2020, Vol. 41
厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX)是指在厌氧氨氧化菌的作用下, 利用亚硝氮作为电子受体, 将氨氮氧化, 最终产生氮气的过程, 该过程无需外加碳源和剩余污泥产量低, 是一种迄今为止最具创新的生物脱氮工艺.截止2014年, 全球已有100多座生产性的厌氧氨氧化工艺处理高温高浓度的污泥消化脱水液[1].生物脱氮工艺中通常会释放氧化亚氮(N2O), 其为一种强温室气体且具有破坏臭氧层的能力[2].至今研究认为厌氧氨氧化菌本身不会产生N2O, 但其微生物群落中不可避免地含有反硝化菌, 而导致N2O释放[2].
厌氧氨氧化工艺处理市政污水可节约能源、降低运行费用, 有极大地发展前景.然而, 市政污水的温度受季节的影响波动较大, Poh等[3]的研究发现35℃时反硝化工艺中N2O的积累高于25℃, 而Li等[4]则发现氢自养反硝化工艺仅在15℃积累N2O, 故温度对厌氧氨氧化工艺中N2O释放的影响规律亟待研究.此外, 在市政污水中氮素浓度波动大, Kampschreur等[5]的研究发现亚硝氮浓度的增加促进了脱氮工艺中N2O释放, 故基质浓度对厌氧氨氧化工艺中N2O排放的影响也需要研究.
因此, 本文通过序批试验, 研究了不同温度和基质浓度下N2O的释放规律, 探讨了N2O的生成途径, 采用高通量测序探究N2O的微生物机制, 以期为控制厌氧氨氧化工艺中N2O的产生提供支撑.
1 材料与方法 1.1 试验装置及厌氧氨氧化颗粒污泥本试验用的厌氧氨氧化颗粒污泥来源于在实验室运行1.5 a的升流式厌氧氨氧化反应器.试验装置在带水浴夹层的圆柱形有机玻璃反应器内, 反应器的工作体积为700 mL(图 1), 采用磁力搅拌转子进行混合.每次试验均接种100 mL厌氧氨氧化颗粒污泥于反应器中, 试验用水为模拟废水, 微量元素的组成见参考文献[6].
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1.磁力搅拌转子; 2.磁力搅拌器; 3.N2O微电极; 4.pH电极; 5.WTW多参数测试仪; 6.进出水口; 7.N2O电极信号放大器; 8.笔记本电脑; 9.水浴夹层 图 1 厌氧氨氧化序批试验反应装置示意 Fig. 1 Schematic reactor of ANAMMOX batch experiment |
通过水浴, 将反应器温度分别控制在20、25和35℃下, 每个温度下共设有3个起始基质浓度条件, 分别为NH4+-N=NO2--N=40 mg·L-1、NH4+-N=NO2--N=60 mg·L-1和NH4+-N=NO2--N=120 mg·L-1, 反应过程中通过滴加1 mol·L-1盐酸, 将pH控制在7.5.将N2O微电极(N2O-R, Unisense, 丹麦)的尖端浸没在溶液中, 每30 s在线记录溶液中N2O浓度.每间隔一定时间采集水样进行后续分析.
1.2.2 温度对厌氧氨氧化活性及胞内ATP浓度影响通过水浴, 将反应器温度分别控制在15、20、25和30℃下, 起始的基质浓度为NH4+-N=NO2--N=40 mg·L-1, 反应过程中通过滴加1 mol·L-1盐酸, 将pH控制在7.5.间隔一定时间采集水样进行后续分析.在反应开始时、反应2 h和反应4 h时对混合液采样, 用于ATP检测.每组试验重复2次.
1.3 N2O在线监测和计算N2O微电极的校正参考厂商手册.以电极浸没在去离子水中所得信号值为零点, 逐点加入定量的饱和N2O溶液, 记录电极的信号值, 最后根据信号值与N2O溶液浓度进行线性回归, 计算出N2O电极的标准曲线.
在厌氧氨氧化工艺中, N2O的产生和消耗同时发生, 故溶液中积累的N2O是N2O的产生减去N2O的消耗后的净产生量.考虑到厌氧氨氧化工艺无曝气, 且N2O在水中溶解度高(温度为30℃时溶解度为589 mg·L-1), 故计算时假设体系内的N2O未向大气中释放, 几乎全部积累在溶液中.因此, 为计算N2O净产生速率, 采用最小二乘法对一个时间段内N2O的变化进行直线拟合, 得到单位时间内的N2O平均净产生速率.
