2020, Vol. 41
好氧颗粒污泥(aerobic granular sludge, AGS)是微生物自聚集的产物, 由于其所需反应器小、生物量高和沉降性能好, 并具有较好的抗冲击负荷和抗毒能力[1], 成为近年来研究热点.然而, 目前好氧颗粒污泥系统长期运行过程中颗粒污泥失稳问题, 给该技术的实际运行造成了极大困扰, 大大限制了该技术的广泛应用[2, 3].AGS的稳定性可定义为, 好氧颗粒活性和粒度分布在长期运行过程中保持相对稳定, 不会发生颗粒破碎和从反应器中冲出的情况[4].大量研究结果表明, 影响好氧颗粒污泥稳定性的主要因素包括有机负荷率(organic load rate, OLR)、污泥负荷(food-to-microorganism, F/M)、溶解氧(DO)、基质类型、碳氮比(carbon-nitrogen ratio, C/N)、温度和水力剪切力等[5~7].这些因素不仅会影响颗粒污泥的宏观特性, 即颗粒形态、尺寸、沉降性能和污泥浓度, 还会影响颗粒内部微生物数量、分布和代谢活动, 进而影响污泥系统长期稳定性.然而, 好氧颗粒污泥失稳的确切原因目前还未有定论.
在废水生物脱氮处理系统中, 适宜的C/N有助于维持好氧颗粒污泥的长期稳定[8].进水C/N会影响微生物选择压以增加异养菌或自养菌的数量, 进而影响颗粒的形成[9], 同时影响颗粒的处理性能.有研究表明[10~12], 过高的C/N(大于20)会导致好氧颗粒污泥颗粒化程度差和沉降性能低; 而相对低的C/N(小于8)有利于富集慢速生长的硝化菌, 增强颗粒稳定性.然而, 低C/N废水中过高的游离氨浓度会对好氧微生物的活性和硝化细菌的生长产生抑制作用[13, 14], 进而降低系统硝化和脱氮功能.有研究发现, 过低的C/N(小于4)会导致颗粒污泥的微观结构和微生物群落破坏, 颗粒污泥失稳解体, 最终导致系统崩溃失败[15, 16].在中国许多地方, 实际废水的C/N往往低于4[17].过低的C/N会导致过高的氨氮浓度, 使得好氧颗粒污泥系统中氨氮很难完全去除.另外, 由于系统含碳量低, 在通过异养反硝化来实现的系统总氮去除过程中, 如不外加碳源, 则总氮去除效率低[18]; 而外加碳源, 又会大大增加运行成本.因此, 好氧颗粒污泥低C/N废水处理系统中的C/N运行条件确定, 对于保证系统污染物去除效率和长期运行稳定性具有重要意义.
目前, 针对好氧颗粒污泥系统低C/N条件确定的研究已有一些报道.Luo等[15]的研究结果表明, C/N为4条件下好氧颗粒污泥系统能够稳定运行, 而C/N为2和1条件下好氧颗粒污泥稳定性大大降低, 颗粒破碎并最终冲出系统; Wei等[19]的研究结果表明, 好氧颗粒污泥在系统C/N由3.32提升至7.24的过程中逐步稳定; Zhang等[20]的研究结果也表明, C/N为5时能够形成稳定的好氧颗粒污泥.然而, 目前的这些低C/N好氧颗粒污泥系统研究, 大部分建立在中短期实验基础上.低C/N条件下好氧颗粒污泥系统的长期运行稳定性, 还有待进一步研究.
本实验在人工配置的低C/N废水中接种在4℃存储30d的好氧颗粒污泥, 考察其活性恢复情况.在此基础之上, 在不同低C/N(2和4)条件及冲击负荷条件下研究好氧颗粒污泥系统的污染物去除效率、颗粒微生物种群变化及稳定性, 以期为好氧颗粒污泥系统对低C/N废水处理性能及长期运行稳定性研究奠定理论和实践基础.
1 材料与方法 1.1 实验装置、运行方式和运行阶段本实验采用两个圆柱形有机玻璃SBR反应器(A和B), 内径4.0 cm, 高径比35, 有效容积1.7 L.反应器从上部进水、中部出水, 换水比50%.反应周期由时间继电器控制, 每天共运行6个周期, 每周期4 h, 其中进水5 min, 缺氧55 min, 好氧170 min, 沉淀5 min, 排水5 min.为了使反应器内泥水充分混合, 在进水5 min结束后, 由电磁式空气泵进行1 min的预曝气.缺氧段溶解氧(dissolved oxygen, DO)一般维持在0.5mg·L-1以下; 好氧段曝气时的反应器调节转子流量计气速为2.5L·min-1, 使其表面气流速度约为3.3 cm·s-1, DO在反应周期末能维持在5mg·L-1以上.实验过程在室温下运行.本实验运行条件如表 1所示.
