2020, Vol. 41
2. 重庆大学三峡库区生态环境教育部重点实验室, 重庆 400045;
3. 山东科技大学安全与环境工程学院, 青岛 266590
2. Key Laboratory of the Three Gorges Reservoir Region's Eco-Environment, Ministry of Education, Chongqing University, Chongqing 400045, China;
3. School of Safety and Environmental Engineering, Shandong University of Science and Technology, Qingdao 266590, China
长三角区域位于我国东南沿海, 是暴雨、夏季高温和冬季低温等极端气候经常发生的地区之一, 其冬季寒冷季节气温可低至-10~-12℃, 与此对应的是该地区市政污水厂低温季节常出现排水超标, 表现在出水氨氮升高, 系统硝化效果恶化, 进而导致出水TN升高.随着全国大范围污水厂提标改造行动的到来, 对于长三角地区污水厂选择合适的处理工艺进行改造以保证低温季节稳定达标显得更加重要.另外, 污水处理厂提标改造, 往往受制于污水处理厂实际情况, 表现在不能新增用地及对原有构筑物需充分利旧, 因此, 工艺占地以及工艺与其他单元的兼容性成了制约工艺选择的一项重要因素.现阶段, 我国大多数污水处理厂核心工艺(生物池)均为A2/O工艺及其变种, 而MBBR(移动床生物膜反应器)工艺可在无需增加额外占地、不改变原有工艺路线的情况下, 实现深度脱氮, 具有较好的应用前景.当前, 污水厂提标改造时为提升系统的硝化效果, 大多选择在生化段好氧池投加悬浮载体, 实现原池“镶嵌”MBBR以形成MBBR泥膜复合工艺(hybrid-MBBR), 通过悬浮载体对硝化细菌的高效富集而满足工艺的硝化效果.截止目前, 基于MBBR的泥膜复合工艺应用已经成熟, 且成为占地紧凑、运行简单的污水处理解决方案, 全球至少有600家规模相当的污水厂采用MBBR泥膜复合工艺运行[1].
当前, 关于污水厂微生物多样性研究多局限于活性污泥系统[2], 高晨晨等[3]采用MiSeq高通量测序技术对9座城市污水处理厂生物脱氮除磷系统的活性污泥群落结构进行了分析.结果表明, 这些活性污泥系统中的优势微生物种群均以变形菌门和拟杆菌门为主, 而且变形菌主要分布在β-Proteobacteria(β-变形菌纲), 而脱氮除磷菌属主要为Nitrosomonas(亚硝化单胞菌属)和Accumulibacter phosphatis.而张晓红等[4]通过研究京津冀区域市政污水厂活性污泥种群结构的多样性及差异时, 对5个污水厂活性污泥的微生物种群结构特征进行了详细解析, 研究不同工艺参数下活性污泥中优势种群及脱氮菌群丰度的差异.结果发现对于不同污水厂, 影响其活性污泥群落结构组成的环境因素也是不同的, 并且特殊的进水水质也会对污泥菌群组成和生物多样性产生影响.而MBBR泥膜复合系统由于兼具活性污泥和悬浮载体生物膜两种微生物存在形式, 研究其微生物多样性变化, 探究群落变化规律对于指导MBBR泥膜复合工艺运行具有重要意义, 但当前对于此类生化系统研究较少, 无法得出规律性结论.
本文针对长三角地区部分基于MBBR泥膜复合工艺改造的污水厂进行研究, 针对其低温季节系统微生物群落状态, 结合污水厂冬季低温季节的运行效果, 并通过硝化小试的形式对污水厂微生物群落分布规律进行了验证, 以期为MBBR泥膜复合硝化系统的长期稳定运行提供微观技术支撑.
1 材料与方法 1.1 工艺类型及宏观效果长三角地区污水厂编号A~E, 其进水多以生活污水为主, 个别污水厂混合工业或医疗废水.在工艺类型上, 多为A2/O及相关变形工艺, 各污水厂均采用好氧段投加悬浮载体以形成MBBR泥膜复合硝化系统的技术路线进行了提标改造, 改造后出水执行《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)一级A类水标准.改造完成后生化段冬季进出水水质如表 1所示, 系统硝化效果得到明显加强, 各污水厂运行情况良好, 全年出水稳定达标, 多个污水厂低温季节出水水质可远优于一级A标准.
