2020, Vol. 41
2. 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085;
3. 中国科学院大学资源与环境学院, 北京 100049
, XUE Li-xia1,2 , SUN Bo2,3 , ZHANG Bao1,2 , ZHUANG Xu-liang2,3 , ZHUANG Guo-qiang2,3 , BAI Zhi-hui2,3
2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
3. College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
农业生态系统是大气NH3最重要的人为来源.其中, 施用合成氮肥的农田是NH3排放的主要来源[1, 2].氮(N)肥是世界上使用最广泛的肥料之一, 是土壤-作物系统的主要氮输入源[3, 4].然而, 在作物生产中过度使用氮肥会使其通过地表径流、淋溶、氨(NH3)和一氧化二氮(N2O)气体排放, 造成大量氮肥损失[5].其中, 氨挥发是土壤-作物系统氮损失的主要途径之一[6], 化肥施用造成的氨排放占氨排放总量的53.5%, 是第一大排放源[7, 8].氨挥发带走了大量的氮元素, 导致施用的肥料发挥不了预期的养分效果[9].大部分NH3在大气中存留6 d左右后返回地表, 10%~20%会被氧化成氮氧化合物, 大部分含氮化合物随干湿沉降进入农田、森林、草原、江河和湖泊等, 引起土壤酸化和水体富营养化[10~12].同时, 氨也是大气气溶胶的重要前体物, 可造成严重灰霾污染, 还会破坏甲烷氧化, 使温室效应加剧[13, 14], 给环境带来巨大的影响.因此, 防控农业氨排放具有重要意义.
近年来, 我国农业种植结构不断调整, 蔬菜生产逐渐成为农村经济的支柱性产业之一[15, 16].河北省在全国温室蔬菜生产及产品供应方面占有重要的地位[17].人们往往会通过增加施肥量来提高蔬菜产量, 而过量施肥将会导致土壤环境恶化、肥料利用率降低以及蔬菜品质下降等问题[18, 19].张彦才等[20]的调查结果显示, 在河北省黄瓜生产中, 平均施氮量高达1 269 kg·hm-2, 是当地推荐施氮量的数倍, 这无疑会带来严重的氨挥发损失问题.因此, 提高肥料利用率及防控农业氨排放仍是当前亟待解决的重要问题之一[21].
植物根际促生细菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)在植物生长和病虫害防治中发挥着重要作用[22].以畜禽粪便和农作物秸秆等废弃生物质为原料经无害化处理、腐熟制备成的有机物料可作为良好的载体, 与PGPR复合, 可得绿色高效的生物有机肥.生物有机肥可以促进植物对氮的吸收、磷的增溶和植物激素的分泌[23, 24], 在农业系统中发挥着重要的作用.本研究考察了解淀粉芽孢杆菌生物有机肥(BB)对土壤氨挥发防控及其可能机制, 以期为提高氮素利用率, 改善农业种植环境提供依据.
1 材料与方法 1.1 试验区概况本试验地点位于河北省廊坊市永清县, 地处河北中部, 京、津、保三角地带中心, 北纬38°28′~40°15′、东经116°7′~117°14′之间.试验区域属北温带亚湿润气候区, 大陆性季风气候, 年平均日照2 740 h, 雨热同季, 年平均降雨量540 mm, 年平均气温11.5℃.供试土壤为园区大棚内的碱性土壤.施肥前土壤样品采用5点采样法, 风干过筛2 mm后, 测得其理化性质见表 1所示.
