2020, Vol. 41
2. 中国科学院生态环境研究中心中国科学院环境生物技术重点实验室, 北京 100085;
3. 中国科学技术大学生命科学学院, 合肥 230026;
4. 中国科学院大学资源与环境学院, 北京 101408
2. Key Laboratory of Environmental Biotechnology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
3. School of Life Sciences, University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China;
4. College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101408, China
全世界每年生产超过3亿t的石油基合成塑料[1~5], 塑料废物造成的环境污染已成为人们日益关注问题.聚苯乙烯(polystyrene, PS)作为分布广泛又难以在自然环境中降解的一类塑料制品, 对生态环境造成了严重的破坏.自1960年以来, 人们为研究塑料的生物降解做出了巨大的努力[6~9], 关于塑料生物降解的相关研究日益增加, 研究人员尝试从各种来源的环境中分离细菌, 如垃圾、土壤、污水和污泥[10~13], 将PS降解成低分子中间体, 或是将PS矿化为二氧化碳和水.但结果表明, 即使对聚合物进行了预处理, 由于塑料本身的大分子结构紧密, PS的降解效率仍然很低[14~17].
最近的研究表明, 来源于世界各地的黄粉虫, 能够咀嚼、摄取和降解PS[5, 18~21], 同时, 也有报道证实了黑粉虫(Tenebrio obscurus)肠道也具有解聚PS的能力[17].通过肠道微生物的抗生素抑制实验, 证实了在肠道微生物被抑制的情况下, 黄粉虫对PS的降解能力也发生了抑制[17, 19, 22].这些研究表明, 肠道微生物组对分解难消化的塑料起到了很大的作用.
大麦虫(Zophobas morio)属于鞘翅目(Coleoptera)拟步甲科(Tenebrionidae), 是我国由东南亚国家引进的新型蛋白源昆虫[23].苗少娟[24]的研究发现, 大麦虫幼虫对不同种塑料的取食有选择性, 对薄、软和泡沫化程度较高的塑料较为喜食, 且幼虫取食聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)和可发性聚苯乙烯(expanded polystyrene, EPS)泡沫塑料后, 排泄物中原料基本特征变化较大, 物质组分也产生较大变异.殷涛等[25]也发现大麦虫对于EPS泡沫塑料的取食量总体大于其它泡沫塑料.但是, 对于大麦虫的肠道群落结构, 之前的研究中均没有涉及; 对于大麦虫体内降解PS的机制, 仍然不清楚.
本研究检测了大麦虫虫粪中PS的化学结构和组成是否发生了变化, 以研究大麦虫对PS的解聚作用.通过扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)观测大麦虫肠道内与PS表面的微生物群落形态.利用16S rRNA高通量测序技术对不同饲喂条件和不同地域来源大麦虫肠道的细菌群落进行测定, 以探究不同食物对肠道细菌的影响和不同来源大麦虫的肠道细菌对于PS的响应.将肠道悬液与PS在体外进行共培养实验, 来探究肠道细菌在体外对PS的降解能力.本研究初步揭示了大麦虫肠道微生物降解PS的机制.
1 材料与方法 1.1 测试材料PS购买自中国北京的亿兴塑料厂.大麦虫(平均每只幼虫体重800~1 000 mg)购买自中国北京和山东泰安, 用于PS测试.四氢呋喃(tetrahydrofuran, THF, GC级纯度≥99.9%), 1, 2, 4-三氯苯(≥99%, Alfa Aesar, Haverhill, MA), 麦麸购买自北京锐志汉兴公司.
1.2 聚苯乙烯泡沫喂食实验根据大麦虫的取食差异, 本研究设置3个处理组：PS、麦麸+PS和麦麸组. 3个处理组均使用了北京海淀区(B1)虫源, 将其分别命名为B1+PS、B1+B与B1+B+PS组, 每组设置3个平行.在实验前, 将大麦虫保持48 h的饥饿状态.喂食实验开始后, 为了评估大麦虫存活率, 每个平行实验选择100只大麦虫.在为期50 d内, 每5 d对大麦虫的存活数进行记录, 去除死亡的大麦虫, 清理培养容器并且收集虫粪保存于-80℃以备后续实验.另从北京房山区(B2)与山东泰安地区(TA)购买的大麦虫作为对照批实验, 分别命名为B2+PS和TA+PS组(图 1).
