2021, Vol. 42
2. 中国科学院城市环境研究所, 厦门 361021;
3. 重庆大学城市建设与环境工程学院, 重庆 400044
2. Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen 361021, China;
3. College of Urban Construction and Environmental Engineering, Chongqing University, Chongqing 400044, China
作为一种以厌氧氨氧化(ANAMMOX)作用为基础的单级自养脱氮技术, 亚硝化的全程自养脱氮(complete autotrophic nitrogen removal over nitrite, CANON)工艺在污水生物脱氮过程中具有许多优点[1~3].随着人工湿地(CW)技术越来越广泛地应用于低碳氮比废水的处理, 强化CW中的CANON作用已成为当前CW强化脱氮研究的热点[4, 5].在前期研究中, 本课题组便以填料层中溶解氧(DO)浓度及分布较易调控的潮汐流人工湿地(tidal flow constructed wetland, TFCW)为试验装置, 通过设置适宜的排水速率(vd)成功实现了CANON型TFCW系统的启动.然而, 笔者在研究中发现, 作为一种污染水体生态修复技术[6], 由于TFCW通常在常温和低NH4+-N浓度下运行, 导致其中CANON反应体系的构建进程较长, 且该作用的强度较低.
对于TFCW工艺而言, 不同种类的填料可造成系统脱氮性能的显著差异[7].究其原因, 一方面源于填料对氨氮吸附容量的不同, 可影响TFCW在闲置期内的NH4+-N氧化效果; 另一方面则归因于填料不同的表观形貌及其理化特性, 对系统中脱氮功能微生物的丰度与活性有着不同程度的影响[8, 9].由此推断, 适宜种类填料的选用应可促进CANON型TFCW系统的启动进程, 并有助于其脱氮性能的提高.
目前, 关于TFCW中填料的研究多侧重于提高系统的除磷能力[10~12], 而通过填充不同种类填料进而调控其中CANON作用与强化的相关研究鲜见报道.为此, 本文基于前期基础, 开展了不同种类填料对CANON型TFCW启动进程的影响研究, 探究了不同填料时TFCW脱氮性能及其微生物特性的变化, 对系统宏观工艺运行性能和微观生物学特征之间的关系进行了初步解析, 以期促进CANON型CW系统的工程化应用进程, 并为新型CW工艺的研发与设计提供参考.
1 材料与方法 1.1 试验装置TFCW位于温室内, 由PVC材料制成, 其表面积约为314 cm2(φ≈20 cm).装置顶部设置有进水管, 出水管设置于距装置底部约5 cm处, 装置侧壁按不同高度设置有4个取样管, 以便于填料样品的采集.TFCW填料层孔隙率为40.37%(系统有效容积约10.14 L), 厚度为80 cm; 下层(70~80 cm)为砾石支撑层(粒径为10~15 mm); 上层(0~70 cm)则为待试填料层(填充粒径：2~5 mm).本研究设置了5种待试填料, 分别为公分石、陶粒、沸石、废砖块和龙虾壳.其中, 公分石、陶粒和沸石是3种较为常见的湿地填料; 作为建筑垃圾, 废砖块因其较佳的理化特性(尤其是除磷性能)也日渐被认为是一种理想的湿地填料; 作为水产养殖的副产物, 龙虾壳中碳酸钙含量高, 对水体中污染物的吸附能力较强, 亦被视为一种较有潜力的湿地填料[12].将上述5种填料分别填充入TFCW, 按照填料种类的不同将5组TFCW分别定义为T-A(填充公分石)、T-B(填充陶粒)、T-C(填充沸石)、T-D(填充废砖块)和T-E(填充龙虾壳).湿地植物为石菖蒲, 种植密度约96株·m-2.各TFCW开始运行之前, 均以污水处理厂的二沉池污泥作为接种污泥, 对填料进行3个月的挂膜.接着, 各系统进入后续试验阶段.
