2020, Vol. 41
我国矿产资源种类多、储量大、价值高, 随着经济的发展, 高强度矿产资源开采和不适当的土地利用方式, 导致生态环境被破坏.山西省运城市垣曲县的北方铜业铜矿峪矿, 是我国北方最大的铜业生产基地, 全国最大的非煤地下开采矿山.该区域矿产资源以铜为主, 伴生有钴、钼、金和银等多种金属[1, 2].然而, 矿山开采过程中产生废石、废渣等破坏周边生态环境, 铜尾矿产生的大量尾矿砂不断堆积形成尾矿坝[3, 4].目前, 对矿区生态修复的方法和技术众多, 并且从物理学、化学、生物学和生态学等多种学科相结合的角度, 对矿区生态系统进行修复[1].其中, 植物-微生物联合修复技术, 因其高效、安全和可行性强等优点, 受到广泛关注[5].基于前期调查, 十八河尾矿坝已形成固有植被类群, 优势种白羊草(Bothriochloa ischaemum)对矿砂贫瘠养分及重金属污染等胁迫均有较高耐受性[6, 7].因此, 探究与白羊草相关的微生物群落特征, 对矿区受损生态系统修复过程发掘和利用微生物资源, 提高矿区生态修复效率具有重要意义.
叶际和根际微生物是植物微生物类群的两个重要组成部分[3, 8, 9].叶际微生物是附生或寄生于植物叶片表面生境的微生物[4], 包括细菌、古菌、真菌和原生生物等, 其中, 细菌是叶际微生物中数量最多的一种[10].有研究发现, 不同季节辽东栎叶际微生物的细菌群落存在差异[11]. Redford等[12]对松树叶际细菌群落组成的分析发现, 即使同一物种相距地理距离较大, 但种内的细菌群落分化极小.此外, 除了植物种类、空间位置和季节变化等能够影响叶际细菌群落结构外, 不同的叶片结构, 化学组成和分泌物也会影响叶际微生物群落结构[13].
根际是连接植物、土壤和微生物的纽带, 植物根系通过分泌物、脱落物与植物残体等影响根际土壤微生物群落代谢与种群结构, 进而改变根际土壤环境[14].根际微生物主要包括细菌、真菌和放线菌, 其中, 细菌在生境中数量最多[15].根际微生物一方面受非生物因素的影响, 如气候条件、环境条件(如干旱、高温、高盐和缺磷等)、化肥农药和病虫害感染等[16].另一方面也受生物因素影响, 植物根际环境中各种微生物相互作用, 既有互利共生, 又有竞争制约和互相排斥[12, 17].此外, 植物发育阶段也是决定根际微生物群落结构的关键因素[16].
目前, 大多数研究主要集中在自然生境下植物相关微生物类群的研究, 对矿区受损生态系统中植物叶际和根际细菌群落特征的比较研究仍相对较少.本试验选择铜尾矿区主要恢复植被白羊草为研究对象, 分析重金属污染环境下, 白羊草中叶际和根际细菌群落结构与多样性特征, 拟回答以下科学问题：①何为影响白羊草叶际和根际细菌群落的主要环境因子？②植物叶片和根内重金属对白羊草叶际和根际细菌结构和多样性有何影响？本研究通过发掘铜尾矿生态修复过程中可利用微生物资源, 以期为矿区植物-微生物修复技术的应用提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 试验地概况十八河尾矿坝(35°15′~35°17′N, 111°38′~111°39′E)位于山西省运城市垣曲县, 于1969年建坝.选矿产生的废弃物以矿砂的形式逐年堆积, 并且以每3~5 a形成一个新子坝的速度增长, 尾矿坝初期坝底标高486 m, 坝顶标高509 m, 截至2019年, 该尾矿坝堆筑16道子坝, 堆积高度84 m, 总坡比1:6.该区域年均降雨量为780 mm, 年均气温14℃, 属大陆性季风气候, 四季分明, 春季干旱多风, 夏季雨量集中, 冬季少雪干燥[6].
1.2 研究方法 1.2.1 白羊草和土壤样品采集2017年7月在536号子坝[6](恢复20 a)进行叶片采集, 通过随机取样选取相距50 m以上的1 m×1 m样方, 选择健康的白羊草植株进行叶片和根系的采集, 将白羊草的叶片和根分装在无菌塑封袋内.同时, 对536子坝的土壤进行采集.白羊草叶际、根际及根际土壤样品各3个重复, 总共采集9个样本.其中, 白羊草叶际和根际样本各分为两份, 一份用于理化性质的测定, 另一份置于-80℃冰箱保存, 用于DNA提取和高通量测序.
