2020, Vol. 41
2. 西安建筑科技大学环境与市政工程学院, 陕西省环境工程重点实验室, 西安 710055
, WEN Gang1,2
, HUANG Ting-lin1,2 , SI Fan1,2 , WANG Chen-xu1,2 , LU Lin-chao1,2 , LIN Wei1,2
2. Shaanxi Key Laboratory of Environmental Engineering, School of Environmental and Municipal Engineering, Xi'an University of Architecture and Technology, Xi'an 710055, China
随着地下水开采受到限制, 水库逐渐成为大部分城市的主要供水水源[1, 2].然而, 水库水由于水体流动性差和水力停留时间长等特点, 极易在夏秋季周期性暴发蓝藻水华, 导致水质恶化、增加水厂处理难度及供水成本、影响水生生态平衡等问题[3~5].其中, 氮素含量超标(特别是硝氮)是引起水库水体富营养化的关键因素之一, 因此去除水体中过量氮素已成为控制水库水体富营养化的主要手段之一[6, 7].目前, 国内外学者已经对水库水体氮素原位控制技术进行了大量研究[8].其中, 好氧反硝化脱氮技术由于其不受氧浓度的限制、成本低和不产生二次污染等优点, 受到越来越多的关注[9, 10].
好氧反硝化细菌, 以碳源为电子供体, 氧和硝酸盐为电子受体, 在脱氮的同时去除部分有机物, 可以有效控制水源水库因氮素超标而导致的蓝藻暴发问题[11, 12].在反硝化过程中, 碳源不仅是好氧反硝化细菌增值代谢的营养物质, 还为脱氮过程提供能量和电子, 因此碳源是影响好氧反硝化细菌性能的关键因素之一[13, 14].目前对于好氧反硝化脱氮技术中碳源的研究主要集中在人造有机物(如乙酸钠、丁二酸钠和葡萄糖等)方面, 仅有Wen等[15]研究了实际水库中存在的有机物(如天然有机物和藻类有机物)对好氧反硝化细菌的影响.然而, 沉积物在整个水库内源污染物释放和迁移转化过程中扮演着非常重要的角色[16].水源水库在夏秋季热分层期, 由于气温升高引起表层水温上升从而导致水库热分层, 使得表层水体溶解氧向下传质受阻, 底部溶解氧降低呈厌氧状态, 导致沉积物中的有机物大量释放, 继而引发严重的周期性内源污染, 导致水质反复恶化[17, 18].目前, 关于水源水库热分层期沉积物中有机物的相对分子质量分布和荧光特征及其对好氧反硝化细菌脱氮的影响还鲜为人知.因此, 加强好氧反硝化细菌利用水库中沉积物中有机物的研究, 对于水库水体氮污染原位控制工程的应用和丰富好氧反硝化生物脱氮理论具有关键的意义.
本文以水源水库热分层期沉积物中有机物为研究对象, 在分析其相对分子质量分布和有机物特征的基础上, 探究了当沉积物中有机物作为碳源时, 好氧反硝化细菌的脱氮特性、细菌生长及碳去除性能, 并对比了不同类型的实际水体中存在的有机物为碳源时对好氧反硝化细菌脱氮效能的影响, 通过促进好氧反硝化脱氮技术应用于实际微污染水体中, 减少水体中的氮素污染, 以期为实现高效和经济的脱氮提供依据.
1 材料与方法 1.1 研究区域概况及有机物分离 1.1.1 研究区域概况及样品采集黑河金盆水库(108°11′~108°12′E, 34°02′~34°03′N)位于陕西省西安市周至县境内, 是西安市最主要的饮用水源工程.建成于2002年, 总库容2.0亿m3, 平均水深70~100 m[19].金盆水库在夏季(5~8月)会形成稳定的热分层, 热分层期水库底部溶解氧浓度迅速降低, 沉积物释放大量有机物进入上覆水体[20].本研究于2019年5~8月每月中旬在金盆水库主库区(108°11′10.71″E, 34°02′15.59″N)用柱状采泥器采集表层(0~1 cm)沉积物, 24 h内送回实验室进行有机物的提取.取样期间扬水曝气系统6月10日开启, 至6月28日关闭.