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图 1 大麦虫啃食PS的图片 Fig. 1 Photos of Z. morio gnawing PS |
将5只PS组的大麦虫放在体积分数75%乙醇中浸泡1 min, 然后用0.85%NaCl无菌生理盐水洗涤2次.使用无菌镊子取下大麦虫的头和尾, 取出大麦虫的肠道.使用2.5%戊二醛固定剂(中国MACKLIN)固定肠道4 h.之后, 将其用磷酸盐缓冲液(0.1mol·L-1, pH = 7.0)洗涤3次, 每次15 min.然后依次用体积分数30%、50%、85%和95%的乙醇脱水, 每阶段15 min, 最后用100%的乙醇脱水15 min.放置在培养皿中, 倒入5 mL六甲基二硅氮烷, 干燥并脱水5 min, 然后在室温下干燥.纵向切开肠, 用导电胶固定在样品台上, 在6 mA电流下喷金1 min, 并在SEM(HITACHI S-3000N, 日本)下观察.
1.4 大麦虫肠道悬液与PS的体外培养从B1+B、B1+B+PS、B1+PS、B2+PS和TA+PS组分别取10只大麦虫在体积分数75%乙醇中浸泡1 min, 然后用0.85%NaCl无菌生理盐水洗涤2次.用无菌镊子除去大麦虫的头和尾后, 将肠道组织转移至有2 mL 0.85%NaCl无菌生理盐水的研钵中充分研磨至匀浆状[图 2(a)], 再将其转移至无菌离心管中, 用0.85%NaCl无菌生理盐水定容至10 mL.分别将3.5 g的PS碎块用75%的无水乙醇灭菌并吹干, 然后将其放入血清瓶中作为唯一的碳源, 并加入灭菌的无机盐液体培养基.最后, 将B1+PS、B2+PS和TA+PS组的肠道悬液分别加入血清瓶中, 使其占总体积的5%, 这些体外培养组被分别命名为B1-PS、B2-PS和TA-PS组.同时, 将未灭菌的PS添加到含有液体无碳矿物盐培养基的血清瓶中, 并且以不添加肠道细菌悬液作为对照组, 命名为PS-CK组.以上所有实验样品均在30℃和150 r·min-1下进行兼性厌氧培养[图 2(b)].在90 d的培养期结束时, 将液体培养物用于DNA提取和PCR扩增.
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(a)大麦虫肠道微生物DNA的提取; (b)肠道菌悬液与PS体外培养 图 2 大麦虫肠道微生物DNA提取过程和肠道菌悬液与PS的体外培养 Fig. 2 Steps of intestinal microbial extraction from Z. morio and intestinal bacterial suspension and in vitro PS culture |
分别准备4个1 g形状相似的PS碎块用75%的无水乙醇灭菌并吹干, 用B1+PS、B2+PS和TA+PS组无机盐液体培养基制备5%的肠道菌悬液分别将PS块浸没; 另取无机盐液体培养基将PS块浸没作为空白对照. 30℃静置培养21 d, 培养结束后将PS块取出, 用磷酸盐缓冲液(0.1 mol·L-1, pH = 7.0)冲洗, 用2.5%戊二醛固定剂(中国MACKLIN, 0.1 mol·L-1, pH 7.0磷酸盐缓冲液)固定4 h.再用磷酸盐缓冲液洗涤3次, 每次15 min.然后依次用体积分数30%、50%、85%和95%的乙醇脱水, 每阶段15 min, 最后用100%的乙醇脱水15 min.冷冻干燥3 h, 使用SEM(HITACHI S-3000N, 日本)进行观察.
1.6 DNA提取和高通量测序采用TIANamp细菌DNA试剂盒(TIANGEN BIOTECH, 中国)提取B1+B、B1+B+PS、B1+PS、B2+PS和TA+PS组肠道悬液的DNA.细菌16S rRNA基因V3-V4区的扩增采用细菌16S rRNA通用引物357F:5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′和926R:5′-CCGTGAATTCMTTTRAGT-3′.反应条件如下：预变性(95℃, 2 min)→变性(95℃, 20 s, 30个循环)→退火(50℃, 30 s)→延伸(72℃, 5 min).高通量测序在北京奥维森基因技术有限公司的MiSeq测序平台进行, 原始数据上传至NCBI数据库中(序列号：PRJNA603609).