1.2.2 白羊草叶片和根的理化性质测定土壤pH(土水比为1:2.5)用电位法测定.土壤含水量(SWC)的测定采用烘干法.白羊草叶片和根在混合冷冻研磨仪(MM400, China)粉碎, 土壤和植物叶片、根系重金属[砷(As)、铬(Cr)、镉(Cd)、铜(Cu)、铅(Pb)和锌(Zn)]含量用ICP-AES(Icap6000, Thermo Fisher, UK)测定.白羊草和土壤样品的全氮(TN)、全碳(TC)和全硫(TS)用vario MACRO cube元素分析仪(德国)测定.
1.2.3 白羊草叶际和根际细菌群落的测定采集后用于高通量测序的叶片, 首先使用无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS: NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4)进行洗涤3次, 将收集的清洗液于0.2 μm的滤膜中进行过滤, 收集滤膜置于塑封袋内干冰保存. PCR所用的引物选用515F(5′-GTGCCAGCMGC CGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAG TTT-3′).使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物, 利用Illumina公司的MiSeq PE300平台进行测序.白羊草根际样品没有经过前处理, 低温保存后与叶际样品送到上海美吉生物医药科技有限公司完成高通量测序.
1.3 数据分析首先对原始序列进行数据去杂和质控过滤, 得到优化数据.然后, 使用UPARSE软件对高通量序列按照97%的相似度进行操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)聚类.对OTU代表序列进行物种注释, 用Qiime软件(Version1.7.0)中的blast方法与Unit数据库进行物种注释分析, 并分别在各个分类水平进行统计叶际和根际细菌群落组成.用SPSS 13.0软件对微生物群落结构与环境因子间的线性关系进行Pearson相关性分析.用R软件来分析微生物群落组成差异和绘制韦恩图.冗余分析(redundancy analysis, RDA)分析在软件Canoco 5.0中完成.
2 结果与分析 2.1 白羊草的叶片、根及土壤理化性质白羊草地上与地下部分重金属含量结果表明, Cr在植物中的含量较高, 并且主要富集在根内.土壤中的Cu含量显著高于植物叶片和根内Cu的含量.白羊草叶片中总氮含量显著高于根内和土壤中的氮含量.土壤理化性质表明, 该地区土壤为碱性(pH=8.9, 表 1).
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表 1 白羊草和土壤理化性质及重金属分配情况1) Table 1 Physicochemical properties and heavy metal contents in aboveground and belowground of B. ischaemum and soils |
2.2 白羊草叶际和根际细菌群落结构
通过高通量测序, 白羊草叶际细菌群落共得到20门、48纲、120目、221科和411属.根际细菌群落共得到28门、67纲、143目、254科和434属.其中, 在OTU水平上, 白羊草叶际和根际细菌共有的OTU数为699个, 白羊草根际细菌特有的OTU数显著高于叶际细菌特有的OTU数, 是叶际细菌特有OTU数的4.97倍(图 1).
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图 1 白羊草叶际和根际细菌群落的OTU数 Fig. 1 OTU numbers of phyllosphere and rhizosphere bacterial communities in B. ischaemum |
由图 2可知, 白羊草叶际和根际细菌群落结构具有显著差异.在门水平, 白羊草叶际细菌的优势细菌门包括:变形菌门(50.20%)、蓝藻门(23.96%)和放线菌门(5.72%).白羊草根际细菌的优势门为变形菌门(36.42%)、酸杆菌门(20.88%)、放线菌门(16.02%)以及浮霉菌门(8.78%)[图 2(a)].在属水平, 白羊草叶际细菌优势属包括:norank_c_Cyanobacteria(22.08%)、unclassified_k_norank(13.90%)、norank_ f_Mitochondria(6.88%)、假单胞菌属(5.39%)、肠杆菌属(5.09%)、鞘脂单胞菌属(5.04%)和芽单孢菌属(4.63%).白羊草根际细菌的优势属为:norank_c_Acidobacteria、norank_ f_Planctomycetaceae、Solrubrobacter和酸杆菌属[图 2(b)].
