2021, Vol. 42
2. 青岛大学环境科学与工程学院, 青岛 266071;
3. 中国地质大学(北京)水资源与环境学院, 北京 100083;
4. 上海师范大学环境与地理科学学院, 上海 200234
2. College of Environmental Science and Engineering, Qingdao University, Qingdao 266071, China;
3. School of Water Resource and Environment, China University of Geoscience, Beijing 100083, China;
4. School of Environmental and Geographical Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China
一百年来, 抗生素在治疗人类和动物的疾病方面发挥了重要作用, 但同时存在过度使用的问题.据统计, 2013年中国抗生素年使用量达到16.2万t, 约占世界用量的1/2, 同年约有超过5万t抗生素被排放进入环境[1].排入环境的抗生素成为特殊的环境选择压力, 使携带抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的微生物因对相应抗生素产生耐药性而更容易存活[2], 同时ARGs随微生物繁殖在环境中复制和传播[3], 对人类健康和生态安全构成严重威胁.因此, 抗生素和ARGs已经成为公认的新兴环境污染物[4], 受到广泛关注.
污水处理厂收集人类生产生活产生的污水, 汇集了大量抗生素和ARGs[5]; 同时, 污水生物处理过程中微生物的生长繁殖为ARGs传播提供了便利条件; 抗生素的生物化学特性导致其难以被生物降解, 使污水处理厂成为环境中抗生素和ARGs的主要人为污染源[6, 7].因此, 污水处理对抗生素和ARGs的作用成为研究热点之一[8~10].目前, 单独针对抗生素或ARGs在污水处理厂中分布和迁移变化的研究较多[11~14], 同时研究其中抗生素和ARGs的特征并阐述相应规律的研究相对较少.本文以某市主要污水处理厂为研究对象, 分析抗生素和ARGs在污水厂进出水的分布和特征, 并阐述二者相关关系, 以期为深入研究污水厂中抗生素和ARGs的相互影响奠定基础.
1 材料与方法 1.1 研究区域及污水处理厂概况某市位于我国东部沿海, 经济发达, 该市工业以水产品加工业为主.该市有10座主要的污水处理厂, 均属于较小型污水处理厂, 总设计处理能力为17.08万m3·d-1.本研究针对污水处理量5 000 m3·d-1以上的6座污水处理厂进出水水质进行了采样分析, 具体信息如表 1所示.
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表 1 污水处理厂概况 Table 1 Information of WWTPs |
1.2 采样和检测方法 1.2.1 采样方法
在污水厂进水端和出水口处采集样品, 样品采集于2018年11月.每个点位采集样品8 L, 收集于玻璃瓶中, 玻璃瓶预先分别用硝酸和纯水清洗.待采样时, 再用样品润洗1~2次.
1.2.2 常规水质指标常规水质指标检测方法参考文献[15]中相关方法进行.
1.2.3 抗生素浓度检测方法本研究检测的目标抗生素如表 2所示.
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表 2 目标抗生素 Table 2 Target antibiotics in this study |
(1) 预处理 水样用玻璃纤维滤膜过滤(GF/F 0.7 μm, Whatman, UK), 调节pH为3~4;加入100 μL预先配制的内标溶液和0.5 g的Na2EDTA; 用Oasis HLB固相萃取小柱(Waters, 6 mL, 500 mg)进行萃取(水样上样速度15 mL·min-1, 10 mL超纯水淋洗, 抽干0.5 h, 10 mL甲醇洗脱).
(2) 抗生素分析方法 采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪(UPLC-MS/MS, ACQUITY UPLC H-Class Xevo TQ-S Micro)进行分析.分析方法为本课题组开发的抗生素分析方法[16]：色谱柱为BEH C18 column(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm, Waters, USA), 流动相为含0.1%甲酸的高纯水和100%甲醇.质谱釆用电喷雾离子化源, 正离子电离模式(ESI+), 多重反应检测方式(MRM), 气体温度:500℃; 流速:1 000 L·h-1; 雾化器压力：276 kPa(40 psi); 毛细管电压：1 kV.
