超纯水由EPED的超纯水机制造.氮吹浓缩装置购自Tianjin Autoscience Instrument Co. Ltd.; 非接触式超声波细胞破碎仪(BILON-R1200)购自上海比朗仪器有限公司; 紫外可见分光光度计(723N)购自上海欣茂仪器有限公司; TN/TOC测定仪(multiN/C3100)购自德国耶拿; 哈希COD消解仪、测定仪(DRB200)购自中国珂淮仪器有限公司.抗生素检测采用超高效液相色谱-串联质谱联用仪(UHPLC-MS/MS, ThermoFish, 美国).

1.2 实验方法

采用自主设计的大型循环流动水槽, 模拟城市河流环境, 水槽内放置2个多功能人工生态系统, 固着挺水植物, 覆盖率为50%.实验中所用的河水与沉积物均取自上海市杨浦区的复兴岛河流.河水采集并运往实验室后静置1~2 d, 待沉积物完全沉淀后开始后续实验.同时, 从铜绿微囊藻培养液中分别移取100 mL藻液, 倒入2个藻类承载装置中.移取时注意做好消毒工作防止母液被污染.

本研究进行菖蒲+灯芯草、藻+灯芯草、藻+菖蒲和藻+菖蒲+灯芯草这4个实验组和空白组, 共计5组实验.每组实验开始, 将4种抗生素混合标准溶液均匀加入河流模拟装置中, 使得药物初始浓度为10 μg·L-1.装置内水温控制在(20±2)℃, 每天光照时间为08:00~18:00, 每隔12 h用手机远程控制或实验室手动控制移动生态浮岛一次, 使其到达未净化区域.实验周期为15 d, 在0、0.5、1、2、5、10和15 d的时间节点采集水相和泥相进行药物浓度的测定和常规水质指标的检测, 每次取100 mL.在第5、10、15 d时取植物相进行药物检测, 沉积物每次取10 mL, 植物每次在2个生态浮岛上各取1株, 在第0和第15 d采集水样和沉积相用于ARGs的检测.在每组实验结束后, 将模拟装置中之前的实验用水和底泥排放干净并清洗模拟装置, 然后再开始下一组的实验.通过检测分析目标抗生素在水相、泥相和植物中浓度变化, 物料衡算整个人工生态系统对抗生素实际去除率以及目标ARGs在水相和泥相中的分布情况, 从而得到2种挺水植物和1种藻混合组合的人工生态系统对城市河流中抗生素和ARGs降解特性.

1.3 样品的预处理及分析方法 1.3.1 水相抗生素样品的预处理

取100~200 mL的水样, 加入1 mL浓度为1g·L-1 Na2EDTA的样品, 经0.45 μm玻璃纤维滤膜(GF/B)过滤以去除样品中粒径较大的颗粒物.取过滤液100 mL, 用1 mol·L-1的NaOH调节pH至7.0, 使用固相萃取装置对目标物进行富集提取.固相萃取前, 用15 mL甲醇和15 mL超纯水淋洗固相萃取柱, 使其活化.萃取时流速为2~3mL·min-1.结束后用15 mL超纯水清洗固相萃取柱, 抽干30 min后用2 mL甲醇/二氯甲烷/丙酮(40:40:20)混合液洗脱3次, 收集洗脱液.将洗脱液放置氮吹仪下吹至干燥, 加入1 mL甲醇使目标物复溶, 再加10 μL内标物SMZ-D4, 最后将目标物经0.22 μm的针式滤头过滤后放入进样瓶用于UHPLC-MS/MS分析.

1.3.2 泥相及植物相抗生素样品的预处理

泥相样品取自装置底泥表层.植物相样品处理前用超纯水洗净, 用剪刀将茎叶和根部分离开, 泥相及植物相样品置于烘箱(60~70℃)内烘干, 烘干后样品研磨过100目筛网.称取20 mg泥相和植物相样品于小型离心管, 用2 mL甲醇平衡12 h, 平衡后进行超声溶剂萃取.离心管放入反应室超声1 h后加入超纯水定容至100 mL, 此后处理步骤与水相样品一致.