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表 1 反应器A和B的运行条件 Table 1 Operation conditions in reactors A and B |
在活性恢复和稳定阶段, 分别将A、B反应器的碳氮比一直维持在2和4, 进行横向对比; 之后在冲击负荷阶段, 将A、B反应器的碳氮比均维持在2, 进行纵向对比.
1.2 接种污泥与实验用水接种污泥取自4℃保存30 d的好氧颗粒污泥.其中, A、B反应器分别接种在低碳氮比废水中培养的好氧颗粒污泥, A反应器污泥浓度为2.57g·L-1, 污泥容积指数为100 mL·g-1, 外形规则, 粒径较大, 呈黄褐色; B反应器污泥浓度为3g·L-1, 污泥容积指数为84 mL·g-1, 颗粒中有大量的细小颗粒, 呈黄色.
由人工配置实验进水.以CH3COONa为碳源, (NH4)2SO4·5H2O为氮源, 其它相关营养元素包括(mg·L-1):KH2PO4(22.5), CaCl2(12.5), MgSO4·7H2O(15), FeSO4·7H2O(10), MnCl2·4H2O(0.12), ZnSO4·7H2O(0.12), (NH4)6Mo7O24(0.05), CuSO4·5H2O(0.03), NiCl2·6H2O(0.1), CoCl2·6H2O(0.1), AlCl3·6H2O(0.05)和H3BO3(0.05).另用碳酸氢钠调节进水pH值, 使进水pH始终保持在7.5~8.5之间.
1.3 分析项目及方法根据标准方法[21]进行监测进出水的COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N及系统内的混合液悬浮固体浓度(mixed liquor suspended solids, MLSS)和污泥容积指数(sludge volume index, SVI30); DO和pH值及温度等用雷磁多参数水质分析仪分析.
1.4 微生物群落分析在A、B两反应器的阶段Ⅲ运行过程中, 收集样品.采用CTAB或SDS方法对样品的基因组DNA提取、无菌水稀释, 并以稀释后的基因组DNA为模板, 使用带Barcode的特异引物, New England Biolabs公司的Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR, 引物对应区域为16S V4区引物(515F和806R).所形成的PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测.最后, 使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建, 构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量, 文库合格后, 使用HiSeq2500 PE250进行上机测序.利用Uparse软件对所有样品的全部Effective Tags进行聚类, 默认以97%的一致性(identity)将序列聚类成为OTUs(operational taxonomic units), 同时会选取OTUs的代表性序列, 依据其算法原则, 筛选的是OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列.对OTUs代表序列进行物种注释, 用Mothur方法与SILVA的SSUrRNA数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8~1), 获得分类学信息并分别在各个分类水平:Kingdom(界)、Phylum(门)、Class(纲), Order(目)、Family(科)、Genus(属)和Species(种)统计各样本的群落组成.使用Qiime软件(VersionF1.7.0)计算Observed-species、Chaol、Shannon、Simpson、ACE和Goods-coverage指数, 以及Unifrac距离和构建UPGMA样品聚类树.另采用LEfSe软件进行群落结构差异分析.
2 结果与讨论 2.1 好氧颗粒污泥的物理特性在180 d左右的运行期内, A和B两反应器在不同的碳氮浓度和比值条件下运行.图 1所示为颗粒污泥在两反应器恢复期、稳定期和冲击负荷期间的SVI30、MLSS变化.在接种恢复期的25 d中, 两个反应器内SVI30都呈先上升后下降的趋势.A反应器SVI30在第16 d时达到最大值125 mL·g-1, 而后迅速下降至80 mL·g-1; B反应器在第11 d时, 达到最大值118 mL·g-1, 然后迅速下降, 在第26 d时降至57 mL·g-1.在此恢复过程中, B反应器系统首先排出储存过程中解体的颗粒残骸, 沉降性能良好的微生物被保留下来, 从而使得SVI30逐渐下降.在之后的稳定阶段及冲击负荷阶段下, 系统的沉降性能仍趋于稳定.其中A反应器保持在60 mL·g-1左右, 而B反应器则保持在75 mL·g-1左右.由此可见, 在此实验所有运行条件下, 碳氮浓度和比值变化对整个运行期颗粒污泥系统的沉降性能影响不大.而A、B反应器在接种恢复期MLSS呈现相反的变化趋势.其中A反应器的MLSS先上升, 在第16 d达到最大值9.3g·L-1, 而后迅速下降, 基本稳定在5g·L-1; 而B则是先下降, 在第11 d时降至整个实验过程最小值1.73g·L-1, 而后迅速上升, 平均维持在3.7g·L-1.在活性恢复阶段, 由于A反应器中存在大量丝状菌, 微生物量大量增加, 导致颗粒沉降性能逐步变差, 大量微生物随着排水排出, 生物量也逐渐降低; B反应器中丝状菌数量少, 随着MLSS的降低, 不利于颗粒化的微生物被淘汰, 快速沉降的微生物开始迅速生长, 使得B的生物量开始增加.在稳定阶段及冲击负荷阶段下, 系统的MLSS相对稳定在一定范围内.由此可见, 在本实验所有运行条件下, 碳氮浓度和比值变化对系统的污泥浓度影响也不大.