1.2.4 ARGs检测方法(1) DNA提取DNA样品 参考课题组前期工作方法进行[17]:水样用0.22 μm混合纤维素酯滤膜(Millipore, German)滤后使用PowerSoil DNA Isolation Kit(MoBio, US)提取DNA, 使用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳(DYCP-31DN, 北京六一)和NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo Fisher, US)对所提DNA纯度和浓度进行检测.
(2) PCR检测 本研究共选择了7大类10种ARGs(表 3)进行定量分析.分析过程所用特异性引物由上海生工生物工程有限公司(Sangon Biothech, 上海)合成, 普通PCR采用25 μL体系[18].PCR产物置于4℃保存, 并使用质量浓度为1%~2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测.
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表 3 本研究中选择的目标抗性基因和整合子 Table 3 Target ARGs and integron of this study |
(3) 定量PCR(qPCR)检测 采用SYBR Green Ⅰ方法, 使用实时荧光定量PCR仪(BioRad CFX96 Touch, US)对各目标基因进行定量, qPCR采用20 μL体系[14], 反应程序如表 4所示.测定时, 将标准质粒以10倍梯度稀释, 根据质粒浓度计算得到标准质粒的拷贝数, 与通过实时荧光定量PCR测定得到的Ct值绘制标准曲线, 标准质粒的构建方法参照文献[19]的方法.各目标基因标准曲线的线性相关系数范围为0.990~0.996.每个样品设置3个平行样.
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表 4 实时荧光定量PCR反应引物序列及程序 Table 4 Primer sequences and reaction procedures of Real-time qPCR |
2 结果与讨论 2.1 污水厂进水水质特征
该市污水厂进出水常规水质如表 5所示.如前所述, 该市工业以水产品加工业为主, 此类工业废水通常含有高浓度COD, 因此A、B、C和E这4座主要处理工业废水的污水厂进水中COD、NH4+-N、TN和TP浓度普遍高于其他两座主要处理生活污水的污水厂.经污水厂处理后, 各污水厂出水水质均能达到相应排放标准, 本研究对上述污水厂全年自测数据的分析得出了相同的结论, 表明各污水厂的处理工艺能够对其进水中常规污染物实现良好去除.
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表 5 各污水厂进出水水质 Table 5 Wastewater quality of WWTP influents and effluents |
2.2 污水厂进出水中抗生素分布特征
本研究对污水厂进出水中抗生素浓度的检测结果如图 1所示.可以看到, 6座污水处理厂中, 共检测出7类73种抗生素, 包括磺胺类(21种)、四环素类(8种)、喹诺酮类(21种)、林可霉素类(2种)、大环内酯类(8种)、利福平类(1种)和β-内酰胺类(12种).
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图 1 各污水厂进出水中抗生素浓度 Fig. 1 Antibiotic concentrations of WWTP influents and effluents |
不同的污水处理厂进水中抗生素总浓度差异较大. 6座污水厂进水的总抗生素浓度为490.2~2 288.6 ng·L-1, 出水中抗生素总浓度为260.2~1 464.3 ng·L-1.处理生活污水为主的F污水厂进水中抗生素浓度最高, 达到2 288.6 ng·L-1, 而同样主要处理生活污水的D污水厂进水中抗生素浓度(490.2 ng·L-1)却远低于F污水厂.进一步调研得知, D污水厂服务区域内污水管道破损严重, 污水渗漏或地下水、河水渗入管道是污水输送的常态, 这可能是导致其进水中抗生素浓度低的主要原因.本研究的检测结果与前人结果相近, 高俊红[20]检测发现兰州市污水处理厂进水中抗生素浓度在nd~5 525 ng·L-1之间, 徐维海[21]检测了香港和广州的4座污水厂进水中抗生素的浓度, 发现其浓度范围为16~1 987 ng·L-1.