1.2 运行方式TFCW按照潮汐流运行方式连续运行, 每天运行3个周期, 每个周期8 h：周期之初将10.00 L进水由进水管泵入系统中(t=10 min); 接着填料层处于淹水状态并反应6.00 h; 反应结束后, 通过出水管将系统排空(为利于TFCW中CANON作用的发生与强化, 将系统排水速率设置为0.50 L·min-1[13], 即排水期时长为20 min); 而后系统进入闲置期(t=90 min), 即一个周期共包括进水期、淹水期、排水期和闲置期4个阶段.该过程中TFCW的水力负荷(HLR)为0.96 m3·(m2·d)-1.
1.3 进水水量与水质试验用水为某小区内生活污水, 原水经沉淀后取其上清液作为系统进水.其中, 进水中COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN和TP的浓度分别为(284.40±37.72)、(35.54±3.41)、(2.77±0.50)、(1.72±0.18)、(43.00±2.62)和(5.64±1.39)mg·L-1, pH值则为(7.74±0.58).
1.4 分析方法 1.4.1 填料理化特性分析填料的孔隙率、真密度和堆积密度均按照文献[14]的方法进行测定; 填料的比表面积、微孔体积和微孔平均孔径采用比表面积分析仪进行测定; 填料pH值采用电位法进行测定(以CaCl2溶液为浸提剂, 浸提剂与填料的比例为2.5:1);填料水溶性盐总量(EC)采用电导率仪进行测定(以纯水为浸提剂, 浸提剂与填料的比例为5:1);填料的表面微结构采用场发射扫描电镜(SEM)进行观察, 表面化学元素则采用SEM-EDX技术进行测定.
1.4.2 水样采集及分析方法定期且定时采集各TFCW进出水水样进行分析, 水样中NH4+-N、NO2--N、NO3--N和TN的含量均参照文献[15]的方法进行测定.
1.4.3 填料样品的采集待各TFCW运行稳定后, 从每个系统的各个取样管中采集填料样品, 将其混匀后进行后续相关分析.
1.4.4 亚硝酸化活性、硝酸化活性、反硝化活性、短程反硝化活性及厌氧氨氧化比活性(SAA)的测定各TFCW中填料样品的亚硝酸化活性、硝酸化活性、反硝化活性、短程反硝化活性及SAA分别参照文献[16, 17]中所述方法进行测定.在相应的试验条件下, 亚硝酸化活性和硝酸化活性均计为单位时间内单位质量填料样品中生物膜的耗氧量; 反硝化活性和短程反硝化活性分别计为单位时间内单位质量填料样品中生物膜还原NO3--N和NO2--N的量; SAA则计为单位时间内单位质量填料样品中生物膜对氮素的脱除量.
1.4.5 荧光原位杂交(FISH)分析采用FISH技术对各系统填料样品中AOB和ANAMMOX菌的相对数量及分布进行分析, 试验中所用到的寡核苷酸探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成.从各系统填料层中分别取样后, 首先对样品进行预处理[18]; 接着对预处理后的样品进行杂交[19], 所用探针和杂交条件则如表 1所示; 杂交后样品用激光共聚焦显微镜LSM 510META(Zeiss, Germany)观察, FISH图片则用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics, America)软件进行统计分析.
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表 1 FISH分析中所用探针及杂交条件 Table 1 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes during the analysis of FISH |
1.4.6 脱氮功能基因定量分析
使用土壤DNA试剂盒(D5625-01Omega USA)对填料样品中的DNA进行提取纯化, 提取后的DNA产物经紫外分光光度计测定核酸浓度和纯度, 置于冰箱中-20℃保存.基于提取的DNA样品, 对其中的bacterial 16S rRNA及参与生物脱氮过程的关键功能基因(即：amoA、hzsA、nxrA、narG、napA、nirS、nirK、qnorB和nosZ)进行荧光定量PCR测定.分析所用仪器为Applied Biosystems StepOneTM, 试验采用SYBR Green I荧光染料法进行测试, 每种功能基因的扩增体系、引物种类及反应条件均参照文献[20].