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表 1 各污水厂实际进出水水质/mg ·L-1 Table 1 Influent and effluent water quality of each wastewater treatment plant/mg ·L-1 |
污水厂所投加的悬浮载体均为SPR-Ⅱ型, 悬浮载体直径为25 mm±0.5 mm, 高10 mm±1 mm, 挂膜后比重与水接近, 有效比表面积大于620 m2 ·m-3, 符合《水处理用高密度聚乙烯悬浮载体填料》(CJ/T 461-2014)行业标准的要求, 挂膜后的悬浮载体如图 1所示, 表观悬浮载体生物膜呈黑灰色, 悬浮载体生物膜致密不易脱落, 在系统中的流化状态良好.
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(a)~(e)分别对应A~E污水厂的悬浮载体 图 1 各污水厂悬浮载体挂膜状态 Fig. 1 Membrane state of suspended carriers in each wastewater treatment plant |
为研究MBBR泥膜复合硝化系统的微生物群落特征, 对各好氧段活性污泥和悬浮载体生物膜进行微生物检测分析.于2019年3月份取各污水厂生化池好氧段悬浮载体及活性污泥进行微生物检测, 此时系统经过整个冬季低温过程, 生物菌群已较为成熟, 适合进行结果对比.所取样品经处理后进行基因组DNA提取.其中, 悬浮载体需剪碎使悬浮载体生物膜表面的菌群能更好地与裂解液接触, 进而使更多的细胞壁破裂以释放DNA.操作过程中使用的剪刀和镊子必须先在酒精灯下高温灭菌, 适当冷却后再用, 操作需迅速, 减少环境中杂菌的污染.活性污泥则直接取适量样品放入灭菌的1.5 mL EP管中进行提取, 污泥含量较低时可适当离心取沉淀进行提取.
1.2.2 基因组扩增及扩增子测序DNA提取步骤参照OMEGA试剂盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit使用说明书进行, DNA提取后经1%琼脂糖凝胶电泳检测条带完整性, 以Nanodrop核酸定量仪测定其浓度.PCR扩增所用引物为341F/805R, 即5′-CCTACACGACGCTCTTCCG ATCTNCCTACGGGNGGCWGCAG-3′与5′-GACTGGA GTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGA TCTAATCC-3′.PCR反应体系包括DNA模板(10 ng), 15 μL 2×Taq master Mix, 1 μL引物314F(10 μmol ·L-1), 1 μL引物805R(10 μmol ·L-1), 添加超纯水至30 μL.共进行两轮PCR扩增.第一轮PCR扩增程序如下：94℃预变性3 min; 5个循环包含3个阶段, 即94、45和65℃温度下分别保持30、20和30 s; 20个循环包含3个阶段, 即94、55和72℃温度下分别保持20、20和30 s; 72℃终延伸5 min.第二轮PCR扩增程序如下：95℃预变性3 min; 5个循环包含3个阶段, 即94、55和72℃温度下分别保持20、20和30 s; 72℃终延伸5 min. PCR产物进行琼脂糖电泳, 通过Omega PCR纯化试剂盒Cycle Pure Kit对PCR产物进行回收, 利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量, 按照1 :1等量混合后测序, 等量混合时, 每个样品DNA量取10 ng, 最终上机测序量为20 pmol, 通过Illumina MiSeq测序平台完成对样品高通量测序.
1.2.3 生物信息学分析高通量测序结果采用Qiime进行序列去重过滤并对不同样本按最小样本序列数抽平后分析; 采用Usearch平台分别对检测到的物种进行OTU聚类, 首先对优化序列提取非重复序列, 便于降低分析中间过程冗余计算量并去除没有重复的单序列, 之后按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类, 在聚类过程中去除嵌合体, 得到OTU的代表序列.将所有优化序列map至OTU代表序列, 选出与代表序列相似性在97%以上的序列, 生成OTU表格; 采用Mothur分析所有样本的α多样性, 计算微生物α多样性指数, 包括Chao1指数、Ace指数、Simpson指数、Shannon指数及coverage(覆盖度).其中, Chao1指数为常用于估计群落中含有的OTU数目, 在生态学中常用来估计物种总数, 由Chao等[5]最早提出.Chao1指数越大, OTU数目越多, 说明该样本物种数比较多.Ace指数是用来估计群落中含有的OTU数目, 同样由Chao等[5]提出, 是生态学中估计物种总数的常用指数之一.默认将序列量10以下的OTU都计算在内, 从而估计群落中实际存在的物种数.Ace指数越大.表明群落的丰富度越高.Simpson指数是用来估算样品中微生物的多样性指数之一, 由Simpson[6]提出, 在生态学中常用来定量地描述一个区域的生物多样性.Simpson指数值越大, 说明群落多样性越低, 也用该指数描述从一个群落种连续两次抽样所得到的个体数属于同一种的概率以反映群落均一程度.在物种丰富度相同前提下, 物种分布越均匀, 多样性则越高.而Shannon指数[7]综合考虑了群落的丰富度和均匀度.Shannon指数值越高, 表明群落的多样性越高, 物种分布越均匀.coverage是指各样品(克隆)文库的覆盖率, 其数值越高, 则样品中序列被测出的概率越高, 而没有被测出的概率越低, 该指数反映本次测序结果是否代表了样品中微生物的真实情况.从样本中随机抽取一定数量的序列, 统计这些序列对应样本的α多样性指数, 以抽取的数据量为横坐标, 以α多样性指数值为纵坐标绘制稀疏曲线, 根据曲线是否达到平缓来判断本次测序数据量是否足够.分别从污水厂整体、悬浮载体生物膜、活性污泥进行研究, 绘制物种分布Venn图, 通过RDP classifier软件将序列进行物种分类, 分别按照门(phylum)、纲(class)和属(genus)水平为分类单位, 统计该分类单位下优势单元所占相对丰度, 绘制相对丰度分布图, 并利用HemI软件进行物种聚类分析, 绘制物种聚类Heatmap图; 以PICRUSt软件及伯杰细菌分类手册中关于不同菌属的功能描述对扩增子测定结果进行功能预测.