1.1.2 沉积物中有机物的提取沉积物中有机物的提取步骤[21]：①将沉积物溶于Milli-Q超纯水中冻融3次(冻/融, -80~37℃, 时间比为30 min :5 min), 冻融后的有机物溶于一定量的超纯水中, 置于室温下释放1~2 h; ②采用超声波细胞粉碎机(JY92-ШD, 新芝生物, 中国)对将冻融后的有机物进行超声处理(功率为650 W, 超声处理15 min, 一个周期包含5 s脉冲、3 s暂停); ③将超声后的样品在9 600 r ·min-1条件下离心10 min(L-550, 湘仪, 中国)和去除上清液后, 通过0.22 μm的无菌滤膜过滤, 滤液即为沉积物中的有机物.
1.2 菌株来源好氧反硝化菌株Acinetobacter johnsonii WGX-9从饮用水水库(104°43′E, 33°42′N)沉积物中分离纯化得到, 具有良好的好氧反硝化脱氮性能[15].低温(-80℃)存储在实验室.
1.3 相对分子质量分级有机物分级采用超滤装置(UFSC05001, Millipore公司, 美国)和相对分子质量为100×103、30×103、10×103、5×103和1×103的超滤膜来分离成不同相对分子质量的部分[15].在分级实验中, 高纯氮气提供0.1 MPa的压力, 样品依次经过100×103、30×103、10×103、5×103和1×103的超滤膜.经过分级后, 将样品分为6个相对分子质量不同的部分, 分别为相对分子质量>100×103、(30~100)×103、(10~30)×103、(5~10)×103、(1~5)×103和<1×103, 然后测定各组分的总有机碳(total organic carbon, TOC)和总氮(total nitrogen, TN)浓度.
1.4 荧光光谱分析采用荧光光谱仪(F-7000, 日立, 日本)测定荧光光谱, 样品测定前首先过0.45 μm的无菌滤膜, 将TOC浓度稀释到5 mg ·L-1, pH调整为7.0.激发波长(Ex)以5 nm间隔从220 nm扫描到420 nm, 发射波长(Em)以2 nm间隔从250 nm扫描到550 nm, 扫描速度为12 000 nm ·min-1, 狭缝为5 nm, 光电倍增管检测电压为500 V.利用Milli-Q超纯水做空白扣除实验, 结合Delaunnay三角形内插值法修正去除拉曼峰散射和瑞利散射[22].
利用MATLAB 2014b软件将样品的荧光矩阵组合, 采用N-way和DOM Fluor工具箱进行平行因子分析, 确定荧光组分数[23].平行因子分析模型解析出的是各组分的相对荧光强度, 各组分的荧光强度Ii按照公式(1)计算：
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(1) |
式中, Scorei代表第i种组分的相对荧光强度; Exi(λmax)和Emi(λmax)分别代表第i种组分激发和发射负载的最大值.
总荧光强度ITot和荧光组分的相对比例Pi计算方程式如下[24]：
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(2) |
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(3) |
根据TOC含量, 制备了以6个不同相对分子质量的沉积物中有机物为碳源的好氧反硝化培养基.将活化的菌株WGX-9的菌液接种至装有150 mL液体培养基的锥形瓶中进行好氧反硝化实验.将锥形瓶在30℃, 130 r ·min-1的恒温振荡培养箱中培养72 h, 分别做3组平行(n=3), 定时测定菌体生长吸光度值(D600)、硝氮(NO3--N)和TOC的浓度.不同月份培养基的初始浓度分别为：5月TOC=27.17 mg ·L-1, NO3--N=15.21 mg ·L-1; 6月TOC=20.89 mg ·L-1, NO3--N=11.84 mg ·L-1; 7月TOC=24.38 mg ·L-1, NO3--N=13.36 mg ·L-1; 8月TOC=26.06 mg ·L-1, NO3--N=11.00 mg ·L-1.
菌株WGX-9好氧反硝化过程中硝氮降解采用一级动力学进行拟合[25]：
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(4) |
式中, [NO3-]t为好氧反硝化过程中t时刻硝氮的浓度; k为速率常数.