1.4 16S rRNA基因扩增子测序与数据分析对试验前、中和后期的厌氧氨氧化颗粒污泥采样.进行16S rRNA基因扩增子测序, DNA提取、PCR扩增和高通量测序均在上海美吉生物医药科技有限公司(上海, 中国)进行, 对细菌16S rRNA中V3~V4高变区进行PCR扩增, 引物为通用引物338F/806R.PCR扩增程序采用两步式反应, 重复3次.PCR扩增结束后, 采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物质量.根据MiSeq Reagent Preparation Guide(Illumina, 美国)构建DNA文库, 在Illumina MiSeq测序平台上进行双端测序, 读长为300 bp.
软件Trimmomatic v0.22用于移除适配子、剪切原始测序序列(reads), 过滤质量20以下的碱基、碱基对数目50以下的测序序列; 采用Flash 1.2.11软件对双端序列进行拼接; 采用Usparse软件, 对拼接后的序列进行可操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs)聚类.基于Qiime平台, 将OTUs序列与SILVA132数据库进行比对, 从而完成OTUs序列分类注释; α多样性分析采用Mothur软件, β多样性在Qiime平台完成.获得OTUs表格后, 数据的可视化均在美吉生物云平台完成(www.majorbio.com).
1.5 分析方法水样经过0.22 μm滤膜过滤后对水质指标进行检测.氨氮、亚硝氮、硝态氮和生物量检测参考国家标准方法[7].采用Nano measurer软件对颗粒污泥粒径分布进行统计分析.pH值和溶解氧浓度采用电极在线监测(WTW, 德国).
为检测细胞内ATP, 将1 mL混合液样品于15000 r·min-1离心5 min后, 去除上清液, 样品保存在-20℃冰箱直至ATP检测.提取胞内ATP方法参考文献[8], 具体操作如下：将去离子水煮沸后, 每个样品各加入1 mL沸水和一勺0.4 mm玻璃珠, 振荡混合5 min后, 于15000 r·min-1离心5 min, 保存上清液用于ATP检测.ATP浓度的检测采用BacTiter-GloTM试剂盒(G8230, Promega, 美国), 具体操作如下：提前24 h将BacTiter-GloTM Buffer在室温下解冻.BacTiter-GloTM Substrate恢复室温后, 将BacTiter-GloTM Buffer和BacTiter-GloTM Substrate等量混合, 避光保存混合试剂.在96孔板中, 每孔加入100 μL样品和100 μL混合试剂, 96孔板在多功能酶标仪内30℃下混合5 s后, 读取发光光度(SpectraMax M5, Molecular Devices, 美国), ATP的浓度用相对荧光单位(relative fluorescence units, RFU)来表示.
2 结果与讨论 2.1 基质浓度对N2O释放的影响厌氧氨氧化颗粒污泥经过实验室长期驯化, 脱氮效果良好, 在35℃不同进水基质浓度下, 氮素和N2O浓度随时间的变化见图 2.从中可发现, 进水基质浓度不同时, 氮素和N2O浓度随时间变化趋势相似.以35℃、进水亚硝氮浓度40 mg·L-1为例, 该条件下颗粒污泥的比厌氧氨氧化活性(以N/VSS计, 下同)为662 mg·(g·d)-1, 出水亚硝氮未检出.厌氧氨氧化反应开始时液相N2O浓度(以N计, 下同)为0.1 mg·L-1, 随着反应的进行, N2O浓度逐渐上升, 在达到峰值0.5 mg·L-1后, 液相N2O的浓度逐渐降低, 在反应末期N2O的浓度趋于稳定值0.1 mg·L-1.反应周期内, 不同时间段的N2O净产生速率见图 2, N2O净产生速率在反应开始时达到最大速率0.012 mg·(L·min)-1, 随着反应进行逐渐降低; 在反应进行1 h后, N2O净产生速率为负值, 代表体系中N2O的消耗速率大于N2O的产生速率, N2O净产生速率最小值为-0.015 mg·(L·min)-1. 35℃条件下, 随着进水NO2-浓度从40 mg·L-1增加至60 mg·L-1和120 mg·L-1时, N2O最高积累浓度从0.5 mg·L-1增加至1.5 mg·L-1和2.4 mg·L-1, N2O/ΔTN分别为0.85%、1.43%和1.11%, 最大N2O净产生速率相应从0.012 mg·(L·min)-1增加至0.018 mg·(L·min)-1和0.026 mg·(L·min)-1.在25℃下, N2O最高积累浓度、N2O净产生速率和N2O/ΔTN随着进水浓度增加而增加(表 1).在20℃下, 进水NO2-浓度从40 mg·L-1增加至60 mg·L-1时, N2O最高积累浓度从0.4 mg·L-1增加至1.0 mg·L-1, 而进水NO2-浓度从60 mg·L-1增加至120 mg·L-1时, N2O最高积累浓度从1.0 mg·L-1降低至0.8 mg·L-1.
