2020, Vol. 41
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 北京城市排水集团有限责任公司, 北京 100044;
4. 张家口西山污水处理有限责任公司, 张家口 076250
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Beijing Drainage Group Co., Ltd., Beijing 100044, China;
4. Zhangjiakou Xishan Wastewater Treatment Co., Ltd., Zhangjiakou 076250, China
与化学处理法和物化处理法相比, 活性污泥法因处理成本相对较低而广泛地应用于城市生活污水的处理过程[1]; 其中, 活性污泥中的关键功能种群在目标污染物去除过程中发挥了重要的作用.随着分子生物学分析方法的不断进步, 人们已逐渐认识到关键功能种群的组成结构及数量变化与污染物去除水平间的相互关系, 并渐渐成为污水生物处理工艺高效稳定运行的调控依据.但作为多因素复杂影响的城市污水生物处理工艺, 功能微生物的结构与关键种群数量的变化不仅依赖于工艺所创造出的厌氧/缺氧/好氧等生境条件, 同时环境条件的剧烈变化(如温度)也会对种群动态变化产生显著影响, 并最终影响污水处理效果, 冬季低温条件下的城市污水处理工艺失稳现象则是其中的典型代表[2].
城市污水处理厂的冬季低温失稳主要表现在运行水温≤15℃时, 污染物整体去除效率下降, 出水关键指标如氨氮(NH4+-N)、总氮(TN)和总磷(TP)浓度出现较大波动.前期研究结果指出, 功能菌的数量与对应生物过程速率显著相关[3], 如较高的氨氧化菌丰度可以加速硝化过程[4], 反硝化菌所携带的功能基因信号强度与脱氮效率呈正相关[5]; 低温会显著降低硝化菌及反硝化菌的活性, 引起关键功能种群的数量下降[6], 从而影响目标污染物的去除效果.同时活性污泥又是一个复杂的微生物生态集合, 单一功能菌低温条件下的数量与结构变化可在生态选择的作用下影响整体种群结构与数量的变化, 最终影响污染物整体去除效果.如低温诱发的污泥膨胀现象会导致污泥性状改变和沉降性变差[7, 8], 严重时造成关键功能种群数量显著降低并引起污水处理效率下降[9].我国目前大型城市污水处理工艺由于缺乏活性污泥种群基础数据信息, 在实际低温运行中主要依据总进、出水水质数据进行调控, 但水质数据波动往往滞后于功能种群变化[10, 11], 因此这类常规调控无法建立起针对目标功能种群的控制策略, 也导致对冬季失稳现象的控制效果不佳.
本文针对中国北方地区4个低水温期稳定运行的典型城市污水生物处理工艺, 从微生物种群角度出发, 利用现有分子生物学手段对典型工艺中的活性污泥进行全面解析; 在阐明工艺冬季重要功能种群分布信息的基础上, 密切结合实际工艺运行参数, 系统分析氮、磷等主要降解功能菌与污染物去除效率间关系, 剖析污泥沉降性能与丝状菌丰度间关系, 以期为我国低温条件下大型城市生活污水厂稳定高效运行控制策略的建立奠定坚实的科学数据基础.
1 材料与方法 1.1 目标污水处理工艺概况以中国北方地区冬季低温期的4个典型城市污水生物处理工艺为研究对象, 其工艺分别为多点布水AO工艺(A)、CASS工艺(B)、改良AO工艺(C)和AO工艺(D), 进水均为生活污水, 其中B工艺运行水温为8~15℃, A、C和D运行水温为10~15℃, 具体工艺运行信息见表 1.
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表 1 污水处理工艺基本信息 Table 1 Basic information for the full-scale WWTPs |
1.2 污泥样品采集及水质测定
在2017~2019年冬季低温期, 对4个污水厂进行多次采样及测定, 采样时平行采集生物处理工艺曝气池活性污泥样品, 样品采集后置于-20℃生物冰箱保存; 同时对典型污水生物处理工艺进行全程的沿程/延时监测, 准确测定各工艺单元中污染物浓度变化趋势.按文献[12]中相关方法测定样品的各指标, 化学需氧量(COD)测定采用重铬酸钾法, NH4+-N测定采用纳氏试剂分光光度法, 亚硝酸盐氮(NO2--N)测定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法, 硝酸盐氮(NO3--N)测定采用麝香草酚分光光度法, TN测定采用紫外分光光度法(碱性过硫酸钾氧化), 正磷酸盐(PO43--P)测定采用磷钼蓝-抗坏血酸分光光度法, TP测定采用钼锑抗分光光度法, 同时测定各工艺(时)段中的污泥浓度(MLSS)和活性污泥体积指数(SVI), 分别采用重量法和100 mL量筒测定.