1.3.3 ARGs的预处理

水相:取200 mL水样经0.22 μm的针式滤头过滤, 将滤膜放入密封袋且置于低温中; 泥相:取10 mL沉积物于离心管, 置于-40℃冰箱内保存; 再送至上海启因生物科技有限公司进行ARGs的qPCR检测. qPCR反应条件为:95℃时30 s, 95℃时5 s, 60℃时30 s, 重复上述3步, 40个循环.在进行qPCR实验过程中, 要求标准曲线R2>0.980.将空白组、菖蒲+灯芯草、藻+灯芯草和藻+菖蒲和藻+菖蒲+灯芯草这5组实验分别记为A、B、C、D和E, 为了便于统计数据, 将5组实验的0 d数据取平均值, 作为5组实验组的对照组数据.为降低分析测定过程中所产生的误差风险, 进行ARGs数据分析之前, 将其转换成lg(含量).

1.3.4 藻液样品的预处理

铜绿微囊藻先在培养基中进行培养, 使藻液达到目标浓度(>8×107 cells·mL-1).藻种培养基采用BG11作为培养基, 每天摇动两次, 避免其沉淀、附壁生长.在每组实验节点, 通过血球计数板计算藻细胞个数.

1.3.5 样品的分析检测方法

水样中COD使用哈希COD消解仪、测定仪检测, 氨氮(NH4+-N)和总磷(TP)采用中国国家标准法进行检测, 总氮(TN)用TN/TOC测定仪来测定; 抗生素采用UHPLC-MS/MS来分析检测, 具体操作见参考文献[14]; ARGs的测量委托上海启因生物科技有限公司进行, 通过qPCR检测测定.

2 结果与讨论 2.1 水体中常规污染物的浓度变化

植物与藻组合的人工生态系统水体中常规污染物浓度变化如图 1所示, 实验组中ρ(TN)、ρ(TP)、ρ(COD)和ρ(NH4+-N)明显呈持续下降的趋势, 4种污染物15 d平均去除率为50.2%、68.1%、66.8%和69.6%, 空白组去除率仅有12.5%、24.2%、35.2%和23.4%, 实验组大大提升了对目标物的去除率, 实验组水生植物和藻的加入, 根系微生物不仅参与氨化、硝化、反硝化作用去除氮和COD, 还能富集水中的磷, 从而达到除磷的目的.植物根系泌氧量与常规污染物的去除效率密切相关, 泌氧量越高, 去除率越高, 有研究表明植物分泌物和根系微生物的相互作用对净化水质效果扮演着重要角色[15, 16], 同时藻以CO2或CO32+为碳源, 吸收水中的氮盐和磷盐, 转化藻细胞自身生长物质, 从而去除水中的氮磷等污染物[17], 所以实验组能大幅度降低污染物浓度. 4个实验组中对4种常规污染物平均去除率为藻+菖蒲+灯芯草(69.1%)>藻+菖蒲(63.9%)>菖蒲+灯芯草(60.9%)>藻+灯芯草(60.7%).藻+菖蒲+灯芯草组合效果最佳, 其中对NH4+-N去除率最高达到77.4%, 刘春常等[18]的研究也表明, 多层次和多植物配置的植物床对污水处理效果更好.

图 1 不同种植环境下4种常规污染物指标质量浓度变化 Fig. 1 Mass concentration changes of four conventional pollution indicators in different planting environments