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表 1 土壤理化性质 Table 1 Physical and chemical properties of soil |
1.2 试验设计
在蔬菜大棚内, 采用盆栽试验, 每个花盆中装入菜地土壤15 kg, 从2018年12月下旬开始到2019年2月上旬结束.根据当地一季蔬菜种植所需施肥量, 确定施氮量为0.25g·kg-1, 化肥选用复合肥(N-P2O5-K2O含量均为17%), 生物有机肥和化肥的施用量根据氮含量确定, 保持每个试验组的含氮量相同.生物有机肥含氮量为5.11%, 有效活菌数符合标准NY884-2012.本试验不同处理的肥料作为基肥一次性施入, 施肥方式采用混施, 每盆种植生菜8株.除了肥料种类不同, 各个处理的其他生产管理措施均一致.各处理均采用五点法对土壤样品进行采集, 采集时间为施肥后第一周每天采集1次, 之后2~3 d采集一次, 直至蔬菜收割.本试验设4个处理4个平行, 随机排列. 4个处理分别为：不施肥处理(CK)、100%化肥处理(C)、50%解淀粉芽孢杆菌生物有机肥+50%化肥处理(B1)和100%解淀粉芽孢杆菌生物有机肥处理(B2).
1.3 氨挥发测定如图 1所示, 本试验采用动态箱法测定每日的氨挥发量[25], 该方法适用于田间小区对比研究, 其基本原理是以真空泵作为动力源, 利用空气置换密闭室内的NH3, 挥发出来的NH3随着抽气气流进入吸收瓶中, 以含有甲基红-亚甲基蓝混合指示剂的2%硼酸溶液50mL作为氨吸收液, 最后用标准0.005 mol·L-1的稀硫酸溶液滴定来计算氨挥发量, 待含有甲基红-亚甲基蓝混合指示剂的硼酸吸收液观察不到明显颜色变化时, 试验结束.本试验测定氨挥发采样时间为每天10:00~14:00连续采集4 h.施肥后第一周每天测一次氨挥发, 之后2~3 d测一次, 与土样采集日期一致.
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图 1 氨挥发收集装置示意 Fig. 1 Ammonia volatilization collection device |
土壤氨挥发速率计算公式如下(用0.005 mol·L-1的标准酸滴定硼酸吸收液, 再将滴定消耗的硫酸体积代入公式计算氨挥发量)：
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式中, M为密闭法单个装置每次测得的氨(NH3, mg); A为捕获装置的横截面积(hm2); D为每次连续捕获的时间(d).
1.4 土壤微生物高通量测序分析取氨挥发峰值期间的土壤样品, 利用FastDNA® SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals, USA)提取土壤DNA, 操作步骤按照试剂盒说明手册, 并做简单修改.提取的DNA样品送至北京美吉桑格生物医药科技有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序.基于细菌16S rRNA基因的V3-V4区进行PCR(ABI GeneAmp® 9700型)扩增, 引物序列为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3′).PCR试验采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase, 20μL反应体系.反应参数：①1×(3 minutes at 95℃); ②循环数×(30 seconds at 95℃; 30 seconds at退火温度℃; 45 seconds at 72℃); ③10 minutes at 72℃, 10℃ until halted by user.扩增完成后利用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 并对目标条带进行切胶回收.
1.5 土壤理化性质、蔬菜产量和品质等指标测定方法土壤样品pH值(1:2.5土壤:去除CO2的水)采用实验室pH计(METTLER TOLEDO)测定[26].土壤NH4+-N和NO3--N含量(1:5土壤:1 mol·L-1 KCl溶液)采用连续流动分析仪(BRAN+LUEBBE, AA3, Germany)测定[6].蔬菜收割后, 将各处理的所有生菜用蒸馏水清洗干净, 并吸去表面的水分, 称重测定其产量.蔬菜总氮、硝酸盐和维生素C分别按照国家标准方法测定[27~29].
1.6 数据分析本试验所有数据均由Microsoft Excel 2010及Origin 8(Origin Lab, USA)生成.单因素方差分析采用SPSS分析(Statistical Product and Service Solutions 24.0 Windows, SPSS Inc, Chicago, USA), 若P < 0.05, 则处理组间存在显著性差异.不同施肥处理组间群落组成差异采用偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA).