1.3 微生物群落结构测定与分析活性污泥样品的高通量测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成, 针对16S V3-V4区进行MiSeq扩增子测序, 测序数据经拼接、质控和去接头后获得优化序列, 在优化序列的基础上按照97%相似性对非重复序列进行OTU聚类分析及物种多样性分析, 利用Uparse(7.0.1090)进行OTU聚类, 利用Mothur(v.1.30.1)软件平台进行α多样性分析, 采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析, 选取各OTU的代表序列与Silva数据库进行比对注释, 得到每个OTU对应的物种分类信息, 并在各个水平上统计每个样品的群落组成, 获得样本中微生物phylum(门)和genus(属)等物种组成及丰度.
2 结果与讨论 2.1 不同工艺低温条件下的污染物去除水平在采样监测的冬季低温运行期, 4个处理工艺对COD及氨氮的生物去除水平良好.其中COD平均去除率86.3%, 氨氮平均去除率95.7%. A、C和D由于为长期运行的缺氧/好氧工艺, 几乎无生物除磷效果; B工艺随工艺运行条件升级, 由缺氧/好氧工艺逐渐转变为缺氧/厌氧/好氧工艺, 生物除磷效率从2018年(B1)的55%上升并稳定至2019年(B3)的97%. 4个工艺间的TN去除水平具有一定差别(表 2), 可以看出4个工艺的TN去除率与硝化液回流比例具有一定相关性, 回流比例越高, TN去除率相对越高.
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表 2 污水处理工艺运行情况 Table 2 Running condition for the full-scale WWTPs |
而污泥体积指数显示, 除C工艺外, 冬季时段的A、B和D工艺的SVI值均接近或者超过了150 mL ·g-1的膨胀标准[11], 表明A、B和D工艺在低温运行的冬季均处于膨胀期, 但对出水水质并未造成显著影响.
2.2 微生物群落结构分析群落结构是活性污泥的核心, 良好的群落结构是污水生物处理工艺抵抗环境条件变化冲击、保证出水稳定性的重要前提.从测序结果可以看出(图 1), 尽管4个污水处理工艺流程不同, 具有不同的进水水质特征, 多样性指数Chao指数显示4个工艺的污泥整体群落较为丰富[图 1(a)], 其中B1、B3和C1的丰富度略低于其他样品, 但污染物去除效果均较好.Simpson指数显示[图 1(b)], 与其余两个工艺相比, B和D工艺的种群均匀度较低.
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图 1 微生物群落多样性及丰富度 Fig. 1 Richness and diversity indices of microbial communities |
低温条件下的9个活性污泥样品中共含有45个菌门(图 2), 其中变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)是4个工艺的主要优势菌门, 相对丰度占比为20.3% ~37.6%(均值28.6%)、5.5% ~27.3%(均值16.3%)和7.3% ~27.4%(均值17.4%).作为活性污泥脱氮除磷主要的功能菌门, 变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)在工艺中的平均比例略低于常规的研究报道[13], 可能与低水温环境有关.值得注意的是, 9个样品中放线菌门(Actinobacteria)的比例均明显高于其在常规活性污泥中的丰度[13].这是由于放线菌门中包含多种与污泥膨胀相关菌属, 与4个工艺冬季处于膨胀期的现象相吻合.
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图 2 门水平细菌群落组成 Fig. 2 Bacterial community composition at the phylum level |
尽管各个工艺具有类似的污染物去除水平及微生物群落组成, 但4个污水生物处理工艺9个样品的PCA(principal component analysis)分析结果表明(图 3), 各个工艺的群落结构间还是存在一定差异, A和C工艺及早期的B工艺(B1)均为缺氧/好氧工艺具有较为类似的群落结构; 随着B工艺由缺氧/好氧工艺(B1)改造为缺氧/厌氧/好氧(B2和B3)工艺而逐渐增强除磷功能, 其群落结构与其余3个仅有碳、氮去除的工艺产生了较大差异.同时, C和D工艺中样品之间的时间跨度为1 a, 微生物群落呈现各自聚集的趋势, 表明这两个污水处理工艺在冬季低温下处于较为稳定的状态.