2.2 抗生素在水相和泥相中的变化

表 1所示的是在不同种植环境下水相中抗生素在15 d的含量变化.空白组对4种抗生素有一定的去除率, 其中对AZM的去除率达到78.1%, 可能是抗生素自身能通过生物降解、光降解等作用降低抗生素含量; 另外作为大环内酯型抗生素, 其含有—OH和—COOH等亲水基, 在水中容易水解[19].实验组中对AZM、SMZ、CIP和TCY的去除率分别是85.8%~88.5%、68.9%~76.2%、73.5%~79.1%和68.7%~77.9%, 主要是通过植物根系吸附.吸收水体中抗生素, 并且根系分泌物也可以降解抗生素[20]经过15 d的降解, 藻+菖蒲+灯芯草组合水中AZM、SMZ、CIP和TCY去除率分别提升11.7%、19.3%、30.3%和39.1%.有研究表明人工湿地系统中, 有植物种植的人工湿地对抗生素的去除能力显著高于无植物种植的人工湿地[21].由于TCY和CIP属于光敏物质, 容易发生光降解反应, 且TCY吸附能力强, 容易吸附到水生植物根系或沉积相中, 这导致水中TCY和CIP的去除率高于AZM和SMZ. 4个实验组对4种抗生素的平均去除率顺序依次:藻+菖蒲+灯芯草(81.0%)>藻+菖蒲(76.8%)>藻+灯芯(76.0%)>菖蒲+灯芯草(75.2%).

表 1 抗生素在水相中的变化 Table 1 Changes in antibiotic concentrations in the aqueous phase

表 2所示的是抗生素在泥相中的含量变化.泥相中CIP和TCY的含量较高, 这跟CIP性质稳定, 不易发生水解反应有关[22]; 由于TCs抗生素的分子结构及其特殊理化性质, 泥相对四环素的吸附能力较强.有研究表明, 四环素与土壤中的金属离子易形成螯合物, 在水体沉积物中吸附累积, 因此这两种抗生素在泥相中含量一直较高[23].泥相中的SMZ和AZM含量较低, 这是因为SMZ和AZM有强烈的亲水性, 且在固态中的吸附性较弱.如表 2所示, 随着实验时间的推移, 在5 d或者10 d含量达到峰值, 之后含量随之降低, 这可能由于沉积相对水相中的抗生素的吸附作用达到饱和, 之后由于微生物降解抗生素[24], 因此抗生素含量先增高后又降低.空白组泥相对4种抗生素的平均去除率(39.3%)高于实验组(28.5%~31.7%), 可能由于无植物系统中抗生素吸收的光能更多, 提升降解速率, 表明光照对抗生素的去除有着重要的作用. 4个实验组对AZM、SMZ、CIP、TCY的平均去除率为25.1%、14.5%、35.8%和47.8%, TCY的平均去除效率最高, 这可能由于四环素类抗生素在泥相中暴露量大, 吸附能力强、迁移能力弱, 植物、微生物、光照等都会影响其在环境中的稳定性.藻+菖蒲+灯芯藻组合对TCY的去除率达到53.5%, 其次是藻+菖蒲组合(50.8%)和菖蒲+灯芯草组合(47.8%), 去除率最低是藻+灯芯藻组合(38.9%).

表 2 抗生素在泥相中的变化 Table 2 Changes in antibiotics in the sediment phase

2.3 挺水植物体内抗生素的变化情况

图 2所示两种植物的水下部分和水上部分对4种抗生素的富集情况, 可以看出, 植物水下和水上都对SMZ有着较好的富集效果, 这可能是因为SMZ亲水性不容易被泥相吸附, 更多的游离在水环境中[25]从而被植物富集. Boxall等[26]发现植物对磺胺类抗生素有良好的富集作用; 植物体内AZM含量最低, 由于其易于生物降解, 大部分在水相中发生水解, 导致植物体内含量相对较低, 这与水相中AZM含量变化规律一致.植物水下部分抗生素含量高出植物水上部分2倍多, 因为大部分抗生素无法从根部迁移到植物的上部分.有研究[27]指出, 植物主要通过根茎直接吸收抗生素, 其中根的吸附量最多, 植物根系能输送氧气, 促进有降解抗生素能力的微生物生长繁殖, 从而间接增强微生物对抗生素的降解.根部吸收后, 在植物蒸腾拉力的带动下再进入茎和叶, 最终在植物细胞酶或酶辅助因子的作用下被降解或破坏[28], 抗生素在植物体内得到一定的去除, 所以植物水上部分抗生素含量较低.藻+菖蒲和藻+灯芯草组合系统对SMZ(7.9%~8.6%)和CIP(2.6%)的去除效果较好; 菖蒲+灯芯草和藻+菖蒲+灯芯草组合系统对AZM(2.8%~2.9%)和TCY(4.2%~5.0%)的富集效果较好, 表明不同的植物对不同抗生素的富集能力是不一样的.