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(a)门水平; (b)属水平; 门水平细菌相对丰度百分大于1%, 属水平细菌相对百分比大于2% 图 2 白羊草叶际和根际细菌群落在门水平和属水平的相对丰度 Fig. 2 Relative abundance of phyllosphere and rhizosphere bacterial communities of B. ischaemum in phylum level and genus level |
通过对白羊草叶际和根际细菌群落进行差异分析结果表明, 在门水平, 叶际和根际细菌放线菌门具有显著差异(P < 0.05), 酸杆菌门、芽单胞菌门和Tectomicrobia门具有极显著差异(P < 0.001), 浮霉菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、装甲菌门和硝化螺旋菌门也呈现出极显著差异(P < 0.01)[图 3(a)].在科水平上, 叶际和根际细菌norank_c_Acidobacteria、丛毛单胞菌科、亚硝化单胞菌科具有极显著差异(P < 0.001), 此外, 浮霉菌科(P < 0.01)、草酸杆菌科(P < 0.05)也具有差异[图 3(b)].
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相对丰度排前15的细菌门和细菌科; *表示差异显著, P < 0.05, **表示差异极显著, P < 0.01, ***表示差异极显著, P < 0.001 图 3 白羊草叶际和根际细菌群落相对丰度在门水平和科水平优势细菌的差异性 Fig. 3 Differences in the relative abundances of dominant bacterial in phyllosphere and rhizosphere of B. ischaemum at phylum and family level |
所有白羊草叶际和根际样本的测序文库的覆盖度均达到98.8%以上, 说明绝大部分细菌序列可以被测出, 测序结果具有较好的代表性.白羊草叶际和根际细菌群落的香农指数具有极显著差异, 并且根际细菌群落的香农指数显著高于叶际细菌. ACE指数和Chao1指数趋势与香农指数一致, 根际细菌的丰富度指数均表现为根际细菌群落显著高于叶际细菌(表 2).
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表 2 白羊草叶际和根际细菌群落丰富度与多样性指数1) Table 2 Richness and diversity index of phyllosphere and rhizosphere bacterial communities in B. ischaemum |
2.5 植物与土壤特性对叶际和根际细菌群落结构与多样性的影响
白羊草叶际和根际细菌群落结构均受到叶片和土壤理化性质及重金属的影响(图 4和图 5), 为研究这些生态因子对白羊草细菌落结构的影响大小及影响因子, 对试验数据进行RDA约束排序分析, 得到在属水平上叶际和根际细菌群落中优势属细菌与4种土壤理化性质及4种叶片特性之间的关系.对于叶际细菌而言, 第一排序轴解释了50.36%的信息, 第二排序轴解释了47.64%的信息(图 4).根际细菌第一排序轴解释了83.09%的信息, 第二排序轴解释了14.81%的信息(图 5).土壤因子中, 土壤SWC、pH、As和Zn显著影响叶际和根际优势细菌属(图 4和图 5).植物属性中, 影响叶际优势细菌属的主要生态因子为叶片TS、叶片TN、叶片Cd和Cr, 根际优势细菌属的主要影响因子为根TS、根N、根Cd和Cr(图 4和图 5).
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图 4 白羊草叶际细菌群落优势属与生态因子的冗余分析 Fig. 4 RDA analysis of dominant bacterial genera and ecological factors in the phyllosphere bacterial community of B. ischaemum |
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图 5 白羊草根际细菌优势属与生态因子的冗余分析 Fig. 5 RDA analysis of dominant bacterial genera and ecological factors in the rhizosphere bacterial community of B. ischaemum |
白羊草叶际和根际细菌群落多样性与叶片和根属性的相关性结果表明, 根际细菌群落香农指数与根Cu含量显著负相关, 辛普森指数与根TN显著正相关.叶际细菌群落ACE指数与叶片TS含量显著正相关(表 3).这表明植物属性对叶际和根际细菌群落多样性的影响具有一定差异性.
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表 3 白羊草叶际和根际细菌群落多样性与叶片和根属性的相关性1) Table 3 Correlations among the phyllosphere and rhizosphere bacterial community diversities of B. ischaemum and leaf and root properties |
3 讨论
叶际和根际微生物是植物微生物的重要组成部分.有研究表明, 变形菌门、放线菌门和酸杆菌门是叶际微生物的优势类群[11, 18].这与本研究部分结果一致, 白羊草叶际和根际细菌的优势细菌门均包含变形菌门和放线菌门.此外, 白羊草根际优势细菌还包括酸杆菌门和浮霉菌门.类似地, 有研究发现, 棉花的根际优势细菌包含变形菌门、酸杆菌门、厚壁菌门、蓝细菌门、放线菌门和浮霉菌门[19].这些微生物对生态系统的结构和功能具有重要影响[9].例如, 变形菌门为革兰氏阴性菌, 外膜主要由脂多糖组成, 保护内部遗传物质不受外部干扰, 因此, 变形菌门可以在大多数环境条件下生存并繁殖, 成为优势菌[20, 21].有研究发现, 变形菌对重金属铜有耐受作用[22].放线菌对根际细菌群落具有明显的抑制与拮抗作用, 放线菌在生长过程中分泌的抗生素可以抑制其他有害病原微生物的生长[23].因此, 矿区受损生态系统中, 白羊草叶际和根际上的放线菌对于植被适应胁迫环境具有重要潜能.本研究发现, 白羊草叶际和根际细菌群落组成具有显著差异, 其中, 放线菌门, 酸杆菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、装甲菌门和硝化螺旋菌门差异极显著.这可能与叶际和根际细菌对铜污染的不同响应机制有关, 使得叶际和根际细菌群落导致差异性[24].