2 结果与讨论 2.1 TFCW脱氮性能试验阶段各TFCW脱氮性能的变化如图 1所示.从中可知, 由于5种填料均具有一定的NH4+-N吸附能力[21], 试验伊始T-A、T-B、T-C、T-D和T-E对进水中TN和NH4+-N的去除率分别为:(48.05±8.13)%和(44.31±7.72)%、(46.11±9.24)%和(47.63±7.92)%、(87.62±6.85)%和(88.25±4.77)%、(72.86±2.11)%和(77.87±3.03)%、(78.44±2.83)%和(80.89±5.40)%.然而, 随着各填料NH4+-N吸附容量的日趋饱和, 上述5组系统出水中的TN浓度逐渐增至与进水中的TN浓度相当.随后, 伴随着运行时间的进一步延长, 各系统的脱氮性能复又出现了不同程度地提高并最终趋于稳定.结合图 1和表 2可知, 当待试填料分别为公分石、陶粒、沸石、废砖块和龙虾壳时, 5组TFCW在分别经历了771、510、390、345和300个CD后相继进入稳定运行阶段, 其出水中TN和NH4+-N的浓度(mg·L-1)分别为:(8.24±0.12)和(7.42±0.16)、(8.64±0.13)和(6.46±0.15)、(7.59±0.71)和(5.52±0.42)、(6.93±0.59)和(4.26±0.35)、(5.29±0.66)和(3.24±0.19).各系统对TN和NH4+-N的去除率分别稳定在:(80.65±0.42)%和(80.34±0.46)%、(81.71±0.61)%和(83.72±0.33)%、(82.89±0.98)%和(85.37±0.13)%、(84.66±0.75)%和(88.39±1.04)%、(88.37±1.19)%和(91.03±0.66)%.有研究表明, 作为一种间歇式进水的新型人工湿地系统, TFCW虽具有良好的硝化性能, 但其反硝化能力通常较差, 导致其出水中NOx--N浓度过高, TN去除率偏低[22, 23].然而, 上述试验结果却显示, 当vd设置为0.50 L·min-1时, 各TFCW稳定运行后均具有良好的脱氮性能, 对TN去除率均大于80%.结合先前的研究可知[13], 适宜的vd应可使TFCW填料层中形成了较佳的限氧微环境, 进而促进了系统中CANON作用的发生与强化.值得注意的是, 各TFCW的启动时间存在显著差异, 达到稳态后5组系统脱氮性能各不相同.相比较而言, T-E仅需300个CD的运行便可成功启动, 且该系统趋于稳定后脱氮性能最佳, 其出水中TN、NH4+-N、NO3--N和NO2--N的浓度分别为:(5.29±0.66)、(3.24±0.19)、(0.22±0.07)和(1.83±0.66)mg·L-1, 而T-D、T-C、T-B和T-A的启动时间及其启动后的脱氮性能却分别出现了不同程度的延迟和降低.结果表明, 填料种类会影响CANON作用在TFCW中的启动进程及强度, 进而会造成各系统脱氮效果的差异.