1.3 好氧段沿程水质测定为进一步验证微生物对于宏观运行的效果, 对好氧沿程水质进行测定以探究各污水厂的实际运行情况, 好氧段沿程测定样品包括好氧池进出水, 取样点位于好氧池进出水口, 每间隔2~3 h取样, 取3次后做混合样测定.所有样品先快速沉淀后取上清液, 取回后及时进行预处理, 将3次样品等量混合均匀后进行氨氮、硝氮、TN及COD的测定.
1.4 硝化小试为探究各系统中, 悬浮载体生物膜和活性污泥对硝化效果的贡献, 分别取各污水厂悬浮载体生物膜和活性污泥分别进行了硝化小试研究(表 2).硝化速率的测定用水为各污水厂生化段好氧池进水经沉淀后的上清液, 小试每次同批进行2组, 分别设置纯悬浮载体生物膜和活性污泥系统.纯膜系统按各污水厂实际填充率投加悬浮载体; 纯泥系统不投加悬浮载体, 污泥浓度与好氧池一致; 小试期间系统温度及溶解氧均与各污水厂好氧池保持一致, 定时取样并测定水质参数.
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表 2 各污水厂硝化小试实验控制条件 Table 2 Control conditions of nitrification pilot test of each WWTP |
1.5 悬浮载体生物量(VSS)测定
取挂膜悬浮载体115个(堆积体积1 L), 用缓水流冲洗以去除表面浮泥后放入质量分数10% NaOH溶液中开启超声进行脱膜处理, 至悬浮载体生物膜完全脱落后用定量滤纸将脱落的悬浮载体生物膜过滤收集后按照式(1)测定并计算悬浮载体生物膜生物量.
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(1) |
式中, VSSBiofilm表示悬浮载体生物膜VSS(mg ·L-1); m1表示105℃鼓风干燥箱烘干称至恒重时悬浮载体生物膜质量(mg); m2表示500℃烘干1 h后冷却至恒重时剩余悬浮载体生物膜质量(mg); v表示悬浮载体体积(L); f表示悬浮载体填充率(%).
1.6 指标测试沿程实验及小试水样的相关水质常规指标检测方法具体为, NH4+-N：纳氏试剂分光光度法; NO3--N：紫外分光光度法; TN：碱性过硫酸钾消解法; pH、DO和T均采用WTW Multi-3430i实时监控.
2 结果与讨论 2.1 高通量测序结果代表性分析以Shannon指数和Simpson指数随序列条数的变化来判断本次测序数据量是否足够代表样品所包含的所有微生物, 如图 2所示, 随着样品测序序列数的增加, Shannon指数和Simpson指数均趋于平缓, 即说明本测序结果涉及的所有样品均可包含样品所含所有微生物.