1.6 不同类型碳源对好氧反硝化细菌的氮去除特性选取实际水体中存在的不同类型的有机物：天然有机物(腐殖酸和富里酸)、藻类胞内有机物(铜绿微囊藻IOM和小球藻IOM)、藻类胞外有机物(铜绿微囊藻EOM和小球藻EOM)、实际水源水库水体和沉积物中有机物分别作为好氧反硝化培养基的碳源[15].将活化的菌株WGX-9的菌液接种至装有150 mL液体培养基的锥形瓶中进行好氧反硝化实验.将锥形瓶在30℃, 130 r ·min-1的恒温振荡培养箱中培养72 h, 计算好氧反硝化过程的硝氮去除效率及去除速率.
1.7 测定方法采用气相分子吸收光谱仪测定NO3--N和TN的浓度(GMA3376, 上海北裕, 中国).采用紫外分光光度计(UV-2600, UNICO, 中国)测定样品在600 nm的吸光值, 即D600.TOC采用总有机碳测定仪分析(TOC-L, 岛津公司, 日本).
本实验数据采用单因素方差分析方法进行分析(P < 0.05), 采用SPSS 25.0统计软件进行统计分析, 并用Origin Pro 2019软件进行动力学的拟合和绘图.每组实验重复3次(n=3).
2 结果与讨论 2.1 沉积物中有机物的相对分子质量分布沉积物中有机物在热分层期相对分子质量根据TOC和TN所占的比例如图 1所示.图 1(a)可以看出, 热分层期水源水沉积物中有机物的相对分子质量分布(以TOC计算时)主要以相对分子质量>100×103的有机物为主, 其它相对分子质量的有机物所占比例较低.在5、6、7和8月, 相对分子质量>100×103的有机物所占的比例分别为32.53%、36.48%、28.81%和38.27%.且从图 1(a)可知, 6种不同相对分子质量的有机物在5~8月所占比例的分布顺序从高到低均为:>100×103、(10~30)×103、(30~100)×103≈(5~10)×103、(1~5)×103、< 1×103.同时图 1(b)可以观察到, 以TN计算时, 其沉积物中有机物的相对分子质量分布与以TOC计算时显示出相同的变化趋势.根据各组分的TOC和TN所占的百分比, 证明了水源水库中沉积物中相对分子质量>100×103的有机物所占的比例较高, 相对分子质量 < 1×103的有机物所占的比例较低.
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图 1 水库热分层期沉积物中有机物以TOC和TN计算的相对分子质量分布 Fig. 1 Apparent relative molecular mass distributions of organic matter in sediments in TOC and TN during the thermal stratification of reservoirs |
Hua等[26]的研究指出, 将相对分子质量>100×103和(30~100)×103的有机物定义为相对分子质量大的有机物, 将(10~30)×103、(5~10)×103、(1~5)×103和 < 1×103的有机物定义为相对分子质量小的有机物.根据这一结论, 以TOC来看, 从5~8月, 相对分子质量大的有机物所占的比例分别为: 47.63%、50.25%、44.62%和51.63%.以TN来看, 从5~8月, 相对分子质量大的有机物所占的比例分别为: 43.75%、42.29%、40.02%和40.17%.综上所述, 可以看出有机物的相对分子质量分布随时间的变化差异不明显(P>0.05), 但在7月时有机物的相对分子质量分布较为均匀, 显示出较小的相对分子质量, 这可能是由于扬水曝气系统在6月10~28日的运行, 使得沉积物内部生物地球化学作用更加明显[17].
2.2 三维荧光光谱及组分特性通过PARAFAC模型对沉积物中有机物的三维荧光光谱进行解析, 最终解析出3个荧光组分.其中组分C1的最大激发波长在250 nm处, 最大发射波长在425 nm处, 可以归类为陆地类腐殖质[27]; 组分C2有两个明显的最大激发波长(分别在230 nm和280 nm处)和一个最大发射波长(322 nm), 被证实为类色氨酸和氨基酸荧光, 且此类物质的相对分子质量较低[23]; 组分C3由一个最大激发波长(250 nm)和一个最大发射波长(340 nm)所组成, 属于传统微生物类腐殖质的混合物[28]; 此结果与之前的研究结论相一致[29].