1.7 数据分析原始数据下机后, 结果以Fastq格式存储, 该文件包含每条测序序列的名称、碱基序列以及其对应的测序质量信息. MiSeq测序得到的是双端序列数据, 首先对测得的数据进行过滤处理, 过滤read尾部质量值20以下的碱基, 设置50 bp的窗口, 如果窗口内的平均质量值低于20, 从窗口开始截去后端碱基, 过滤质控50 bp以下的read, 然后根据PE测序的overlap关系将成对的序列拼接成一条序列[26].根据测序前的条形码标签, 确定应将哪个样品分类到每个序列中, 并从融合数据中分离出每个样品数据.最后, 对通过分离获得的每个样本数据进行质量控制过滤, 以获得有效数据[27].
为了探索每个采集样品的物种组成结构信息, 使用Uparse生物信息学分析软件对所有样品的所有Clean Reads进行OTU(操作分类单位)的聚类分析, 以97%的一致性作为基本标准.然后将频率最高的序列作为OTU的代表性序列进行测序, 并在Sliva数据库中进行分析以进行物种注释.为了消除实验误差和统计误差, 最后对每个样品的数据进行处理.均质化的方法是设置阈值(通常是序列数最少的样品), 然后从样品中随机提取由阈值设置的序列数, 以进行进一步分析.在后续步骤中, 不同组之间的两种多样性分析(α多样性和β多样性)均基于均化后获得的数据.在多样本比较分析(β多样性)中, 本研究使用QIIME生物信息学分析软件(1.9.1版)和R软件(3.5.1版)来分析所有样本.
1.8 凝胶渗透色谱与傅里叶变换红外光谱法收集和分析虫粪的方法与先前报道的一致[5, 18].在第31 d的饲喂实验结束时, 用流动的空气清洗了Z. morio幼虫, 并将其转移到一个干净的盒子中, 以便在24 h内收集虫粪, 将收集到的虫粪保存在-80℃, 备用.凝胶渗透色谱法(gel permeation chromatography, GPC, Waters Breeze, Waters, U.S.A)用于分析聚合物分子量的变化.用四氢呋喃(THF)萃取制备PS样品的步骤与之前所述的步骤相似.从PS原样(1.0 g)和PS虫粪中(1.0 g)中萃取PS.在温和加热(60℃)的磁力搅拌器上, 将THF溶液与样品混合, 然后通过0.22 μm PVDF过滤器过滤.将THF萃取的溶液浓缩至5 mL的体积以达到约每mL有5 mg聚合物.将提取物(体积为20 μL)以0.8 mL·min-1的流速注入GPC分析仪.
通过傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR, Thermo Fisher IS5和Thermo Fisher IS10)对PS原样的主要功能基团以及从虫粪中提取的残留聚合物进行了表征, 范围为4 000~500 cm-1.样品制备的方法与已有的报道一致[17, 19, 28].使用衰减全反射(attenuated total reflection, ATR)方法(Thermo Fisher IS10)测试了PS组的虫粪样品, 在分析之前, 将样品干燥至少36 h至50℃, 用溴化钾(potassium bromide, KBr)研磨以制备均匀的KBr颗粒进行扫描(Thermo Fisher IS5).
2 结果与讨论 2.1 不同喂食条件下大麦虫的存活率PS的生物降解实验进行了50 d.在不同饮食条件下, 大麦虫的存活率(survival rate, SR)顺序为(图 3)：B1+B组(88%)>B1+B+PS组(85%)>B1+PS组(73%).饲喂麦麸和PS的大麦虫幼虫比饲喂PS组具有更好的存活率, 麦麸饲喂的大麦虫在32 d时的存活率可保持在90%左右, PS饲喂的大麦虫存活率大约为80%.表明幼虫可通过PS来获得碳源以维持生命, 与先前在黄粉虫中观察到的结果相似[21].与已报道的能摄食PS的黄粉虫和黑粉虫相比, 大麦虫的存活率较低, 这可能是由于大麦虫体形较大, 其自身基础代谢较高所致.总体而言, 单纯饲喂PS, 在50 d内大麦虫存活率可维持在70%左右.