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图 2 样品稀疏线曲线分析 Fig. 2 Analysis of sample sparse line curve |
从α多样性及系统OTU数分布特点综合分析微生物多样性.不同污水厂好氧悬浮载体生物膜和活性污泥微生物群落的α多样性指数如表 3所示.从污水厂间看, A污水厂悬浮载体生物膜和活性污泥Chao1、Ace和Shannon指数均明显高于其他污水厂, 但Simpson指数属于较低水平, 说明A污水厂物种数最多, 且物种分布较为均匀, 综合微生物多样性最高; 这可能与A污水厂进水中含有工业废水, 水质较为复杂相关.从微生物存在形式看, A、B、C和E污水厂中, 悬浮载体生物膜Chao1指数均低于同系统活性污泥, 说明悬浮载体生物膜物种数目更低, 同时, Simpson指数高于同系统活性污泥, 说明悬浮载体生物膜中物种分布越不均匀, 综合Shannon指数分析可见悬浮载体生物膜微生物多样性低于同系统活性污泥, 且物种分布更不均匀.而D污水厂多样性结果相反, 可能与其进水基质较低有关, 由于悬浮相微生物的传质阻力要小于附着相微生物[8], 因此在系统基质较低时, 附着悬浮载体生物膜可能在参与基质竞争过程处于劣势, 导致其生长杂菌较多.
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表 3 α多样性分析指数 Table 3 The α diversity analysis index |
基于OTU水平的物种差异分析可比较不同污水厂共有及独有OTU数目[9], 进而初步确定不同污水厂微生物组成的差异性.对各污水厂总OTU数进行统计, 结果如图 3所示.由图 3(a)可知, 从系统整体看, 5个污水厂总OTU种类数为5 441, 各污水厂共有OTU 355个, 占比6.52%, 说明各污水厂在微生物物种组成上具有一致性, 但一致性并不高.除A和D污水厂外, 其他3个污水厂进水多为普通生活污水, 水质成分较为稳定, 其生化系统中OTU种类数也基本稳定在2 000上下.由图 3(b)可知, 从悬浮载体生物膜看, 5个污水厂悬浮载体生物膜总OTU种类数为3 878, 其中共有OTU为211个, 占比5.44%, 相似性同样较低, 污水厂悬浮载体生物膜中OTU种类数为1 014~1 782之间.由图 3(c)可知, 从活性污泥看, 5个污水厂活性污泥总OTU种类数为4 087, 其中共有OTU为188个, 占比4.60%, 相似性较污水厂之间及悬浮载体生物膜之间更低, 除A和D污水厂外, 其他3个污水厂活性污泥中OTU种类数为1 392~1 573之间, 该水平与张晓红等针对京津冀地区市政污水厂活性污泥种群结构研究中所得OTU种类数较为一致[4], 说明悬浮载体的投加并未明显改变系统中活性污泥的微生物种类数.但MBBR泥膜复合系统中检测到的OTU总数明显较活性污泥中多, 显然悬浮载体生物膜中富集了一部分活性污泥中所不具有的微生物, 从而增加了整个系统微生物的多样性.
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(a)污水厂整体; (b)悬浮载体生物膜; (c)活性污泥; 97%相似性, 基于所有OTU分析 图 3 物种组成差异分析 Fig. 3 Microbial composition difference analysis |
通过对不同生境或微生物群落间的物种多样性进行组间比较分析, 探索不同分组样本间群落组成的相似性或差异性.样本比较的层级分析结果和PCoA结果如图 4所示.物种差异聚类中树枝间的长度代表样本间的距离, 长度越短，表明样本间物种组成越相似，而PCoA分析中两样本点越接近, 表明两样本物种组成越相似.可以看出, 同一污水厂的悬浮载体生物膜和活性污泥微生物组成相似性较高, 说明各污水厂进水水质或运行方式对系统微生物群落结构具有一定的选择性.
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Biofilm表示悬浮载体生物膜, Sludge表示同系统内活性污泥, 下同 图 4 样本微生物差异性分析 Fig. 4 Sample difference analysis |
物种组成主要从门、纲和属水平进行分析, 门水平物种组成如图 5(a)所示.从污水厂间看, 各污水厂相对丰度较高的优势物种分属于Proteobacteria(变形菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)和Nitrospirae(硝化螺旋菌门)等, 与其他研究中关于活性污泥中门水平微生物组成较为一致[3].其中, 变形菌门在本研究样本中相对丰度为9.73% ~48.64%, 为最明显的优势菌门.其他主要菌门如绿弯菌门、放线菌门、拟杆菌门和硝化螺旋菌门占比分别为7.87% ~40.03%、2.13% ~41.07%、0.94% ~24.82%和0.25% ~30.38%.