图 2 挺水植物体内水上部分和水下部分抗生素含量的变化 Fig. 2 Changes in antibiotic concentrations in the above-water and submerged parts of emergent plants

2.4 抗生素的实际去除率

通过物料衡算可得5组实验的人工生态系统对抗生素的实际去除率, 如图 3所示.实验组对4种抗生素的平均去除率为43.1%, 较空白组25.7%的去除率提升了40.4%, 表明植物和藻组合的人工生态系统能有效地促进抗生素的去除, 其中藻+菖蒲+灯芯草组合的人工生态系统对4种抗生素去除率高于其他3个实验组.整个实验组对AZM、SMZ的去除率高于58.0%, 表明大环内酯类.磺胺类抗生素易于水解或生物降解[21].实验组对CIP去除率较空白组提升67.0%, 由于喹诺酮类抗生素有两个六元环拼合的双环结构, 易光解但难水解[29]; 对TCY去除率相对较低, 藻与水生植物组合(藻+灯芯草:43.6%、藻+菖蒲:41.2%)比单一植物组合(菖蒲+灯芯草:38.2%)的平均去除率高, 表明铜绿微囊藻的加入与水生植物有着协同作用, 促进整个生态系统对抗生素的去除效率[30].由于此前开展的单独藻细胞对抗生素的去除实验中, 在藻细胞里未检测到抗生素, 故不考虑铜绿微囊藻在人工生态系统中对4种抗生素的去除过程中的直接贡献, 但藻类的加入明显提高对抗生素的去除效率, 可能由于藻细胞吸收了抗生素后很快被代谢或降解而转化为其他物质.

图 3 不同种植环境对4种抗生素的总去除率 Fig. 3 Total removal rates of four antibiotics in different planting environments

2.5 ARGs在水相和泥相的分布情况

5组实验下8种抗性基因在水相和泥相中的含量分布如图 4所示, 泥相中抗生素抗性基因的绝对丰度高于水相, 这可能与沉积相对携带ARGs的微生物有着一定的吸附作用, 从而导致抗性基因的丰度高于水相[31]; 水相和泥相中的16S rDNA的绝对丰度远高于其他ARGs, 因为环境中的16S rDNA表达相对稳定, 常用来表征环境中细菌的总数, 故其含量相对较高[30].其他7种ARGs中, 水相和泥相中sul1和sul2是优势基因.对比A(空白组), 经过4组不同种植环境的处理, sul1和sul2有着一定的去除效果, 15 d以后B组和E组对sul1和sul2去除效率相对高于C和D实验组; 其次是喹诺酮类qnrS, 绝对丰度仅次于sul2, B组含量相对C和D组较低, E组15 d未检测到该基因, 说明不同种植环境对ARGs的去除有着一定的差异. tetX、tetM以及qnrD在水相含量相对低一些, 在15 d的绝对丰度相比0 d均降低一个数量级, 其中E组中tetM去除效果最好, ermB在水相中丰度最低.

图 4 水相和泥相中抗性基因分布 Fig. 4 Distribution of antibiotic resistance genes in aqueous and sediment phases

泥相中sul1和sul2绝对丰度最高, 为优势基因, 且均高于水相中的含量, 其次是喹诺酮和四环素类ARGs, ermB丰度最低.相对于空白组, 实验组对3种较高含量的sul1、sul2和qnrS有较好的去除效果, D组对这3种ARGs的平均去除率最高, 为75.5%, E组66.0%, B组64.7%, C组去除率为负值; 4个实验组对tetX、tetM平均去除率为52.6%, 对ermB平均去除率为39.9%, qnrD仅在C组检测到, 泥相中qnrD含量较低.总体来看泥相中ARGs丰度相对水相增加2~4个数量级.