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图 1 各组TFCW的脱氮性能变化 Fig. 1 Nitrogen removal performance of each TFCW during the test |
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表 2 稳定运行期间各TFCW的脱氮性能 Table 2 Nitrogen removal performance of each TFCW at the steady state |
2.2 功能微生物活性与丰度
图 2所示为各TFCW在稳定运行阶段的亚硝酸化活性、硝酸化活性、短程反硝化活性、反硝化活性和SAA.从中可知, 5组TFCW在稳定运行阶段的亚硝酸化活性、硝酸化活性、短程反硝化活性和反硝化活性均无显著差异, 分别稳定在:(7.79±0.87)、(0.46±0.04)、(0.28±0.01)和(0.31±0.07)mg·(g·h)-1.与文献[24]对比可知, 处于稳定运行阶段的各系统具有较为理想的亚硝化性能, 但其NO2--N氧化能力和反硝化性能效果均不理想.究其原因, 一方面由于填料层中限氧环境对亚硝酸盐氧化菌(NOB)丰度与活性的抑制以及进水中有机碳源的相对不足; 另一方面稳定运行阶段5组TFCW均具有较高的SAA[25], 但各系统的SAA值存在较明显的差异(图 2), 即：T-A、T-B、T-C、T-D和T-E的SAA值分别为:(4.92±1.09)、(5.14±0.83)、(5.21±0.94)、(5.46±1.31)和(5.73±1.26)mg·(g·h)-1.同时, 由图 3可知：TFCW的TN和NH4+-N去除效果均与其SAA值呈显著线性相关关系.由图 2和图 3结果可知, CANON作用对各系统中氮的脱除起着重要作用, 而ANAMMOX菌活性的高低可显著影响该作用.
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图 2 稳定运行期间各TFCW的亚硝酸化活性、硝酸化活性、短程反硝化活性、反硝化活性和SAA Fig. 2 Potential nitritation activities, potential nitrification activities, potential brief-denitrification activities, potential denitrification activities, and SAA of each TFCW at the steady state |
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图 3 稳定运行阶段各系统的SAA与其脱氮性能的关系 Fig. 3 Relationship between SAA and the nitrogen removal performance of each TFCW at the steady state |
待各TFCW稳定运行后对其进行生物膜样品的采集, 固定后用相应的特异性荧光探针(NSO190、PLA46和AMX820)进行杂交, 以便考察各系统填料层中AOB和ANAMMOX菌的富集情况.由图 4可知, 5组系统生物膜样品中AOB(绿色)的丰度均较高, 但其中ANAMMOX菌(红色)的丰度水平却存在较大差异.相比较于T-C、T-D和T-E 3组系统, T-A和T-B生物膜样品中ANAMMOX菌的丰度均相对偏低.该结果表明, 填料种类的不同会影响TFCW中ANAMMOX菌的富集, 并会造成其丰度水平的差异.结合图 2可知, ANAMMOX菌的丰度水平是造成各系统SAA值出现显著差异的主要原因之一.另外, 图 4结果也表明, 在T-A和T-B两组系统中, AOB和ANAMMOX菌之间并无明显的空间分布差异, 二者混在一起生长, 此生长特征与Pynaert等[26]的研究结论相一致.在T-C、T-D和T-E 3组系统中, AOB和ANAMMOX菌分别位于生物膜的外层和内层, 该发现则与Nielsen等[27]的报道相符, 且该分布特征有助于确保系统获得更为理想的脱氮效果.
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绿色荧光信号代表AOB; 红色信号代表ANAMMOX菌 图 4 稳定运行阶段各TFCW中生物膜样品的FISH图 Fig. 4 FISH images of biofilm samples in each TFCW at the steady state |
基于各系统的脱氮性能(图 1), 并结合图 2~4的试验结果可知, 当TFCW在适宜的vd条件下连续运行时, 填料层中形成的限氧环境使系统具备了稳定且高效的短程硝化性能, ANAMMOX菌随之在系统中得以富集, 活性也不断得到提高, 从而确保了CANON作用在系统中的发生与强化, 并最终使该作用成为了各TFCW在稳定运行阶段脱氮的主要途径; 另一方面, 不同种类的填料可导致各TFCW中ANAMMOX菌丰度与活性的具有显著差异, 由于ANAMMOX菌丰度与活性的高低是影响CANON作用强弱的关键因素, 各系统的脱氮性能最终出现了显著区别.