2 结果与讨论 2.1 解淀粉芽孢杆菌生物有机肥对NH3挥发的影响如图 2所示为各处理的土壤氨挥发速率.在施肥后, 所有处理均快速出现氨挥发, 在升至峰值后开始下降, 直至土壤氨挥发接近对照处理水平.其中, C处理在施肥后快速出现氨挥发, 并急剧上升, 在第5d达到峰值, 为6.93 kg·(hm2·d)-1.B1和B2处理的氨挥发速率分别在施肥后的第6d和第4d达到峰值, 为0.57 kg·(hm2·d)-1和0.96 kg·(hm2·d)-1, 相对于处理C的氨挥发速率峰值分别降低了91.8%和86.1%.CK处理达到氨挥发通量峰值所需的时间也与B2相同, 在施肥后的第4d达到峰值, 为0.87 kg·(hm2·d)-1.
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图 2 不同施肥处理的土壤的氨挥发速率 Fig. 2 Soil ammonia volatilization rate of different fertilization treatments |
氮肥利用率低的一个重要原因就是氨挥发损失, 氨挥发量越大, 则氮肥利用率越低.土壤氨挥发累积量如图 3所示, 在相同施氮量的条件下, 氨挥发总量趋势为：C>B1>B2>CK.其中, CK处理的氨挥发总量为1.67 kg·hm-2, B2处理的氨挥发总量为2.11 kg·hm-2, B1处理的氨挥发总量为2.85 kg·hm-2, C处理的氨挥发总量为13.9 kg·hm-2.相对于C处理, B1和B2处理氨挥发量均有大幅度降低, 其中, B1处理氨挥发总量降低79.5%, B2处理氨挥发总量降低84.8%.
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图 3 不同施肥处理的土壤的氨挥发累积量 Fig. 3 Soil ammonia volatilization accumulation of different fertilization treatments |
每盆生菜在不同施肥处理条件下的产量如图 4所示, 总体趋势为：B2>C>B1>CK.B2处理产量最高为225 g·pot-1, 相对于CK和C处理分别增产50.5%和12.3%, 且差异显著.
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不同小写字母表示处理差异显著，P < 0.05 图 4 不同肥料处理的生菜产量 Fig. 4 Lettuce yield of different fertilization treatments |
人体摄入的硝酸盐大部分来自蔬菜, 过量硝酸盐摄入会在人体内还原成为亚硝酸盐, 对人体健康构成危害[30].蔬菜积累的硝酸盐含量不仅与生物学特性、光照和湿度等有关外, 还与栽培基质中氮营养水平、氮素形态及氮、磷、钾比例和硫营养状况等有关[31, 32].本试验的结果表明, 各试验组收获的生菜中硝酸盐的含量都低于标准限值(≤3 000 mg·kg-1, GB 19338-2003)[33], 食用安全性较高.维生素C含量是蔬菜营养品质的重要指标, 化肥与BB混合施用的生菜维生素C含量最高(表 2).
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表 2 不同肥料处理对生菜品质的影响1) Table 2 Effect of different fertilizer treatments on the quality of lettuce |
2.3 解淀粉芽孢杆菌生物有机肥对土壤理化性质的影响
本试验期间各处理的土壤pH变化如图 5所示, 在施肥后土壤pH均开始逐渐下降, 这与土壤氨挥发速率成正相关, 土壤pH越低, 氨挥发速率越小.试验结束后, 各处理土壤pH均比施肥前低, 这是由于化肥中的成分大多属于酸性肥料(如过磷酸钙、硫酸铵和氯化铵等), 即植物吸收肥料中的养分离子后, 土壤中氢离子增多, 易造成土壤酸化.加之大量的NH4+、K+和土壤胶体吸附的Ca2+、Mg2+等阳离子发生交换, 使土壤结构被破坏, 导致土壤板结、土壤有机质下降, 化肥无法补偿有机质的缺乏, 进一步影响了土壤微生物的生存, 降低了肥效.因此, 长时间且过度施用化肥不仅会导致土壤酸化, 还会引起土壤板结, 肥力下降.本试验期间, CK处理土壤pH较高且相对稳定, 为8.53~8.21.C处理的土壤pH降低最多, 降低了1.10个pH单位.CK处理的土壤pH降低最少, 降低了0.29个pH单位.在作物收获后, CK、C、B1和B2处理的土壤pH分别为8.23、7.60、7.86和8.22.