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(a)物种分布柱状图; (b)物种组成Heatmap图 图 5 物种组成分析(门水平) Fig. 5 Microbial composition analysis(phylum level) |
从微生物存在形式看, 放线菌门和硝化螺旋菌门在各污水厂悬浮载体生物膜和活性污泥中分布差异明显, 其中, 放线菌门在除B污水厂外的其他污水厂中均显示出活性污泥中的相对丰度(5.85% ~41.07%)高于悬浮载体生物膜(2.13% ~25.87%), 另外, 作为硝化细菌的重要组成, 硝化螺旋菌门在各污水厂悬浮载体生物膜中相对丰度可达7.41% ~30.38%, 而在活性污泥中其相对丰度仅为0.25% ~3.06%.其他菌门在微生物存在形式上则不具有明显规律.
在不同微生物门水平聚类上, 由图 5(b)可知, 相对丰度较高的绿弯菌门和放线菌门聚类于同一分支, 其在不同污水厂不同样品中相对丰度变化趋势一致, 暗示该两类菌门可能具有互利共生关系.其中, 绿弯菌门部分菌属在功能上多与生物除磷有关[10].在活性污泥中, 其通常存在于菌胶团絮状体内部, 并以絮体骨架的形式存在, 这为好氧颗粒污泥的结构提供了骨架支撑[11], 对于具有一定刚性的悬浮载体生物膜, 其骨架形成机制与颗粒污泥具有一定相似性, 因此绿弯菌门的作用可能也与此有关.而放线菌门除少数自养型菌种如自养链霉菌属(Autotrophic streptomyces)外, 绝大多数为异养型, 氮素营养方面, 多以蛋白质及某些氨基酸最适, 硝酸盐、铵盐次之.在本研究中, 除B污水厂外, 该菌门在其他污水厂活性污泥中的相对丰度均高于悬浮载体生物膜, 分析原因为在MBBR泥膜复合系统中, 悬浮载体由于固定于好氧池, 未随活性污泥循环于厌氧-缺氧-好氧的交替环境中, 因此, 悬浮载体生物膜富集的微生物多为世代周期较长的自养菌为主, 而放线菌门多为异养细菌, 世代周期短, 适合在泥龄相对短的活性污泥体系中富集.另外, 放线菌门在D污水厂相对丰度明显高于其他污水厂的原因可能与该污水厂进水中所含的医疗废水有关.放线菌由于大多可以分泌抗生素而被广泛应用于生物医药行业中[12].而关于绿弯菌门和放线菌门之间的互利共生关系还需进一步研究.
纲水平物种组成由图 6(a)所示, 从污水厂之间看, 各污水厂相对丰度较高的微生物分属于α-Proteobacteria(α-变形菌纲)、Actinobacteria(放线菌纲)、γ-Proteobacteria(γ-变形菌纲)、Anaerolineae(厌氧绳菌纲)、Nitrospira(硝化螺旋菌纲)和Bacteroidia(拟杆菌纲)等, 其相对丰度分别为6.80% ~30.62%、2.13% ~41.07%、1.26% ~22.57%、0.63% ~34.56%、0.25% ~30.38%和0.01% ~30.32%.从微生物存在形式看, 硝化螺旋菌纲在各污水厂悬浮载体生物膜中相对丰度(7.41% ~30.38%)较同系统活性污泥中更高(0.25% ~3.07%), 其他菌纲在微生物存在形式上则不具有明显规律.
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(a)物种分布柱状图; (b)物种组成Heatmap图 图 6 物种组成分析(纲水平) Fig. 6 Microbial composition analysis(class level) |
在不同微生物纲水平聚类上, 由图 6(b)可知, 厌氧绳菌纲和放线菌纲在不同污水厂不同样品中相对丰度变化趋势一致, 其均为厌氧条件下生长的微生物, 可能存在互利共生关系.硝化螺旋菌纲和热微菌纲(Thermomicrobia)在不同污水厂不同样品中相对丰度变化趋势一致, 当前对于热微菌纲研究较少, 该两种菌纲是否存在互利共生关系还需进一步研究.
属水平物种组成如图 7所示, 从污水厂之间看, 相对丰度较高的菌属主要有Nitrospira(硝化螺旋菌)、Mycobacterium(分枝杆菌)、Defluviicoccus和Hyphomicrobium(生丝微菌)等, 其相对丰度分别可达0.24% ~30.38%、0.01% ~33.06%、0.01% ~22.82%和0.11% ~6.61%.