热分层期沉积物中有机物各组分的荧光强度变化情况如图 2(a)所示.从中可知, 热分层期沉积物中相对分子质量>100×103有机物的总荧光强度相对高于其它相对分子质量有机物的总荧光强度, 此结果与相对分子质量>100×103的有机物所占的比例最高相一致(图 1).同时组分C2的荧光强度普遍高于组分C1和C3(P < 0.05), 可知沉积物中有机物主要是由类色氨酸和氨基酸类的物质所组成.观察到7月时有机物的荧光强度显著高于其它月(P < 0.05), 这可能是由于水库中扬水曝气系统的运行, 提供良好的好氧及混合条件, 从而导致更复杂的迁移转化、微生物作用等过程, 使得沉积物中的有机物含量明显增加[29].
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(a)荧光强度分布; (b)荧光组分的相对比例 图 2 水库热分层期沉积物中有机物的荧光强度分布及荧光组分的相对比例 Fig. 2 Distribution of fluorescence intensity and relative proportion of fluorescent components in organic matter in sediments during the thermal stratification of reservoirs |
热分层期沉积物中有机物各组分的相对含量如图 2(b)所示.可以看出, 自5~7月以来, 组分C2有机物的相对丰度最高, 分别为53.48%、43.95%和51.08%, 与上述结果相一致.而8月却有一定的下降, 其具体原因可能是由于环境因素的不同引起的.在5月时, 相对分子质量 < 1×103的有机物的组分C2相对丰度为77.98%, 高于相对分子质量>100×103的有机物的组分C2的相对丰度(59.38%)(P < 0.05), 其它月也有相类似的结论.可知, 相对分子质量越小, 组分C2所占的比例越大, 造成这一结果的原因可能是组分C2所代表的类色氨酸和氨基酸物质, 其相对分子质量较小的[23].
结果表明, 水源水库热分层期沉积物中有机物中组分C2(类色氨酸和氨基酸物质)所占比例较高.研究报道类色氨酸一般来源于生物活动, 可知沉积物中有机物的生物活动较为丰富[30].相比于5~8月, 可知7月时沉积物中有机物生物活动最为丰富; 相比于不同相对分子质量, 微生物在相对分子质量<1×103的有机物中其活性高于相对分子质量>100×103的有机物, 与之前所报道的相对分子质量较小的有机物适合微生物的生长相一致[15, 32].
2.3 好氧反硝化细菌的氮去除特性图 3显示了菌株WGX-9以热分层期沉积物中不同相对分子质量的有机物为碳源时硝氮的去除性能.图 3(a)为硝氮的去除性能, 图 3(b)和表 1为硝氮的降解动力学参数(一级动力学模型).如图 3(a)所示, 可以观察到当达到稳定期时, 以热分层期的沉积物有机物(5~8月)为碳源时, 随着相对分子质量的降低, 硝氮的去除效率均显示出增加的趋势(P < 0.05);硝氮的降解动力学常数也有相同的趋势, 在相对分子质量<1×103时达到最大值[图 3(b)和表 1].可见, 相对分子质量小的有机物促进好氧反硝化细菌的氮去除性能, 与之前的研究结果相一致[15].
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(a1)~(d1)：硝氮去除率; (a2)~(d2)：硝氮降解动力学 图 3 菌株WGX-9在水库热分层期沉积物中有机物为碳源时氮去除性能及硝氮降解动力学 Fig. 3 Nitrogen removal performance and nitrate degradation kinetics of strain WGX-9 with organic matter in sediments during the thermal stratification of reservoirs as a carbon source |
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表 1 动力学参数与回归系数的结果 Table 1 Regression results of kinetic parameters and regression coefficients (R2) |
当以5~8月的沉积物中有机物为碳源时, 在反硝化达到稳定时, 硝氮去除效率分别为：48.76%、27.64%、59.03%和39.58%;硝氮的降解动力学常数分别为：0.023、0.010、0.024和0.019 h-1.结果表明当以7月沉积物中有机物为碳源时, 好氧反硝化细菌显示出较好的氮去除性能(P < 0.05).造成这种现象可能是由于7月有机物的相对分子质量分布相对较小且有机物的含量相对较高, 从而促进了好氧反硝化细菌的脱氮特性[33].