2.6 ARGs在泥相和水相中的去除效果

图 5所示的是对ARGs的去除效果, 泥相中不同种植环境中4类ARGs的去除率有一定的规律性, B、D和E组对ARGs的去除效率相对较高.由图 4可知, 泥相中sul1和sul2为优势基因, D组对其去除率最高, 均高于61.0%, B组E组对sul1和sul2的去除率均高于41.0%, C组对两者去除率不到21.0%, 甚至丰度增加, 其原因可能是沉积相中低含量的抗生素、重金属等对抗性菌产生了选择压力, 促进了抗性基因的传播[32]; 同时表明菖蒲存在的种植系统中, 更有利于抗性基因的去除, 藻的加入对去除效果起着促进作用.空白组对qnrD去除率达到了100%, 这可能是因为原河水中qnrD的含量较低, 通过自然界中光照、温度影响、含氧量与微生物菌群的不同等作用, 可以完全去除抗性基因.沉积相中tetX和tetM经过5种生态系统处理后, 均有一定的降解, D组处理后丰度降低了2个数量级. B组和E组的去除率超过45.0%, 有研究[33]表明ARG丰度与特定的微生物种群密切相关.泥相中ermB绝对丰度最低(1.53×103 copies·g-1), D组对其去除率最高, 表明有菖蒲的生态系统对ARGs的去除率最好. 5种生态环境泥相中ARGs去除率依次为D>E>B>A>C, 表明灯芯草易于将ARGs富集到沉积相, 而菖蒲和藻能促进沉积相对微生物的吸附作用[30], 进而加速ARGs的去除.四类ARGs的平均去除率依次为喹诺酮类ARGs(49.5%)>四环素类ARGs(48.9%)>磺胺类ARGs(45.7%)>大环内酯类ARGs(27.2%), 对大环内酯类ARGs因去除率较低, 有研究[33]表明温度可能是影响大环内酯类ARGs变化的重要因素.

图 5 水相和泥相对抗性基因的去除率 Fig. 5 Removal rates of antibiotic resistance genes in the aqueous and sediment phases

5种生态环境水相中4类ARGs的去除率规律性不明显, 但相对空白组, 4个实验组对ARGs去除率明显提升, sul1和sul2平均提升了69.3%, tetX和tetM 48.6%, qnrD和qnrS 17.4%, ermB 174.5%. ARGs的绝对丰度降了1~2个数量级, 说明有水生植物和藻混合的生态系统, 能够大幅度降低水中ARGs丰度, 因为植物根系表面生物膜吸附携带ARGs的细菌, 随着生物膜的脱落, 水中ARGs含量随之降低.有研究[34]表明, 植物的根系易形成生物膜, 从而形成好氧/缺氧的微环境, 厌氧环境有利于ARGs的去除.水相对ARGs的去除率远高于泥相, 表明水生植物和藻的加入, 是去除河流中ARGs的关键. B、C、D和E组对ARGs的平均去除率为71.5%、72.1%、57.8%和86.0%, E组去除率最高.菖蒲+灯芯草+藻组合形成更完整的生态系统, 有更高的物种丰富度, 这对ARGs的去除有一定的影响, 先前的研究[32]表明, ARGs在供体与受体细菌之间的结合效率也影响去除率.总体来说, 水相的ARGs去除率高于泥相, 这跟泥相中ARGs的含量高有关, 4个实验组对ARGs的平均去除率顺序依次是:E(43.3%)>C(36.1%)>B(36.0%)>D(29.3%).研究表明一些环境因素可能会影响ARGs的传播, 比如常规污染物的含量、抗生素含量和微生物菌群等[35].