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图 3 大麦虫在50 d内存活率 Fig. 3 Survival rate of Z. morio over the test period (50 days) |
从大麦虫肠道内容物的SEM照片中可以发现, 中肠富含微生物群落, 包括球状、短杆状和棒状等不同形状的微生物[图 4(a)和4(b)].这表明大麦虫的中肠是肠道微生物的主要共生部位.此外, 体外实验的SEM结果表明, 在培养21 d后, 未处理的用于对照的PS表面上没有可见的细菌细胞出现.同时, 在与5%肠道悬液处理的PS表面上, 可以观察到大量的细菌细胞, 甚至形成了生物膜, 这表明这些细菌可以利用PS, 可能能够从PS的降解中获得足够的代谢底物.
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(a)和(b)SEM观察大麦虫喂食PS后肠道微生物群落; (c)大麦虫肠道菌悬液与PS体外培养21 d后扫描电镜观察; (d)未添加肠道菌悬液的PS培养21 d后扫描电镜观察 图 4 大麦虫肠道微生物扫描电镜照片 Fig. 4 SEM images of microbial communities in the gut of Z. morio |
使用Illumina MiSeq测序进行的微生物群落分析表明, 饲喂PS后, 大麦虫幼虫的肠道微生物群发生了显著的变化.根据相对丰度, 大麦虫的肠道微生物组主要由10个科组成[图 5(a)].肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)和肠球菌科(Enterococcaceae)是优势科.饲喂PS后, Enterobacteriaceae、链球菌科(Streptococcaceae)和Pseudomonadaceae的相对丰度均上升了.先前的研究发现黄粉虫中的柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp.)被证明与PE和PS的降解密切相关, 而这种菌属于Enterobacteriaceae[19].当同时饲喂麦麸和PS(B1+B+PS组)时, Enterobacteriaceae的丰度会显著下降, Pseudomonadaceae的丰度会显著上升.这可能是由于麦麸的添加, 增加了肠道菌群所需要的氮源等营养源, 同时Pseudomonadaceae作为塑料降解效率较高的一类菌群[29], 麦麸与PS混合饲喂的条件, 促进了Pseudomonadaceae对PS底物的利用, 因此此处理组Pseudomonadaceae的相对丰度显著升高.彭博宇等人的研究发现[17], 黑粉虫对PS的降解能力比黄粉虫更高, 而黑粉虫肠道内的螺原体科(Spiroplasmataceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)和Enterobacteriaceae的相对丰度也发生了显著的变化.
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(a)科水平的群落组成变化; (b)属水平的群落组成变化; (c)大麦虫肠道菌悬液与PS体外培养21 d后的优势属 图 5 不同取食条件下大麦虫肠道微生物群落结构分析 Fig. 5 Microbial community analysis of gut microbiome for different diets |
使用PS作为唯一碳源与大麦虫的肠道菌悬液在体外培养90 d, 通过16S rRNA测序微生物群落分析发现, 大麦虫幼虫的肠道中含有几种可能使用PS作为碳源的微生物, 这可能与PS的降解有关[图 5(c)].有研究表明, 柠檬酸杆菌属(Citrobacter)可以介导联苯的厌氧转化, 并具有原油降解的潜力[30], 而这一菌属在B1-PS和B2-PS处理组中占有很高的比例.同时, 有报道指出, 假单胞菌属(Pseudomonas)可以降解聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、聚对苯二甲酸乙二酯和其他聚合物[31], 而这一菌在TA-PS组中占比很高.
在属水平上, 摄食PS会导致大麦虫中摩根菌属(Morganella)、Dysgonmonas和克雷伯氏菌(Klebsiella)的相对丰度增加(图 6).根据已有报道, Dysgonmonas可以降解石油和木质纤维素[32, 33]. Klebsiella在B1组中占很大比例, 已有研究报道这种菌可以利用PS作为碳源生长, 并参与原油和多环芳烃的降解[34, 35].乳酸乳球菌(Lactococcus)、螺原体(Spiroplasma)、普罗威登斯菌属(Providencia)和粪球菌(Coprococcus)等都是昆虫肠道常见的内共生菌.通过对不同的分组进行比较, 喂食PS后不同地区大麦虫的肠道菌群不同, 同一地区不同来源的大麦虫的肠道细菌也有明显差异.在不同的饲喂条件下, 随着饮食结构的变化, 大麦虫的肠道细菌比例也会发生变化.此外, 来自不同地区的大麦虫最主要的几个属的相对丰度均会因摄入PS而发生显著的变化.如在喂食PS的处理组中, Citrobacter的相对丰度显著增加.在B1+PS组的大麦虫的幼虫肠道中, Citrobacter相对丰度显著增加, 相对含量为25.8%, 而在TA+PS组中的含量为8.02%(图 6).