不同污水厂对抗生素的去除效果与处理工艺、运行参数、进水性质及抗生素种类密切相关.E污水厂出水中抗生素浓度最高, 达到1 464.3 ng·L-1; F污水厂出水中抗生素浓度最低(71.4 ng·L-1).同样采用A2/O工艺, 在柴玉峰等[22]的研究中发现其对抗生素的去除率为62.8%, 在本研究中C污水厂对抗生素的去除率则为45.2%. 6座污水厂对喹诺酮类和磺胺类抗生素的去除率普遍较高, 平均去除率达到72.3%.喹诺酮类抗生素在生活污水中较为常见, 但其在污水中的持久性较弱, 较易被分解[23].值得注意的是, D和E污水厂对抗生素的去除率分别为-16.6%和-48.4%, 即出水抗生素浓度高于进水中抗生素浓度.G bel等[24]和Miao等[25]在研究中也观察到类似现象, 即活性污泥工艺处理后出水中磺胺甲唑浓度反而比进水浓度升高一倍, 吸附在悬浮物或污泥中的抗生素释放到水体中, 以及在污水处理过程中抗生素的共轭代谢物发生聚合或生物转化等可能是造成此类现象的原因.
从抗生素的组成上看, 各污水厂进水中抗生素均以磺胺类和喹诺酮类为主.F污水厂进水中抗生素总浓度最高, 其中磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪是主要的抗生素, 贡献了总抗生素浓度的45.1%.其余污水厂进水中氧氟沙星检出频率最高, 其次为麻保沙星、罗红霉素等.在进水组成以工业废水为主的A、B、C和E这4个污水厂的进水中均检测出一定浓度的麻保沙星, 这一抗生素在D和F污水厂中检出浓度极低(仅为1.1 ng·L-1和8.2 ng·L-1).麻保沙星是动物专用的抗生素药物[26], 因此废水中的麻保沙星可能来自水产品养殖过程中所用抗生素的残留.类似地, 各污水厂出水中抗生素组成也各不相同, 主要以喹诺酮类和大环内酯类为主, 这一结果和Leung等[27]的研究结果相符, 其对中国香港7座污水厂中抗生素的检测结果表明, 喹诺酮类抗生素是出水中主要的抗生素类型.
2.3 污水厂进出水中ARGs分布特征各污水厂进出水中ARGs检测结果如图 2所示, 可以看到, 本研究选择的10种ARGs在6座污水处理厂进水中均有检出, 但从废水类型上看, 工业废水(A、B、C和E的进水)和生活污水(D和F的进水)中ARGs的总丰度并无显著区别.
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图 2 污水厂进出水中ARGs的丰度 Fig. 2 Abundance of ARGs in WWTP influents and effluents |
不同ARGs的丰度在各污水厂进水中有显著不同, 但sulⅠ检出频率和丰度最高, 绝对丰度达到2.4×105~5.4×106 copies·mL-1, 其次为tetC和sulⅡ, dfrA13的绝对丰度最低, 介于13.3~5 914.9 copies·mL-1(B污水厂绝对丰度最低的ARGs为blaPSE-1).研究表明磺胺类ARGs多存在于革兰阴性菌中, 在人类病原体如鼠伤寒沙门氏菌, 大肠杆菌, 肺炎链球菌中均有检出, 而且sulⅠ易与Ⅰ类整合子结合而传播[28], 导致其检出率和丰度普遍高于其他ARGs.张明美[29]对浙江某城市4座污水厂进水中ARGs的检测结果表明, sulⅠ基因检出丰度在106~107 copies·mL-1, 与本研究污水厂中检出水平相近.此外, 本课题组前期对浙江某污水厂进水中ARGs绝对丰度分布的研究结果表明, 甲氧苄啶类ARGs、氯霉素类ARGs、四环素类ARGs和磺胺类ARGs绝对丰度数量级分别为105~106、104~105、104~106和106~107 copies·mL-1, 四环素类ARGs、磺胺类ARGs、氯霉素类ARGs的绝对丰度与该市污水厂进水相近, 而甲氧苄啶类ARGs绝对丰度高于本研究中污水厂进水中的丰度[30].