2.7 ARGs与环境因子的相关性分析

图 6为水相中ARGs丰度与抗生素和常规污染物浓度的冗余分析(RDA), 水相RDA图中, 轴1解释率为0.994 1, 轴2解释率为0.005 7, 轴3解释率为0.000 3, 轴4解释率为0, 水相中常规污染物和抗生素及sul1、qnrD、tetM和ermB之间均为锐角, 表明常规污染物、抗生素和4种ARGs彼此之间存在显著正相关性.有研究表明微生物群落结构会影响ARGs的丰度, 氮磷等污染物是微生物生长繁殖必备的营养元素[36], 其含量的变化可能引起微生物群落的变化, 从而影响ARGs丰度的变化, 同时地表水的抗生素在ARGs的发生和扩散中起重要作用[37]. qnrS与常规污染物和抗生素的夹角为钝角, 说明qnrS与常规污染物和抗生素呈现负相关性; tetX与4种常规污染物和4种抗生素显著性不强, 夹角接近直角, 可能是由于多种抗生素在环境中的叠加影响, 使得这几种ARGs与抗生素之间相关性较弱, 不易受到抗生素浓度的影响, 并且在环境中的抗生素浓度较低, 比较容易被去除[38]. sul2与SMZ之间呈现显著正相关性, 符合ARGs在其对应抗生素的压力下进行选择的特征.图 6显示, 常规污染物在水相中能够影响ARGs的传播, ARGs不仅可以在其对应抗生素的压力下进行选择, 还可以在其他类型的环境压力下进行选择, 抗生素的浓度与相应的ARGs没有直接关系.

图 6 水相中ARGs丰度与抗生素和常规污染物的RDA分析 Fig. 6 RDA analysis of ARG abundance, antibiotics, and other pollution indicators in the aqueous phase

图 7是泥相中ARGs丰度和抗生素含量的RDA, 泥相RDA图中, 轴1解释率为0.860 8, 轴2解释率为0.139 2, 轴3解释率为0, 泥相中抗生素与ARGs之间呈现显著相关性, 除TCY以外, 其余抗生素与对应ARGs之间呈正相关性, TCY与对应tetM和tetX有着显著负相关性.阮晓慧等[39]的研究表明, TC并非是影响TC-ARGs基因丰度变化的决定性因素, 其中TC含量与tetC和tetM基因丰度显著负相关. 16S rDNA与7种ARGs之间均存在显著正相关性; AZM与对应ermB之间相关性不强, 甚至没有相关性, 与Li等[40]的研究结果一致, 这是由于它们在固相介质中的良好水溶性和低吸附系数所致[41].从图 7可以看出, 泥相中ARGs同样是不仅可以在其对应抗生素的压力下进行选择, 也可以在其他类型的环境压力下进行选择.

图 7 泥相中ARGs丰度与抗生素的RDA分析 Fig. 7 RDA analysis of ARGs abundance and antibiotics in the sediment phase

3 结论

(1) 挺水植物和藻组合的人工生态系统中, ρ(COD)、ρ(NH4+-N)、ρ(TN)以及ρ(TP)明显地下降, 藻+菖蒲+灯芯草组合的人工生态系统对常规污染物的去除效果较好.

(2) 挺水植物和藻组合的人工生态系统对水中抗生素有着较好的去除效果, 藻+菖蒲+灯芯草组合去除效率最好, 其中AZM的去除率最高; 对泥相中抗生素的去除效果无明显改善, 泥相中抗生素的去除效率依次TCY>CIP>AZM>SMZ.

(3) 不同植物对不同抗生素的富集效率不同, 磺胺类抗生素易于富集在植物体内, 植物的水下部分比水上部分对抗生素的富集效果好.

(4) 植物和藻组合的人工生态系统能较好地提升抗生素实际去除率, 依次为藻+菖蒲+灯芯草>藻+灯芯草>藻+菖蒲>菖蒲+灯芯草>空白.

(5) 水相和泥相中磺胺类ARGs为优势基因, 植物和藻组合的人工生态系统对磺胺类、四环素类以及喹诺酮类ARGs去除效果较好, 对大环内酯类去除率较低, 其中水相中藻+菖蒲+灯芯草组合效果最佳, 泥相中藻+菖蒲组合效果最佳.

(6) 水相中常规污染物和抗生素与ARGs存在显著相关性, 但tetX与抗生素和常规污染物相关性不强; 泥相中除AZM与对应ARGs无相关性以外, 其余抗生素与对应ARGs都存在显著相关性, 总的来说, ARGs既可以在对应抗生素的压力下进行选择, 还可以在其他类型的环境压力下进行选择, 并且抗生素的含量不能直接影响ARGs的传播.

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