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图 2 在35℃下, 不同进水浓度下液相氨氮、亚硝氮、硝氮、N2O及N2O净产生速率随时间变化 Fig. 2 At 35℃, NH4+, NO2-, NO3-, N2O profiles, and net N2O production rate during varying influent concentrations |
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表 1 不同温度和进水基质浓度下, 厌氧氨氧化工艺中N2O的释放 Table 1 N2O emission at different temperatures and different influent concentrations |
本研究中, 35℃时最高N2O积累浓度占进水总氮比率在0.36%~0.75%之间, 略高于已有报道的小试厌氧氨氧化反应器的检测值0.1%, 与实际规模厌氧氨氧化工艺中N2O排放接近(表 1).基质浓度显著地影响N2O释放, 首先, 基质浓度增加导致N2O最大积累浓度增加, 相关性分析表明N2O最大积累浓度与ΔTN和ΔNO2-呈正相关关系, 相关系数(R2)分别为0.70和0.56, 表明总氮去除量为决定N2O积累的重要因素.其次, 基质浓度增加导致N2O/ΔTN增加, 即工艺中更高比例的去除的氮素会转化为N2O积累在溶液中, 从而增加N2O的释放.故在去除总氮的量相同时, 控制进水基质浓度能够有效降低厌氧氨氧化工艺中N2O的释放.
厌氧氨氧化污泥的微生物群落中, 厌氧氨氧化菌、好氧氨氧化菌和反硝化菌同时存在, 在缺氧的条件下, 反硝化的N2O产生途径, 包括好氧氨氧化菌的反硝化和反硝化菌反硝化被认为是主要的N2O产生途径; 考虑到好氧氨氧化菌在厌氧氨氧化微生物群落中丰度较低, 故N2O主要是作为反硝化的中间产物积累.厌氧氨氧化工艺进水基质主要为氨氮和亚硝氮, 氨氮对反硝化途径的N2O的产生影响较小, 而亚硝氮能够显著促进反硝化N2O的产生[9, 10], 故在进水亚硝氮浓度增加时N2O产生的增加可能是由于亚硝氮促进反硝化过程中N2O的积累而导致的.与本文结果相似, Kampschreur等[11]在生产性的厌氧氨氧化工艺中也观察到NO2-浓度的波动导致NO在气相中浓度的波动, 当进水流量降低时, NO浓度降低了40%.虽然在本试验中工艺无曝气, 溶液中积累的N2O能够逐渐地被降解, 但厌氧氨氧化工艺常与短程硝化耦合在一个反应器中, 厌氧氨氧化颗粒污泥中积累的N2O会在曝气时被吹脱释放, 故单独研究厌氧氨氧化工艺中N2O的产生, 有利于加深对一体式工艺中N2O释放的理解.
2.2 温度对厌氧氨氧化活性影响温度对厌氧氨氧化活性的影响显著, 不同温度下, 厌氧氨氧化活性和胞内ATP浓度变化见图 3.当反应器温度从30℃降低至25℃和20℃时, 比厌氧氨氧化活性从850 mg·(g·d)-1降低至768 mg·(g·d)-1和539 mg·(g·d)-1, 出水亚硝氮浓度未检出.然而温度进一步降低至15℃时, 比厌氧氨氧化活性骤然降低至47 mg·(g·d)-1, 且出水亚硝氮浓度始终在2 mg·L-1上.对胞内ATP检测发现, 30℃条件下, 胞内ATP浓度(以VSS计, 下同)平均为2.9×108 RFU·g-1.温度降低时, 胞内ATP浓度随之降低, 当温度为15℃时, 胞内ATP浓度平均为1.3×107 RFU·g-1, 胞内ATP浓度降低至30℃时的4%.