主要处理工业废水的A污水厂出水中ARGs绝对丰度最高, 达到8.9×105~7.5×105 copies·mL-1; F污水厂出水中ARGs丰度最低(5.0×103~5.3×103 copies·mL-1); 6座污水厂出水中ARGs绝对丰度高低分别为:磺胺类(sulⅠ>sulⅡ)、四环素类(tetC>tetA)、氯霉素类、大环内酯类、甲氧苄啶类(dfrA1>dfrA13).磺胺类ARGs普遍存在于多种介质中, 其在居民生活、农业生产、医疗卫生废水以及畜禽类动物粪便中均有较高地检出丰度[31], 本研究这一结果也和姚鹏城等[32]对浙江省某污水厂的检测结果相近.
相比于其他ARGs, dfrA1和dfrA13更容易被污水处理工艺去除.从去除率上看, F污水厂对ARGs的去除效果优于其他污水厂, 对ARGs的去除效果达到2.0~3.0个数量级, 其中对tetC的去除效果最佳; C污水厂对ARGs的显著效果低于其他5个污水处理厂.但值得注意的是, 相比于进水, C污水厂出水中16S rDNA丰度有显著下降(图 3), 却对ARGs的去除效果不明显, 即微生物被去除的同时, ARGs并没有被去除.污水处理系统中微生物量丰富使基因的传播扩散更加活跃, 同时导致部分ARGs不再依附于微生物, 而在胞外游离存在[18], 使ARGs的去除与微生物量的去除“脱钩”.
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图 3 各污水厂进出水中16S rDNA的丰度 Fig. 3 Abundance of 16S rDNA in WWTP influents and effluents |
对该市污水厂进出水中ARGs丰度和本课题组对省内其他地市污水厂检测结果进行比较(图 4), 可以发现该市污水厂进出水中ARGs丰度总体低于其他地市ARGs的丰度水平.
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图 4 本研究6座污水厂中ARGs丰度和本省其他污水厂比较 Fig. 4 Comparison of ARGs abundance in these six WWTPs and other WWTPs of this province |
污水厂进出水中抗生素和ARGs的相关性如图 5所示.可以看到, 大环内酯类抗生素、林可霉素类抗生素和所有类型ARGs均呈正相关, 林可霉素类抗生素与除氯霉素类ARGs外的其他ARGs的相关性均强于大环内酯类.此外, β-内酰胺类抗生素、喹诺酮类抗生素和所有ARGs均呈显著且强的负相关.应该注意的是, 某特定类型抗生素与抗性基因并未呈现明显的规律性关系, 比如在图 5中磺胺类抗生素与磺胺类ARGs呈弱负相关, 而大环内酯类抗生素与大环内酯类ARGs呈弱正相关.这可能和不同环境条件对携带抗性基因微生物生长的胁迫有关.在出水中, 抗生素和ARGs得到了不同程度的去除, 二者之间的相关关系也发生变化, 总体上出水中抗生素和ARGs的相关性变弱, 可以推测, 在污水的生物处理过程中, 随着抗生素的转化和消除, ARGs的传播逐渐脱离了抗生素的影响, 随着微生物的生长繁殖而传播对ARGs传播的影响更大.
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图 5 污水厂进水和出水中抗生素和ARGs的相关性 Fig. 5 Correlation of ARGs and antibiotics in WWTP influents and effluents |
(1) 抗生素普遍存在于某市污水厂进出水中, 氧氟沙星、麻保沙星和罗红霉素的检出频率最高.
(2) 污水厂对抗生素去除效果差异较大, 出水中抗生素以喹诺酮类和大环内酯类为主.
(3) 污水厂进水中sulⅠ基因的检出频率和丰度最高, 绝对丰度为2.4×105~5.4×106 copies·mL-1, 污水处理工艺对dfrA1基因和dfrA13基因的去除效果优于其他基因.
(4) 工业废水和生活污水中ARGs的总丰度无显著区别.
(5) 与进水相比, 出水中ARGs丰度和抗生素浓度的相关性显著变弱.
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