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图 5 不同肥料处理的土壤pH的变化 Fig. 5 Changes in soil pH of different fertilizer treatments |
硝化过程(nitrification)是指氨在微生物作用下氧化为硝酸的过程[34].在土壤中, 硝化细菌可以将产生的NH4+-N氧化为NO3--N, 这样既可提高氮元素的利用效率, 也会降低土壤的氨挥发.因此, 土壤中NH4+-N的含量是影响氨挥发重要元素之一.图 6为施用不同肥料后的土壤NH4+-N的含量变化, 所有处理土壤NH4+-N含量都是在施肥后0~5 d迅速上升, 且达到峰值, 然后又开始下降, 直至趋于稳定, 这与土壤氨挥发速率成正相关, 土壤样品的NH4+-N含量越高, 氨挥发速率越大.C处理的土壤NH4+-N含量显著高于B1和B2处理(P < 0.05), 表明施用一定比例的BB可有效降低土壤中NH4+-N的积累.
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图 6 不同肥料处理的土壤NH4+-N的变化 Fig. 6 Changes in soil NH4+-N of different fertilizer treatments |
NO3--N在土壤中的含量变化是土壤硝化作用的重要指标之一.图 7为施用不同肥料后土壤NO3--N的含量变化.所有施肥处理土壤NO3--N含量基本都呈现出先迅速上升, 后缓慢升高, 大约在第20 d之后, 逐渐趋于稳定.可见, 施用一定比例的BB可以减少土壤中NO3--N的积累.
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图 7 不同肥料处理土壤NO3--N的变化 Fig. 7 Changes in soil NO3--N of different fertilizer treatments |
在12个土壤样品的细菌群落分析中, 共获得226 392个高质量序列, 均一化后的样品序列在97%的相似水平下将其聚类为不同的OTUs, 共得到3 541个OTUs.
2.4.2 土壤微生物的多样性及丰富度分析如表 3所示, 不同处理土壤细菌16S rRNA基因V3-V4区样本的测序深度指数Coverage均较高, 说明此次测序能够覆盖样本中绝大多数的微生物信息, 可以反映样本的真实情况.Shannon指数和Simpson指数常用于反映群落多样性, 其中Shannon指数数值越大说明样本的多样性就越高, Simpson指数则与之相反.本研究中所有处理样品的Shannon指数均较高且相近, 而Simpson指数均较低且相近, 所以土壤微生物群落多样性均较高, 各处理间无明显变化.ACE和Chao指数一般用来反映群落丰富度, 所有处理ACE和Chao丰富度指数趋势为B1>B2>C>CK, 说明B1处理细菌群落最丰富, CK处理则最稀少.
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表 3 不同处理土壤细菌16S rRNA基因V3-V4区测序深度、多样性及丰富度指数 Table 3 Sequencing depth, diversity, and richness index of V3-V4 region of 16S rRNA gene in different soils |
2.4.3 土壤中微生物群落结构变化分析
如图 8所示, 在门的分类水平上, 不同肥料处理后土壤样品中主要有以下优势微生物, 分别为放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和厚壁菌门(Firmicutes)等.
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图 8 门水平上不同肥料处理土壤样品中主要群落结构组分 Fig. 8 Composition of main community structure components in soil samples treated with different fertilizers at the level of the phylum |
结果表明, 施用化肥和解淀粉芽孢杆菌生物有机肥均使得土壤微生物群落相对丰度发生改变.相对于CK处理, C、B1和B2处理厚壁菌门相对丰度分别提高25.6%、55.4%和73.2%.芽孢杆菌属于厚壁菌门, 作为常见的植物促生菌, 在植物健康生长中发挥了重要作用.因此, 厚壁菌门丰度的增加可能是由于解淀粉芽孢杆菌的定殖引起的.此外, 化肥C处理和解淀粉芽孢杆菌生物有机肥B2处理中参与硝化过程的相关功能微生物硝化螺旋菌门(Nitrospirae)的相对丰度分别为0.84%和1.00%, 这与氨挥发损失呈负相关, 硝化功能微生物丰度越高, 越有利于NH4+-N氧化为NO3--N.可能导致了解淀粉芽孢杆菌生物有机肥处理的氨挥发损失低于常规化肥处理.