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图 1 运行期间A、B反应器的SVI和MLSS变化 Fig. 1 Variations in SVI and MLSS during operation in reactors A and B |
图 2所示为不同阶段的好氧颗粒污泥COD、氨氮和硝态氮进出水浓度变化情况.在初始的25 d活性恢复期, 由于进水COD较低, 两反应器好氧颗粒污泥均表现出较强的COD去除能力, COD去除率均达90%以上.将A和B对比可知, B反应器的脱碳恢复能力明显快于A反应器.由于A反应器氨氮浓度相对高, 颗粒污泥适应环境所需的时间相对长, 系统氨氮去除效率波动较大.在第6 d时, 其氨氮去除率仅为62.6%.而B反应器一直维持较好的硝化效果, 氨氮去除率均在90%以上.同时B反应器几乎未出现NO2--N积累, 说明B反应器中亚硝酸盐氧化菌(nitrite oxidizing bacteria, NOB)处于快速生长期.以上结果表明, 在系统启动初期, C/N为4的B反应器除碳和硝化性能恢复更快, 恢复效果更好.
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图 2 运行期间A、B反应器的COD、氨氮和硝态氮浓度变化 Fig. 2 Variation in the concentration of COD, ammonia nitrogen, and nitrate nitrogen during operation in reactors A and B |
在其后的稳定阶段, 即A反应器COD和NH4+-N浓度由300:150增加到400:200, B反应器在400:100稳定运行时, C/N较高的B反应器COD去除率更高, 基本维持在90%以上; 而C/N较低的A反应器中COD去除率波动较大, 且随着负荷的增加有所下降, 但仍能保持在70%以上.这可能是因为此阶段A反应器累积一定的NO2--N浓度, 使部分异养微生物受到游离亚硝酸(free nitrite, FNA)抑制, 进而造成COD去处率下降.对于系统氨氮去除效果, B反应器一直维持在近100%水平; 而A反应器在该阶段初始时期有些波动, 随着氨氧化细菌(ammonia oxidizing bacteria, AOB)逐步适应环境而趋于稳定, 去除率接近100%.此阶段, B反应器中NO3--N浓度一直维持较高水平, 且NO2--N几乎为零, 表明该系统实现了完全硝化; 而A反应器NO2--N浓度一直维持较高水平, 表明硝化不完全.这说明A反应器中150mg·L-1和200mg·L-1的NH4+-N浓度已对NOB产生一定抑制作用.稳定阶段的实验结果表明, C/N为2的A反应器已经受到较高氨氮浓度的抑制影响, COD去除率下降, 硝化过程不完全; C/N为4的B反应器明显具有更稳定脱碳硝化能力.
在后期的冲击负荷阶段, A反应器的COD和NH4+-N浓度升至800:400, 脱碳能力稍有升高, 但硝化效率迅速下降.可能是在此过程中A反应器中的异养菌经过前一阶段抑制环境条件的适应后, 具备了较好的抗抑制能力, 因此在该阶段维持了较稳定的脱碳能力; 而系统过高的氨氮浓度产生大量游离氨(free ammonia, FA), 严重抑制了系统AOB和NOB的活性, 从而导致系统氨氮出水浓度急剧升高, 硝化效果明显下降.而B反应器系统在此阶段的脱碳能力降低, COD去除率降至80%.这可能是B反应器中异养菌也受到高氨氮浓度的抑制影响, 同时适应能力不如此时A反应器中的微生物, 导致碳去除率有所下降.B反应器氨氮去除也出现短暂波动, 随后逐渐趋于稳定, 最后维持在90%左右.但由于系统氨氮浓度过高, 系统硝化过程为短程硝化, 未实现完全硝化.以上现象表明, B反应器中300mg·L-1的进水氨氮浓度虽然对该系统有一定影响, 但仍在微生物可承受范围内, 因此系统依然能够稳定运行; 而A反应器中400mg·L-1的进水氨氮浓度对系统硝化菌造成严重抑制, 从而导致系统氨氮去除能力大大降低, 硝化效果急剧恶化.