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图 3 温度对于厌氧氨氧化活性及细胞内ATP含量影响 Fig. 3 ANAMMOX activity and ATP concentration at different temperatures |
温度降低明显抑制了厌氧氨氧化反应的活性, 15℃时的比厌氧氨氧化活性仅为30℃时的6%, 且从20℃降低至15℃时, 比厌氧氨氧化活性降低更为剧烈.与本文的结果类似, Lotti等[14]对来自实验室反应器和实际水厂的厌氧氨氧化污泥进行活性的检测, 发现温度从30℃降低至15℃时, 比厌氧氨氧化活性降低至30℃时的20%.推测低温下厌氧氨氧化活性降低原因包括反应活化能增加、胞内能量水平降低.据报道, 温度能改变厌氧氨氧化反应的活化能, Isaka等[15]的研究发现在28~37℃, 厌氧氨氧化反应活化能为33 kJ·mol-1; 在22~28℃时, 反应活化能升高至93 kJ·mol-1.本文发现低温条件下, 胞内ATP含量明显降低, ATP是细胞内的能量货币, 温度降低时胞内ATP浓度的降低意味着胞内能量存储的降低.Lin等[16]采用宏蛋白组学研究厌氧氨氧化菌群, 发现在15℃时, 厌氧氨氧化活性严重抑制, Candidatus Kuenenia的NADH脱氢酶类似蛋白的水平降低, 可能导致细胞内能量合成降低.故低温下厌氧氨氧化菌能量合成受到限制, 微生物通过消耗胞内ATP来维持代谢活动, 从而导致胞内ATP水平降低.
2.3 温度对N2O释放影响温度显著地影响工艺中N2O的释放(表 1).结果表明, 在进水基质浓度相同时, 温度越低, N2O净产生速率降低、N2O/ΔTN降低.在进水NH4+为40 mg·L-1条件下, 温度从35℃降低至25℃和20℃时, N2O最大积累浓度从0.5 mg·L-1降低至0.4 mg·L-1和0.38 mg·L-1, 分别占总氮去除量的0.85%、0.59%和0.64%, 相应地最大N2O净产生速率从0.0116 mg·(L·min)-1降低至0.0034 mg·(L·min)-1和0.0033 mg·(L·min)-1.在进水NO2-为60 mg·L-1, 温度从35℃降低至25℃和20℃时, N2O/ΔTN分别为1.43%、0.91%和1.01%;在进水NO2-浓度为120 mg·L-1, 温度从35℃降低至25℃和20℃时, N2O/ΔTN分别为1.11%、1.42%和0.55%.相关性分析发现温度与最大N2O净产生速率呈正相关关系, 相关系数(R2)为0.74.
结果表明厌氧氨氧化工艺温度降低导致N2O净产生速率降低, N2O释放减少.厌氧氨氧化工艺中N2O释放来源于反硝化菌群, 许多研究表明温度降低会导致反硝化速率降低[17, 18], 故推测温度降低时厌氧氨氧化工艺中反硝化菌的反硝化速率降低, 从而导致反硝化的N2O产生减少.与本结果相似, Hu等[19]的研究发现厌氧氨氧化工艺在15℃时N2O的释放低于30℃时N2O的释放.然而, Wang等[20]研究反硝化工艺发现运行温度发生变化时, 不论温度降低还是升高, N2O的排放都出现增加, 温度的波动导致N2O释放的增加; 同时运行温度越低, NO还原酶基因和N2O还原酶基因的转录水平降低.Li等[4]研究氢自养反硝化污泥发现仅在15℃时N2O大量积累, 温度更高时(20~50℃)未发现N2O积累, 推测是由于15℃时N2O还原酶活性降低导致.因此, 温度对N2O释放的影响规律还取决于微生物群落反硝化功能基因丰度、功能基因表达和功能酶的活性.