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图 6 不同处理组优势菌群在属水平上的相对丰度 Fig. 6 Distribution of dominant bacterial communities in each sample at the genus level |
综上所述, 通过B1+B、B1+B+PS和B1+PS组的分析可以发现, 不同的饲喂条件, 显著改变了大麦虫幼虫肠道的细菌群落组成, 与PS降解相关的微生物菌属相对丰度增加.通过比较B1+PS、B2+PS和TA+PS组肠道微生物群落结构发现, 喂食PS后不同来源的大麦虫幼虫肠道中所富集的细菌有明显差异.根据肠道悬液与PS体外共培养实验, 可以发现在体外培养的肠道菌群中包含能以PS为唯一碳源生存的菌属, 如克雷伯氏菌(Klebsiella)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)等.
2.4 聚苯乙烯的解聚和生物降解中间体的形成在培养的第50 d收集大麦虫的虫粪样品, 通过GPC分析测定了虫粪中提取的残留PS的相对分子质量, 结果表明, B1+PS组虫粪中的PS的数均分子量Mn(106000)和重均分子量Mw(218000)与所饲喂的PS(PS原样)的Mn(112000)和Mw(237800)相比显著降低, 即Mw降低8.3%, Mn降低5.3%(独立样本t检验, P值均＜0.01). PS在经过大麦虫的肠道后, 其相对分子质量分布(MWD)向低分子量偏移[图 7(a)]. Mn和Mw的降低表明在大麦虫中存在PS的解聚和降解.
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(a)质量对数微分分布曲线; (b)傅里叶变换红外光谱检测 图 7 PS原样与喂食PS大麦虫虫粪的分析 Fig. 7 Analysis of PS sample and frass of Z. morio fed with PS |
通过FTIR检测所饲喂的PS、B1+PS组虫粪以及饲喂麦麸的B1+B组虫粪, 结果发现PS组虫粪中PS的结构发生了改变[图 7(b)].在PS原样中, 625~970 cm-1处的峰强度(环弯曲振动)强烈, 但在啮食PS后其虫粪样品中强度减弱. PS的特征环(C=C伸展, 1 550~1 610 cm-1和1 800~2 000 cm-1)在虫粪样品中明显削弱, 这证实了PS经大麦虫肠道消化后, 其特征环受到了破坏.同时PS的特征峰强度降低以及羰基功能团的出现(C=O伸展, 1 700 cm-1), 也表明了PS在大麦虫的肠道内发生了降解.所有虫粪样品FTIR光谱中, 在2 500~3 500 cm-1处的峰宽与羟基或羧酸基团的氢键相关, 这也证实了经大麦虫肠道系统消化后, 虫粪中的PS残留物从疏水性向亲水性表面性质的转变[22].
3 结论北京和泰安地区的大麦虫均可以啮食PS塑料, 大麦虫幼虫具有降解PS的能力. GPC和FTIR测试表明, 在大麦虫中存在PS的解聚现象, 且与黄粉虫的降解模式相似.通过SEM观察发现PS经大麦虫肠道菌悬液处理后, 肠道细菌可以在体外利用PS作为碳源生存繁殖.此外, 使用Illumina MiSeq进行高通量测序, 结果显示, 随着PS的摄入, 大麦虫的肠道微生物菌群发生了显著的变化, Morganella、dysgonmonas、Klebsiella和Pseudomonas等显著富集, 这与降解PS的黄粉虫肠道中的优势菌群相似.这些微生物种群已被证明在黄粉虫肠道中降解PS发挥了重要作用, 因此, 笔者推断大麦虫中也正是这些降解PS的肠道核心菌群发挥了重要作用.同时, 部分肠道核心菌群可以在体外以PS为唯一碳源进行富集, 这为微生物降解聚苯乙烯的工业化提供了可能.
致谢: 王娜和谢飞在实验方面提供帮助, 在此一并致谢！
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