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图 7 物种组成分析(属水平) Fig. 7 Microbial composition analysis(genus level) |
Nitrospira作为Nitrospira (硝化螺旋菌纲)下的硝化细菌, 属于常见的亚硝酸盐氧化菌(NOB). 2015年, Nitrospira部分菌种作为全程氨氧化细菌(Comammox)被陆续发现[13], 并证实了其具有全程氨氧化能力[14], 该结论也打破了持续一个多世纪的被人们广泛接受的两步硝化理论.该菌属携带负责氨氧化的AMO(氨单加氧酶)和HAO(羟胺氧化还原酶), 同时还携带亚硝酸盐氧化必需的NXR(亚硝氧化酶), 可同时将NH4+-N氧化至NO3--N, 相比其他硝化细菌, 该菌属对基质的亲和力更大, 在氨氮浓度较低的环境中更具优势[15].本研究结果显示, Nitrospira相对丰度在各污水厂附着态的悬浮载体生物膜中较悬浮态活性污泥中明显升高, 且系统中其他AOB及NOB菌属相对丰度较低, 可见系统的硝化效果主要由Nitrospira作为全程硝化细菌所提供.尹子华[16]在宜兴市污水厂活性污泥硝化系统检测到AOB和NOB的数量相当, Nitrosomonas(亚硝化单胞菌)和Nitrosococcus(亚硝化球菌)为系统AOB的优势菌属, Nitrobacter(硝化杆菌)和Nitrospira 为系统NOB的优势菌属, 分析MBBR泥膜复合系统硝化菌组成与活性污泥系统差异的原因, 主要是由于各污水厂好氧池均为泥膜复合形式, 在悬浮载体投加区域属于完全混合式, 出水基质浓度与系统内基质浓度相近, 都处于较低的水平(出水标准较高), 而Nitrospira由于对基质亲和力较强, 更容易富集, 由此也可进一步推论, Nitrospira也可作为MBBR泥膜复合系统出水基质较低系统的指示微生物.
Mycobacterium是一类无芽孢、不运动、细胞呈分枝并具抗酸性的杆菌, 部分具有致病性或可产生抗生素, 其能够抵抗并分解污水中的多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs), 该菌属在D污水厂中相对丰度最高, 悬浮载体生物膜和活性污泥的相对丰度分别达到24.00%和33.06%, 而在其他污水厂中相对丰度极其微量, 可能是由于该污水厂进水掺杂部分医疗废水所导致.Mycobacterium作为致病菌而广泛存在于医疗废水中, 其中部分菌属可分泌抗生素杀灭其他微生物, 因此, 该污水厂中Mycobacterium作为优势菌属占有极高相对丰度.Defluviicoccus部分菌属为聚糖菌, 在乙酸为基质、除磷效果恶化的系统中较为常见[17], 该菌属在E污水厂中相对丰度较高, 尤其在活性污泥中相对丰度高达22.82%, 暗示了该污水厂除磷效果不容乐观, 而实际运行数据也显示该污水厂生物除磷效果较差, 化学除磷投药量偏高.Hyphomicrobium可利用有毒难降解有机物进行反硝化脱氮[18], 该菌属具有多种代谢能力, 例如降解二氯甲烷、甲胺磷、二甲基硫醚和甲醇等, 为污水处理厂中较为常见的反硝化菌群之一, 该菌属同样可参与PAHs污染水体中菲的降解[19].其在B污水厂活性污泥中相对丰度为6.61%, 而在其他污水厂中该菌属所占相对丰度较低, 分析可能和研究期间进水成分有关, 怀疑有含毒性工业废水掺入.其他菌属在微生物存在形式上则不具有明显规律.
功能微生物组成如图 8所示, 各污水厂主要由NOB及DNB(反硝化菌群)组成, AOB占比均较少, 相对丰度仅为0.02% ~1.80%, 优势菌为Nitrosomonas, 该结果与Liu等[20]在SND系统中观察到的AOB种类及相对丰度均较为一致.系统中的硝化菌主要为NOB, 优势菌属为Nitrospira, 活性污泥中相对丰度0.25% ~3.06%, 而在悬浮载体生物膜中其相对丰度高达7.41% ~30.38%, 同一系统中悬浮载体生物膜对硝化菌的富集能力是活性污泥的9.9~33.61倍, 说明系统中悬浮载体的投加高度强化了硝化菌的富集.活性污泥经过系统富集后其DNB相对丰度达到2.86% ~12.87%, 值得注意的是, 固定于好氧池内的悬浮载体生物膜中也检测到一定的DNB相对丰度, 范围在6.28% ~10.14%, 这预示着好氧区可能存在TN去除现象.