2.3 脱氮功能基因丰度图 5表明, 当T-A、T-B、T-C、T-D和T-E相继进入稳定运行阶段后, 其填料层中的bacteria 16S rRNA基因拷贝数分别维持在:(7.15×108±3.06×107)、(9.26×108±2.88×107)、(1.24×109±3.96×108)、(1.29×109±3.33×107)和(1.28×109±2.95×108)copies·g-1.通常认为, 微生物作用是人工湿地中氮素脱除的主要途径, 稳定且充足的微生物量可为其脱氮性能的强化提供保障[6].而由上述结果可知, 不同种类的填料会影响各TFCW中微生物量的高低, 由此会对系统的脱氮性能及其中CANON作用的强度造成不同程度的影响.
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图 5 稳定运行期间各TFCW中脱氮功能基因丰度 Fig. 5 Absolute abundance of nitrogen transformation functional genes in each TFCW at the steady state |
amoA与nxrA分别是参与硝化过程中NH4+-N和NO2--N氧化的2种关键基因, hzsA是参与ANAMMOX过程中NH4+-N和NO2--N转化的关键基因, 而narG、napA、nirK、nirS、qnorB和nosZ则分别是参与生物反硝化过程(即：NO3--NNO2--NNON2ON2)的6种关键基因[28].其中, narG和napA是参与反硝化过程第1步还原反应的2种关键基因; nirS和nirK是参与该过程第2步还原反应的2种关键基因; qnorB和nosZ则分别被认为是参与反硝化过程第3步和第4步还原反应的关键基因.由图 5可知, 对于成功启动后的各TFCW而言, 其填料层中amoA和nxrA的丰度分别稳定在(6.36×105±1.12×104)copies·g-1和(3.95×103±5.43×102)copies·g-1, 即各系统中nxrA的丰度水平均远低于amoA.同时, 5组系统中hzsA的丰度分别可达:(1.23×105±2.07×104)、(1.54×105±3.31×104)、(2.18×105±5.23×104)、(2.42×105±3.89×104)和(2.79×105±2.51×104)copies·g-1, 该功能基因在各系统中的丰度水平与amoA相当, 均远高于nxrA.但与amoA不同的是, 不同填料种类条件下各组TFCW中hzsA的丰度水平存在较大差异.另一方面, 各系统中涉及生物反硝化过程的6种基因的丰度分别维持在:(4.71×104±3.56×103)、(3.90×103±1.06×103)、(7.42×104±1.19×103)、(6.03×103±3.40×102)、(1.29×104±8.23×102)和(9.23×103±3.78×102)copies·g-1.与同类型研究相比[29, 30], 上述6种功能基因的丰度偏低, 各系统的反硝化性能亦不甚理想(如2.2节).
上述结果表明, 当各组TFCW稳定运行后, 虽然hzsA的丰度会因填料种类的不同出现波动, 但AOB和ANAMMOX菌始终是其中主要的两种脱氮功能微生物, NOB和反硝化功能菌群的丰度与活性此时则处于较低水平.由此可进一步证实, 当系统的vd设置在适宜的范围内时, CANON作用可成为TFCW脱氮的主要途径; 不同种类的填料会对系统中ANAMMOX菌的富集效果造成不同程度的影响, 随之会影响TFCW中CANON作用的启动时间、强度及其脱氮效果.