以上结果表明, 沉积物中的有机物一定程度上可以促进菌株WGX-9的脱氮特性, 特别是相对分子质量较小且含量较为丰富的有机物, 此结论与之前的研究结果相一致[13, 15].但是, 其硝氮去除效率相比于以乙酸钠为碳源时的硝氮去除效率(86.56%)要低[15], 但仍具有较强的氮去除性能(39.58% ~59.03%), 可见菌株WGX-9有一定的应用潜力来控制水源水库热分层期水质的周期性污染.
2.4 好氧反硝化细菌的增长及碳去除特性菌株WGX-9以热分层期沉积物中不同相对分子质量有机物为碳源时细菌生长特征及碳去除性能如图 4所示.可以看出, 在达到稳定期时, 随着相对分子质量的降低, D600和TOC的去除效率均显示出增加的趋势, 与硝氮去除性能的变化规律相一致.有研究表明, 相对分子质量较小的有机物可以显著促进好氧反硝化细菌的增长及碳去除性能[34], 这与本文的研究结果一致.
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图 4 菌株WGX-9在水库热分层期沉积物中有机物为碳源时菌株生长性能及碳去除性能 Fig. 4 Growth performance and carbon removal performance of strain WGX-9 with organic matter in sediments during the thermal stratification of reservoirs as a carbon source |
同时可以观察到当以热分层期(5~8月)沉积物中有机物为碳源时, 在好氧反硝化反应达到稳定时, D600分别为：0.029、0.023、0.032和0.023; TOC的去除效率分别为：51.01%、29.56%、30.07%和38.48%.D600的变化与硝氮的变化呈现出相同的趋势, 以7月的有机物为碳源时, 细菌增长效果最好(P < 0.05);但TOC的去除效率却显示出不同的变化规律, 当以5月的有机物为碳源时, 好氧反硝化细菌却显示出较好的碳去除性能(P < 0.05).推测原因可能是水库水体中环境因素变化较为复杂, 从而导致沉积物中有机物和微生物的含量有所不同.
热分层期沉积物中有机物为碳源时, D600与TOC的去除效率之间的相关性如图 5所示.高相关系数(R2)进一步证实了TOC的去除除了好氧反硝化过程中作为电子供体的部分外还有菌株WGX-9的同化作用.斜率(k)表示消耗单位质量TOC所产生的生物量, 即TOC与D600的转换效率.相对较高的k值表明细菌同化在好氧反硝化碳去除过程中起着重要的作用.当以7月的有机物为碳源时, k显示出相对其它月的最大值(k=0.000 72, P < 0.05), 表明7月的有机物对于好氧反硝化细菌WGX-9的生长有显著的促进作用.造成这种现象可能是因为7月的有机物在组分C2(类色氨酸和氨基酸物质)显示出较高的含量, 且研究表明, 类色氨酸类的有机物在生物降解过程中, 容易被微生物所利用[35].综上, 菌株WGX-9更倾向于利用7月的有机物来进行增值. 5月的有机物为碳源时, k相对较小(k=0.000 39), 但其TOC去除效率却较高, 推测可能是由于在反硝化过程中, 作为电子供体的碳源所占的比例要高于作为能源物质的比例.
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图 5 沉积物中有机物原液为碳源时TOC去除率和D600的相关性 Fig. 5 Correlation curve between the removal efficiency of TOC and D600with organic matter in sediments during the thermal stratification of reservoirs as a carbon source |
结果表明, 菌株WGX-9的好氧反硝化过程中, 5月有机物显示出较好的作为电子供体的特征, 而7月的有机物却表现出较好的作为能源物质的性能.Jia等[13]在研究好氧反硝化过程中的电子转移途径时发现, 碳源的氧化还原电势及有机物的相对分子质量使得电子向硝酸盐呼吸链的转移存在差异.因此, 沉积物中有机物由于其复杂的结构及含量, 使得其作为好氧反硝化过程的碳源时, 表现出不同的电子转移路径.
2.5 不同类型碳源对好氧反硝化细菌的氮去除特性反硝化作用本质上是碳源作为电子供体的氧化还原过程, 不同类型的碳源对脱氮速率和脱氮动力学有很大的影响.当不同类型(天然有机物、藻类有机物、实际水库源水和沉积物中有机物)有机物为碳源时, 菌株WGX-9的硝氮去除效率、硝氮去除速率和ΔTOC/ΔNO3--N如表 2所示.