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图 8 功能微生物相对丰度分析 Fig. 8 Relative abundance analysis of functional microorganisms |
系统好氧池“镶嵌”MBBR工艺后, 形成的MBBR泥膜复合硝化系统使悬浮载体固定于好氧池, 随着运行时间的延长, 其表面生长出悬浮载体生物膜, 从而对硝化菌等好氧细菌形成专性培养, 使其在悬浮载体生物膜中大量富集.而系统中的活性污泥运行状态未发生改变, 随着回流进行, 在缺氧反硝化阶段, 活性污泥中的硝化菌处于活性抑制阶段, 随着系统推流, 当混合液进入好氧区前端, 污泥中的硝化菌活性开始恢复但仍无法发挥最大活性, 仅仅在好氧后段待其活性完全恢复后才开始发挥硝化效果(图 9), 因此, 悬浮载体的投加可在一定程度上高效富集硝化菌.另外, 悬浮载体生物膜在应对低温时可表现出较活性污泥更强的硝化性能, 分析原因为以下4点, 首先, 悬浮载体生物膜高效富集硝化菌, 这是悬浮载体生物膜抗低温效果更好的原因之一, 其次, 悬浮载体单元可富集培养大量耐寒微生物, 形成细菌-原生动物-后生动物的生物链, 加强低温下硝化性能, 使其出水水质良好[21].再次, MBBR泥膜复合硝化系统中投加的悬浮载体, 其材质选用聚乙烯材质, 在低温工况下, 可为微生物的富集提供保温效果, 使其在系统温度降低时仍具有较强的硝化性能[22], 而低温条件下活性污泥絮凝效果变差, 絮体松散, 易发生污泥膨胀现象[23, 24], 污泥膨胀后散热较好, 对内部微生物的保温性能下降, 进而导致其硝化性能降低.最后, 硝化反应本身为放热反应[25], 若发生于活性污泥中, 受限于活性污泥的絮状形态散热较快, 而生物膜相对污泥絮体可分泌较多的EPS[26], 从而形成保护层, 不易散热, 使生物膜内部具有相对较高的温度及硝化活性.因此, “镶嵌”MBBR的泥膜复合硝化系统在低温时硝化效果仍能得到保证.
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图 9 市政污水处理厂硝化菌存在方式 Fig. 9 Existing mode of nitrifying bacteria in WWTP |
为进一步验证功能菌群组成和系统实际运行效果的关系, 对不同污水厂生化池好氧段进行了实际硝化效果测定, 各污水厂好氧段进出水情况如图 10所示.好氧池进水由于受内外回流比稀释后污染物浓度均有所降低, 各污水厂在不同的进水NH4+-N浓度条件下, 出水氨氮均可稳定低于2.0mg ·L-1, 说明好氧池硝化效果良好.值得注意的是, 各污水厂好氧段均出现了TN去除现象, 去除量在1.2~2.4 mg ·L-1左右, 对应总氮去除率(2.51±1.71)% ~(22.97±6.13)%, 好氧区的TN去除现象预示着好氧区存在稳定的SND过程.
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图 10 各污水厂好氧段进出水氮素变化 Fig. 10 Nitrogen change in influent and effluent of aerobic tank of each wastewater treatment plant |
进一步, 分别取各污水厂悬浮载体生物膜和活性污泥分别进行了硝化小试研究, 控制条件如表 2所示, 结果如图 11所示.A、B和E污水厂中, 对应的悬浮载体生物膜硝化负荷(ARLv)均高于同系统内的活性污泥, 其中, 污泥系统硝化负荷(0.076±0.002 6)~(0.11±0.008 6)kg ·(m3 ·d)-1, 而同条件下悬浮载体生物膜硝化负荷则高达(0.11±0.01)~(0.15±0.015)kg ·(m3 ·d)-1, 这与样品优势物种及功能微生物组成分析结果相对应, 即悬浮载体生物膜高效富集硝化菌, 从而具有很高的硝化负荷.分析C、D污水厂结果出现差异的原因, C污水厂冬季排泥受阻, 导致系统内污泥浓度高达9mg ·L-1, 污泥浓度的升高导致了较高的硝化负荷; 而D污水厂悬浮载体填充比过低(11%), 且受限于进水基质较低而悬浮载体生物膜传质效果较活性污泥差, 基质较低条件下其传质受限，进而导致其负荷低于活性污泥.