植物叶际微生物的生物多样性受多种生态因子的影响[3, 9].叶际微生物的生存环境不稳定, 受环境变化影响较大, 如光照、温度和湿度等[25].刘利玲等[26]的研究发现, 青杨叶际微生物多样性在雌雄株间无显著差异, 可能是由于青杨雌雄叶片的理化性质相似.本研究中, 白羊草根际细菌特有OTU数显著高于叶际细菌特有OTU数, 且白羊草根际细菌群落的香农指数、ACE指数和Chao1指数均显著高于叶际细菌.导致这一结果的原因, 一方面是由于白羊草叶片属性与土壤理化性质具有显著差异, 另一方面是叶际环境面临着紫外线照射、温差过大等条件不利于叶际微生物生存, 而根系可以通过改变土壤保水性[27]、酸碱度[22]和营养物质[28]等, 改善土壤环境, 促进植物对特有微生物的选择.
对叶际微生物而言, 植物种类、季节变化、宿主植物基因型以及环境等均可对叶际微生物群落结构产生影响[29~31].对根际微生物而言, 土壤是其赖以生存的场所, 土壤复杂的物理化学性质、土壤肥力等因素能够影响植物的生理特性和根际沉积组成, 从而影响植物根际微生物群落[16].本研究发现, 除土壤含水量和pH对白羊草细菌群落有显著影响外, 白羊草总氮和总硫也是影响白羊草叶际和根际优势细菌属的主要生态因子.这可能是因为植物根系分泌物决定宿主植物根系周围定殖的土壤微生物类群, 从而间接影响根际微生物群落的结构[16].此外, 重金属对植物叶际和根际微生物群落也有重要影响, 例如, 根际微生物受铜含量的影响, 且对铜胁迫具有较高耐受性[32].本研究中, 土壤砷和锌、叶片和根内镉和铬的含量对白羊草叶际和根际细菌群落具有显著影响.微生物对重金属的高耐受性包含两种机制, 一方面, 植物能够通过吸收重金属离子的方式, 直接降低根际土壤中重金属浓度[24], 另一方面, 可以通过分泌可溶性有机碳螯合重金属离子, 从而降低重金属的毒性[32].有研究表明, 铜胁迫对沙柳根际微生物群落组成和多样性具有显著影响, 高浓度铜显著降低细菌群落的丰富度和多样性[33].这与本研究结果相类似, 白羊草根际细菌群落香农指数与根内铜含量显著负相关.这可能由于重金属种类、重金属形态与细菌群落相互作用, 并且不同细菌与重金属的相互关系具有差异性, 例如, 有研究报道, 地杆菌属、黄杆菌属、单胞菌属与铜和铬呈现正相关, 与锌呈现负相关[34].这些研究结果为铜尾矿生态修复过程中, 开发可利用的植物与微生物资源, 提高矿区生态修复效率提供科学依据.
4 结论(1) 白羊草根际细菌特有OTU数、多样性指数和丰富度指数显著高于叶际细菌群落.
(2) 变形菌门和放线菌门在白羊草叶际和根际细菌群落中均为优势细菌.
(3) 白羊草叶际和根际细菌之间具有极显著差异的细菌包括：放线菌门, 酸杆菌门、芽单胞菌门和Tectomicrobia门, 浮霉菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、装甲菌门和硝化螺旋菌门.
(4) 土壤水分含量、pH、土壤砷和锌、白羊草总氮和总硫, 及叶片和根的镉和铬是影响白羊草叶际和根际优势细菌属的主要生态因子.
(5) 根际细菌群落香农指数与根内铜含量显著负相关, 辛普森指数与根的总氮含量显著正相关, 叶际细菌群落ACE指数与叶片总硫含量显著正相关.
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