总体上, C/N为2的条件下, 颗粒污泥会受到高浓度氨氮产生的抑制作用, 系统脱碳和硝化性能都会降低, 很难应付冲击负荷造成的压力; 而C/N为4的条件下, 好氧颗粒污泥受到氨氮抑制作用相对较小, 系统脱碳能力和硝化性能受到的负面影响有限.在冲击负荷条件下, C/N为4的好氧颗粒污泥具备更强的抗冲击能力.因此, 相对C/N为2的好氧颗粒污泥系统, C/N为4条件下的好氧颗粒污泥处理系统具有更好的处理性能, 更强的稳定性.
图 3为A、B反应器的好氧颗粒污泥周期变化, 系统运行初始60min为缺氧段, 之后为好氧段.在缺氧段中A、B反应器的COD浓度均迅速下降, 去除率分别达到96.4%和91.4%, 说明异养菌活性较强.此时, 碳源主要提供微生物生长所需能量, 几乎没有碳源残留到好氧段, 说明缺氧段的设置导致系统大部分碳源被慢速生长微生物利用, 从而保障了颗粒的长期稳定性[22]. A反应器在其后好氧段COD含量增加, 可能是因为部分微生物受到不利因素影响破碎导致产生慢速可生物降解的COD(SBCOD)或者是不可溶/不可生物降解有机物(内源残渣).在好氧段, A、B反应器氨氮浓度持续下降直至反应结束, 去除率分别为73%和85%. AOB和NOB将氨氮和NO2--N转化为NO3--N, 到反应结束时NO3--N浓度分别达到最高值60.1mg·L-1和65.2mg·L-1.但A反应器有较高的氨氮和亚硝酸盐累积, 说明该系统氨氮去除能力达到饱和, 硝化过程受到不利条件(如FA和FNA浓度)的影响.
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图 3 运行期间A、B反应器内污染物浓度变化 Fig. 3 Variation in pollutant concentration during operation in reactors A and B |
第Ⅲ阶段所取颗粒污泥微生物群落的比较如表 2所示, 从中可知A反应器中污泥微生物群落的OTUs、Chao指数和ACE指数相对更低, 即微生物丰富度更低.这表明, 在相同的碳浓度下, 高氨氮浓度会导致颗粒污泥微生物群落丰富度降低.同时, A反应器相对B反应器的Shannon指数和Simpson指数更低, 即A反应器的颗粒污泥群落多样性低, 说明降低C/N会使好氧颗粒污泥选择耐氨氮能力强的专性功能菌, 淘汰了耐受力差的菌种, 从而导致微生物多样性降低.该系统中, 微生物群落丰富度和多样性的变化主要由氨氮浓度决定, 因此, 在COD浓度一定的条件下, 不同氨氮浓度可能对不同微生物群落产生较大的选择压.
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表 2 A、B反应器的微生物群落丰富度和多样性指数 Table 2 Microbial community richness and diversity index in reactors A and B |
2.3.2 微生物群落动态变化
图 4(a)所示为第Ⅲ阶段所取颗粒污泥样品细菌门水平的差异.A反应器污泥优势菌为变形杆菌门(Proteobacteria, 86.8%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 8.69%)和厚壁菌门(Firmicutes, 2.43%)等3种, 相对丰度占总群落的97.92%; B反应器污泥优势菌为变形杆菌门(Proteobacteria, 89.7%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 5.43%)和厚壁菌门(Firmicutes, 1.86%)等3种, 相对丰度占总群落的96.99%.由于变形杆菌门(Proteobacteria)具有脱氮除磷能力, 在生物系统中总是发现其有最好丰度[24].对比两反应器的门水平, 可知增加氨氮浓度会导致变形杆菌门(Proteobacteria)少量降低, 拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)部分增加.在该实验条件下, 不同的氨氮浓度对门水平上的菌种变化影响不大.