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表 2 不同类型有机物对好氧反硝化细菌WGX-9脱氮特性的影响 Table 2 Effects of different types of organic matter on denitrification characteristics of strain WGX-9 |
可以看出, 当藻类有机物及沉积物中的有机物为碳源时, 硝氮的去除效率较高(在29.20% ~59.03%范围内); 硝氮的去除速率也较高, 为0.080~0.289 mg ·(L ·h)-1左右, 明显高于天然有机物和水库源水为碳源时16.50% ~35.20%的硝氮去除效率和0.035 mg ·(L ·h)-1左右的硝氮去除速率.这一现象可以解释为：藻类有机物较好地生物利用性及较低的相对分子质量分布促进了好氧反硝化菌株的脱氮性能[36]; 而沉积物中的有机物由于较为丰富的类蛋白含量, 加速了好氧反硝化菌株的氮去除性能; 对于天然有机物, 较低的氮去除速率可能是由于其组成成分较为单一, 均为微生物难利用的相对分子质量较大的腐殖酸/富里酸物质[37]; 实际水库源水由于较低的碳、氮含量和有机物的含量, 使得好氧反硝化菌株的氮去除性能受到明显的抑制.
有研究报道指出[38], 好氧反硝化过程中, 理论上ΔCOD/ΔNO3--N值为2.86(即ΔTOC/ΔNO3--N=7.60).由表 2可以得出, 当沉积物中有机物为碳源时, ΔTOC/NO3--N较小, 约为1.64~2.48的范围内, 低于已经报道的低温贫营养好氧反硝化菌株HITLi7T(ΔTOC/NO3--N=4.128)[39].当以天然有机物和藻类有机物为碳源时, ΔTOC/NO3--N相对较高, 在9.37~21.34范围内.造成这种现象原因可能是由于菌株WGX-9是从水源水库沉积物中筛分得出, 对水源水及沉积物中有机物有较好的适应性, 可以更好地利用其中的碳源来进行反硝化脱氮.而人工配置的天然有机物和藻类有机物去除相同的氮则需要更多的有机物.
综上, 当沉积物中有机物为好氧反硝化细菌的碳源时, 其氮去除性能高于以水库中存在的其它有机物, 这可能是由于沉积物有机物的含量较为丰富且相对分子质量分布相对较为均匀.因此, 利用沉积物中有机物作为碳源来进行好氧反硝化细菌的培养及驯化, 对于筛分出适应水源水库的高效好氧反硝化细菌有一定的借鉴意义.
3 结论(1) 水源水库在热分层期, 沉积物中相对分子质量>100×103的有机物所占比例较高, 相对分子质量 < 1×103的有机物所占的比例较低; 相比于不同月份有机物的相对分子质量分布, 7月时沉积物中相对分子质量大的有机物所占的比例最低(44.62%), 有机物的相对分子质量分布较为均匀, 显示出较小的相对分子质量.
(2) 运用PARAFAC模型解析出水源水库在热分层期, 沉积物中有机物可分为陆地类腐殖质组分C1(250 nm, 425 nm), 类色氨酸和氨基酸组分C2(230 nm/280 nm, 322 nm)和传统微生物类腐殖质的混合物C3(250 nm, 340 nm), 其中色氨酸和氨基酸类的物质(组分C2)所占比例较高; 同时在7月时显示出较大的总荧光强度.
(3) 菌株WGX-9的好氧反硝化过程中, 5月有机物显示出较好的作为电子供体的特征; 而7月的有机物却表现出较好的作为能源物质的性能, 同时使得好氧反硝化细菌WGX-9显示出较好的氮去除效率.可能是由于扬水曝气系统在6月10~28日的运行, 提供了良好的好氧及混合条件, 从而导致更复杂的微生物作用.
(4) 相比较不同类型的实际水体中的有机物(天然有机物、藻类有机物、水源水库的实际水体), 沉积物中的有机物为碳源时, 可以较好地促进菌株WGX-9的好氧反硝化性能; 硝氮的去除效率较高, 最高可为59.03%;硝氮去除速率最大为0.402 mg ·(L ·h)-1; ΔTOC/ΔNO3--N较小, 在1.64~2.476范围内.
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