如图 9所示, 在属的分类水平上(除不能被准确识别的菌属外), 分别为：Pseudarthrobacter、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、芽球菌属(Blastococcus)、类诺卡氏属(Nocardioides)、芽孢杆菌(Bacillus)和硝化螺菌属(Nitrospira)等.CK处理土样品中, 主要优势菌属占比从高到低分别为：鞘氨醇单胞菌(4.63%)、Pseudarthrobacter(3.23%)、芽球菌属(2.81%)、类诺卡氏属(1.86%)、硝化螺菌属(0.65%)和芽孢杆菌(0.50%).C处理土壤样品中, 主要优势菌属占比从高到低分别为：Pseudarthrobacter(3.99%)、芽球菌属(2.87%)、鞘氨醇单胞菌(2.81%)、类诺卡氏属(2.22%)、硝化螺菌属(0.83%)和芽孢杆菌(0.71%).B1处理土壤样品中, 主要优势菌属占比从高到低分别为：Pseudarthrobacter(6.73%)、鞘氨醇单胞菌(3.50%)、芽球菌属(3.51%)、类诺卡氏属(2.46%)、芽孢杆菌(1.34%)和硝化螺菌属(0.90%).B2处理土壤样品中, 主要优势菌属占比从高到低分别为：鞘氨醇单胞菌(6.24%)、Pseudarthrobacter(3.47%)、芽球菌属(2.76%)、芽孢杆菌(2.32%)、类诺卡氏属(1.58%)和硝化螺菌属(0.99%).结果表明, 相对于C处理, 施用解淀粉芽孢杆菌生物有机肥的B1和B2处理土壤中, 芽孢杆菌分别提高47.0%和69.4%, 有利于作物对养分的吸收利用, 可能是由于解淀粉芽孢杆菌的定殖引起的.具有硝化作用的Nitrospira属相对丰度也有所提升, 从而促进土壤硝化过程, 减少土壤中氨氮的含量, 对土壤氨挥发防控起到积极作用.
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红色框标注了不同肥料处理后土壤样品中主要优势菌属 图 9 属水平上不同肥料处理土壤样品中主要群落结构组分 Fig. 9 Composition of major community structure components in soil samples treated with different fertilizers at the level of the genus |
进一步分析不同施肥处理组间群落组成差异, 如图 10为PLS-DA分析.PLS-DA是多变量数据分析技术中的判别分析法, 经常用来处理分类和判别问题.通过对主成分适当的旋转, PLS-DA可以有效地对组间观察值进行区分.结果表示, B1、B2、C及CK处理组可明显区分并聚成4个类群, 说明不同的施肥策略对土壤微生物群落结构造成了显著的差异.
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图 10 不同施肥处理组间群落组成差异分析 Fig. 10 Analysis of community composition differences between different fertilization treatment groups |
(1) 与施用化肥相比, 在相同施氮量条件下, 施用解淀粉芽孢杆菌生物有机肥, 替代部分或全部化肥, 能够降低农田土壤的氨挥发量70%以上; 同时, 蔬菜硝酸盐含量降低46.6%, 产量增加12.3%.
(2) 解淀粉芽孢杆菌生物有机肥的施用, 提高了土壤细菌群落的多样性及丰富度, 特别是芽孢杆菌、硝化螺菌属相对丰度明显提升, 促进了土壤硝化过程, 从而减少了氨挥发.
致谢: 感谢河北省恒都美业农业科技园区对本研究的支持.樊浩南、王时杰、郑晓旭和徐立娜在试验准备方面的帮助, 刘小珍和张颖颖等在蔬菜田间管理和试验方面提供帮助, 在此一并致谢！
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