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图 4 运行期间A、B反应器的微生物群落动态变化 Fig. 4 Difference in microbial population dynamics in reactors A and B |
图 4(b)所示为该污泥样品纲水平的差异.A反应器污泥优势菌为β-变形菌纲(β-Proteobacteria, 81.26%)、鞘氨醇杆菌纲(Sphingobacteriia, 4.69%)、γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria, 3.79%)和梭菌纲(Clostridia, 1.77%)等4种, B反应器污泥优势菌为β-变形菌纲(β-Proteobacteria, 66.29%)、γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria, 17.37%)、δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria, 3.04%)和α-变形菌纲(α-Phaproteobacteria, 2.94%)等4种.可知, 增加氨氮浓度导致鞘氨醇杆菌纲(Sphingobacteriia)有所增加, 统微菌纲(Verrucomicrobiae)和OM190消失, 出现了未分类的放线菌(unidentified_Actinobacteria)和黄杆菌纲(Flavobacteriia).β-变形菌纲(β-Proteobacteria)中的部分细菌是氨氧化细菌(AOB), 包括Nitrosomonas属和Nitrosopira属.其在A反应器明显含量更高, 说明高氨氮条件更有利于AOB的生长.有研究报道γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)在含有高浓度的硝酸盐废水中具有较好的反硝化作用[25], 反硝化菌(慢速生长菌)对污泥系统有较好的稳定性作用, B反应器中该菌比例相对更高, 有利于系统的稳定运行.在不同的C/N条件下, 虽然细菌纲水平比例有一定变化, 但它们的结构分布仍有很多相似点.
图 4(c)所示为A和B反应器颗粒污泥属水平情况.从中可知, 两反应器的微生物种属虽大多集中在变形菌门(Proteobacteria), 但是C/N变化却使好氧颗粒污泥种群丰度结构有了明显变化.A反应器中主要包括:Thermomonas、Arenimonas、Brevundimonas、Tahibacter、Thauera、Nitrosomonas和Streptococcus等优势菌属; 而B反应器中主要包括Zoogloea、Prosthecobater、Gemmobacter、Thauera和Nitrosomonas等多种优势菌种.A反应器中Thermomonas、Arenimonas是反硝化菌, 它与硝态氮浓度密切相关[26]; Brevundimonas有助于胞外聚合物(extracellular polymers, EPS)产生[27]; Streptococcus则是一种产甲烷细菌, 不利于系统稳定.B反应器中的Zoogloea具有分泌更多的胞外蛋白(protein, PN)[28], 而PN在稳定好氧颗粒污泥结构和保证系统稳定运行过程中起着重要作用; Gemmobacter具有良好的脱氮性[29].Thauera和Nitrosomonas在两反应器中均处于次优势种群.Thauera是一种耐受高碳氮负荷的反硝化菌[30], 它在生长过程中会分泌胞外多糖(polysaccharide, PS)促进污泥颗粒化, 然而PS相对PN在颗粒稳定性的作用却是很小的[24].Nitrosomonas是一种典型的AOB[31], A反应器有更高比例的亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)数量, 说明高氨氮会导致AOB增加.而A反应器中几乎没有NOB, 说明该系统亚硝酸盐的氧化受到抑制, 这也解释了A反应器在稳定期间有较高的氨氮去除率却同时具有高浓度的亚硝酸盐存在的原因.
3 结论(1) 通过逐步增加负荷的方法, 经过近一个月的培养, 两个C/N条件下反应器接种的好氧颗粒污泥活性都得到恢复.但C/N为4条件下, 系统除碳和硝化性能恢复更快, 恢复效果更好.
(2) 在近4个月的系统稳定运行期间, C/N为4的好氧颗粒污泥系统COD和氨氮去除效率都达到90%以上, 实现了完全硝化; 而C/N为2好氧颗粒污泥系统COD去除率仅为80%左右, 未能实现完全硝化.在一个月的冲击负荷条件下, C/N为4的好氧颗粒污泥系统处理性能有所波动, 但系统经自身调整后趋于稳定; 而C/N为2好氧颗粒污泥系统硝化效果恶化.这表明, C/N为4的低碳氮比废水好氧颗粒污泥在长期运行过程中, 具有更好的处理效果和更稳定的处理性能.
(3) 从微生物结构角度来看, C/N为2好氧颗粒污泥系统比C/N为4的系统微生物群落丰富度和多样性降低.两个C/N条件下的微生物群属大多集中在变形菌门(Proteobacteria), 但具体丰度上有较大差异.其共同优势菌属都为Thauera和Nitrosomonas, 但C/N为4的好氧颗粒污泥系统具有更高丰度的Zoogloea, 有利于稳定好氧颗粒污泥结构, 并保证系统长期稳定运行.
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