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图 11 硝化小试实验结果 Fig. 11 Results of nitrification experiment |
另外, 图 11显示, 各污水厂纯膜系统均出现了明显的TN去除, TN去除率达到(10.99±1.04)% ~(14.60±1.14)%, 这与悬浮载体生物膜中具有一定相对丰度的反硝化菌群相对应.悬浮载体生物膜中反硝化菌群的存在为SND现象的发生奠定了微观基础.本研究中各污水厂好氧段均为MBBR泥膜复合系统, 既存在悬浮态的活性污泥, 又存在附着态的悬浮载体生物膜.由于好氧池内DO多为2~3mg ·L-1, 对于活性污泥难以达到缺氧环境, 所以难以发生SND现象, 这也是各污水厂活性污泥系统的TN去除并不显著的原因.普通污水厂活性污泥系统发生SND现象的报道较为少见, 而MBBR系统在好氧区发生SND现象的报道却较多, 吴迪等[27]在研究北方某污水厂Bardenpho-MBBR改造运行时发现有27.4%的总氮在好氧段被去除, SND效果较好.Iannacone等[28]对比了不同形式MBBR硝化系统的总氮去除效果, 结果显示MBBR系统中均出现了SND现象, 总氮去除效果主要与系统内的C/N及DO水平有关.如图 12所示, 悬浮载体生物膜存在传质梯度, 可形成局部的缺氧/好氧微环境, 进而实现SND过程.微生物在悬浮载体上形成的悬浮载体生物膜随着溶解氧渗透能力的弱化出现了功能菌分置现象, 其中, 悬浮载体生物膜外层形成以硝化细菌为主的好氧生物膜, 而内层存在厌缺氧微环境, 会富集反硝化菌, 反硝化菌可直接利用硝化生成的硝态氮和系统中剩余有机碳源或悬浮载体生物膜中内碳源进行反硝化作用, 在提升碳源利用率的同时也强化了TN的去除, 这也是好氧段之所以存在SND现象的关键原因.
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图 12 悬浮载体生物膜中微生物分布方式 Fig. 12 Distribution pattern of microorganisms on the biofilm of suspended carrier |
为进一步验证悬浮载体和活性污泥对系统硝化效果的贡献率, 分别测定悬浮载体生物膜及活性污泥中生物量(VSS), 以微生物分析得出的硝化细菌相对丰度与VSS乘积核算各污水厂悬浮载体生物膜与活性污泥硝化细菌含量, 计算过程见式(2)：
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(2) |
式中, Biomass硝化细菌指硝化细菌含量(mg ·L-1); VSS指悬浮载体生物膜或活性污泥中可挥发性固体(mg ·L-1); R指硝化细菌相对丰度(%).
样品生物量测定结果如表 4所示, 核算悬浮载体中硝化细菌含量占系统中总量的86.12% ~95.36%, 而活性污泥中硝化菌含量仅占3.31% ~13.88%.悬浮载体的投加富集了系统中绝大多数硝化细菌.体现在硝化效果上, 悬浮载体及活性污泥硝化负荷未出现如此明显差异, 可能原因主要在于活性污泥传质传氧效果较好, 同一系统中的悬浮载体生物膜由于传质传氧效果较差在竞争中处于劣势, 因此其富集的硝化细菌未展现出应有效果.
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表 4 各污水厂悬浮载体生物膜与活性污泥硝化菌含量核算 Table 4 Calculation of content of nitrifying bacteria in biofilm and activated sludge of each WWTP |
3 结论
长三角地区稳定达标的MBBR泥膜复合污水处理厂微生物研究显示, 悬浮载体生物膜微生物多样性低于同系统活性污泥, 且物种分布更不均匀.悬浮载体生物膜可富集活性污泥中不具有的物种, 其投加增加了整个系统微生物的多样性, 但同时, 进水水质及运行方式不论对悬浮载体生物膜还是活性污泥优势微生物群落组成, 均具有一定的选择性.在物种组成上, 各污水厂相对丰度较高的菌属主要有Nitrospira(硝化螺旋菌)、Mycobacterium(分枝杆菌)、Defluviicoccus、Hyphomicrobium(生丝微菌)和Macellibacteroides等; 不同污水厂悬浮载体生物膜上硝化细菌相对丰度高达7.41% ~30.38%, 优势菌属为Nitrospira, 而在活性污泥中其相对丰度仅为0.25% ~3.06%, 悬浮载体的投加极大程度上强化了硝化菌的富集; 硝化菌生物量核算显示, 悬浮载体中硝化细菌占系统中总量的86.12% ~95.36%, 但受限于传质传氧效果, 其硝化性能未能完全发挥; 各污水厂好氧区悬浮载体中均检测到一定相对丰度的反硝化菌群, 且沿程及小试结果表明, 好氧区悬浮载体生物膜上发生了显著的SND现象, SND途径去除的TN在10.99% ~14.60%;悬浮载体好氧区投加形成的SND效果, 有利于系统TN去除性能的进一步提高, 且降低了外投碳源量, 实现节能降耗.
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