2.4 微生物群落结构厌氧氨氧化工艺中N2O的释放与微生物群落结构有关.对厌氧氨氧化颗粒污泥进行16S rRNA扩增子测序, 平均每个样品产生43803个测序序列(reads)和18322772个碱基对.将所有样品序列进行聚类分析, 共发现710个OTUs.对OTUs注释后发现, 在门水平上, 污泥中优势的菌群为Chloroflexi、Proteobacteria、Bacteroidetes和Planctomycetes(图 4), 其中, AnAOB所在的Planctomycetes门在厌氧氨氧化污泥样品中的相对丰度为10.3%~18.0%.在属水平上, Anaerolineae_uncultured 1为丰度最高的属, 其相对丰度为11.3%~19.5%.共发现两种优势的厌氧氨氧化菌, Candidatus Brocadia和Ca. Jettenia, 其相对丰度分别为6.9%~13.8%和1.4%~2.6%.此外, Anaerolineae_uncultured2、δ-Proteobacteria_uncultured和Denitratisoma也是微生物群落中的优势属.样品AMX1、AMX2和AMX3分别为检测N2O释放的序批试验开始时、中间、结束时采集的污泥样品, 在3个样品之间, 微生物群落的组成在属水平和门水平上的差异不显著, 表明试验过程中厌氧氨氧化颗粒污泥的微生物群落结构相似.
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图 4 微生物群落结构组成 Fig. 4 Microbial community composition |
厌氧氨氧化工艺中除了自养的厌氧氨氧化菌外, 常发现大量的异养菌, 例如Proteobacteria门、Chloroflexi门和Bacteroidetes门等[21, 22].这些异养菌能够以胞外多聚物、溶解性微生物产物和细胞凋亡的产物等微生物源有机物为能源, 通常具有反硝化功能, 是N2O释放的来源[23, 24]. Zhu等[25]报道厌氧氨氧化工艺中出现N2O积累, 发现仅有3个菌种编码有N2O还原酶基因(nitrous oxide reductase gene, nosZ), 分别为Burkholderiaceae、Rhodospirillaceae和Rhodobacteraceae, 而有更多的菌种具有亚硝酸盐还原酶基因(nitrite reductase, nir), 例如Anaerolineaceae、Comamonadaceae、Actinobacteria、Comamonas和Denitratisoma等, 故微生物群落具有N2O积累的潜能.Lawson等[23]运用宏转录组学的方法, 发现厌氧氨氧化工艺中所有的异养菌基因组都有反硝化基因潜能, 同时反硝化基因高度表达, 优势菌种Proteobacteria和Anaerolineae等表达了亚硝酸盐还原酶基因, 同时Ignavibacteriales、Proteobacteria和Bacteroidetes表达了N2O还原酶基因, 共同构成完整的反硝化通路.与此前研究类似, 本文中厌氧氨氧化微生物群落包含了丰富多样的异养菌, 发现大量Anaerolineae和Denitratisoma等具有产生N2O潜能的菌种, 为工艺中N2O释放的来源.同时也发现了属于Burkholderiaceae科的Limnobacter属和Ignavibacteriales等具有N2O降解潜能的异养菌, 能够降解工艺中积累的N2O.故厌氧氨氧化工艺中N2O积累是丰富多样的反硝化菌产生和消耗N2O的结果.
3 结论(1) 在25℃和35℃时, 随着进水NO2-浓度从40 mg·L-1增加至60 mg·L-1和120 mg·L-1, 厌氧氨氧化工艺N2O最大积累浓度升高、N2O净产生速率增加和N2O/ΔTN增加.N2O最大积累浓度与ΔTN和ΔNO2-的相关系数(R2)分别为0.70和0.56, 呈正相关关系, 表明基质浓度增加会导致更高比例的去除的氮转化为N2O积累在溶液中.
(2) 温度降低抑制了厌氧氨氧化活性, 15℃时的比厌氧氨氧化活性仅为30℃时的6%, 胞内ATP浓度随之降低.进水基质浓度相同时, 温度从35℃降低至25℃和20℃, 工艺中N2O/ΔTN降低, 温度降低导致厌氧氨氧化工艺中N2O的释放减少和N2O净产生速率降低.
(3) 高通量测序结果表明厌氧氨氧化菌Ca. Brocadia和Ca. Jettenia为优势菌属, 其相对丰度分别为6.9%~13.8%和1.4%~2.6%.厌氧氨氧化工艺微生物群落中存在丰富的异养反硝化菌, 如Chloroflexi门、Proteobacteria门和Bacteroidetes门.微生物群落结构与工艺中N2O的释放密切相关, 工艺中N2O的积累主要是反硝化菌产生和消耗N2O的结果.
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