2.4 填料理化特性分析各TFCW中所用的填料分别为公分石、陶粒、沸石、废砖块和龙虾壳, 5种填料的部分理化特性如表 3和图 6所示.通常认为, 湿地填料的堆积密度和孔隙率的变化范围分别为0.7~1.83 g·cm-3和30.0%~54.4%[31].由表 3可知, 上述5种填料的堆积密度和孔隙率均处于正常范围内.从相关研究可知, 湿地填料的比表面积一般为2.6~3.9 m2·g-1[32], 则本研究所用的5种填料除公分石比表面积(≈1.78 m2·g-1)较小外, 其他4种填料的比表面积均能满足填充要求.结合图 6可知, 陶粒、沸石、废砖块和龙虾壳表面较粗糙, 微孔孔径均约为2~5 μm, 而公分石表面则较为光滑, 孔隙较少.Roseth[33]的研究表明, 当填料表面分布有孔径范围为1~3 μm的微孔时, 微生物较易在其中挂膜和增殖, 由此可知, 相较于公分石, 陶粒、沸石、废砖块和龙虾壳的表面微结构更有利于生物膜的生长, 应可对TFCW中CANON作用的发生和强化产生积极的推动作用.除物理特性外, 填料的化学成分及其化学形态亦会影响其表面生物膜中相关脱氮微生物(如AOB和ANAMMOX菌等)的丰度与活性[34].图 6表明, 公分石、沸石、陶粒和废砖块均含有较高含量的Al; 除此之外, 陶粒和废砖块还分别含有一定量的Ca和Fe; 龙虾壳主要的成分为CaCO3[35], 其中Ca的含量较为丰富.由表 3可知, 与公分石、陶粒和沸石相比, 龙虾壳和废砖块分别具有更高的EC值, 且龙虾壳为上述填料中唯一的碱性填料, 其pH值高达8.67.
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表 3 填料的部分理化特性 Table 3 Partial physicochemical properties of the five filter media |
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图 6 各填料的表观微结构与表面主要化学成分 Fig. 6 SEM image and EDX spectrum of each filter medium |
在CANON型TFCW的启动过程中, ANAMMOX菌作为参与CANON作用的主要功能微生物, 其富集效果及其活性的高低会受到填料理化性质的显著影响.由上述试验结果可知, 与公分石相比, 陶粒、沸石、废砖块和龙虾壳的表面微结构更有利于生物膜的生长.其中, 沸石对NH4+-N具有良好的吸附效果[21], 可有效延长氨氮在系统中的水力停留时间; 由于废砖块的EC值较高且含有一定量的Fe, 致使其在系统运行时可释放一定量的Fe3+/Fe2+于间隙水中.先前研究指出[36, 37], 适当浓度的Fe2+或Fe3+均可刺激并增强ANAMMOX菌的活性; 龙虾壳为碱性填料, 其EC值最高且以CaCO3为主要成分, 从而可使TFCW填料层间隙水中的碱度提高, Wen等[38]的研究表明, 系统中偏碱性填料(如炉渣和石灰石等)的使用可为ANAMMOX菌的生长与增殖提供充足的碱度, 进而有利于CANON作用的实现.综上所述, 本研究发现将陶粒、沸石、废砖块或龙虾壳作为湿地填料均会促进TFCW中相关脱氮功能微生物(尤其是ANAMMOX菌)丰度与活性的提高, 进而可不同程度地缩短CANON型TFCW的启动时间并提高其脱氮性能.其中, 当选用龙虾壳作为湿地填料时, CANON型TFCW的启动耗时最短, 其脱氮性能亦最佳.因此, 填料的理化特性是构建CANON型TFCW系统的重要参数, 适宜种类填料的填充可强化并提高功能微生物的丰度及其活性, 进而有助于缩短CANON反应体系在湿地系统中的构建进程.
3 结论(1) 填料的理化特性可显著影响ANAMMOX菌的富集效果及其活性, 进而可影响CANON型TFCW系统的启动进程及其脱氮性能.
(2) 相较于公分石, 陶粒、沸石、废砖块和龙虾壳可不同程度地提高ANAMMOX菌在TFCW中的丰度与活性, 进而可缩短CANON型TFCW的启动时间并提高其脱氮性能.
(3) 当填充填料为龙虾壳时, CANON型TFCW仅需300个CD即可完成启动, 且其在稳定运行阶段对TN和NH4+-N的去除率分别可达(88.37±1.19)%和(91.03±0.66)%, 其次为废砖块、沸石、陶粒和公分石.
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