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图 3 微生物群落主成分分析 Fig. 3 Principal component analysis of the microbial community |
在属水平(相似度>97%)上确认核心功能种群的数量及其动态变化, 寻找其与工艺污染物去除能力间的相互关系, 是工艺稳定调控策略建立的基础.对于硝化过程来讲, 承担NH4+-N氧化的氨氧化(AOB)种属与亚硝酸氧化(NOB)种属大部为自养菌, 因此在常规的活性污泥中相对丰度较低, 同时易受温度影响而产生数量波动[14].此次4个污水处理工艺均在低水温条件下运行, 硝化菌属相对丰度见图 4, 其中AOB种属Nitrosomonas的相对丰度值(0.05% ~0.7%)低于常规的文献报道值(0.2% ~0.9%); 同时由于B工艺冬季运行水温最低(8℃), 因此其Nitrosomonas相对丰度在4个工艺中最低.工艺中NOB种属Nitrospira的丰度变化(0.2% ~2.1%)与常规比例(0.3% ~1.6%)[13]差别不大.
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图 4 硝化菌属相对丰度 Fig. 4 Abundance of nitrifying bacteria |
NH4+-N经硝化菌氧化成NO3--N后, 利用COD提供的电子由反硝化菌还原成氮气从水中逸出, 因此反硝化是工艺中氮类污染物及COD去除的重要过程, 反硝化菌也是活性污泥中比例最高、种类最为复杂的功能种群.在9个样品773属中共有67个反硝化功能种属, A、B、C和D工艺中的反硝化种群总相对丰度均值分别为33.5%、30.6%、31.1%和31.3%, 这与文献[15]报道的常温活性污泥中反硝化种群丰度基本类似.各个工艺中的主要优势反硝化种属如图 5所示.可以看出4个工艺中的反硝化功能种属多样性较高，有降解复杂化合物能力的Thuaera，也具备有机物水解和加快反硝化进程的Saprospiraceae与Anaerolineaceae, 优势异养反硝化菌属Blastocatellaceae, 典型反硝化菌属Terrimonas、Ottowia、Zoogloea和Pseudomonas, 同时还有部分与污水厂脱氮性能有密切关系的功能菌属: Caldilineaceae、Xanthomonadaceae、Rhodobacter、Dokdonella、Simplicispira和Haliangium[16~32].
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图 5 反硝化菌属相对丰度 Fig. 5 Abundance of denitrifying bacteria |
这些优势功能种属在4个工艺中均有所出现, 只是相对丰度在各个工艺中不尽相同.为了更为准确地判断功能种群分布、数量与工艺脱氮性能间关系, 将前15个优势反硝化种属(相对丰度>0.01%)及反硝化菌属总丰度(TA)与工艺脱氮效率[反硝化速率(DR), 总氮去除率(TNRR)]、相关工艺参数[如回流比(NSRR)]进行了相关性分析.从相关性分析结果可以看出(图 6), 工艺反硝化速率的变化与15个反硝化种属的相对丰度变化并无相关性, 总氮去除率仅与硝化液回流比数值显著正相关(P < 0.05).作为活性污泥中最为重要和最为庞大的功能种群, 反硝化种属及其功能是随着分析方法的进步而不断被认识：早期传统富集培养手段仅能确定很少一部分的功能种群; 随着分子生物学的发展, 越来越多的种属被纳入到反硝化功能种群中.在本次9个样品中数量上占比8.7%的反硝化相关种属占据了所有微生物30%以上丰度, 首先证明在所有工艺中反硝化功能种群是活性污泥的核心种群[15, 33]; 而67个种类占比30%以上的脱氮种属出现, 表明了反硝化功能种群的广泛分布、高多样性及稳定结构, 而低温造成单一或几个种属的丰度数值波动并不影响工艺整体反硝化性能, 这是系统反硝化功能与反硝化速率高效稳定的重要前提; 相对于运行温度的降低, 系统的反硝化性能更容易直接受制于关键工艺运行参数(如决定携带硝酸盐至缺氧区比例的混合液回流比), 这也与作者前期对工艺系统过程的分析结果相符[34].
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DR表示反硝化速率, TNRR表示总氮去除率, NSRR表示回流比, TA表示反硝化菌属总丰度 图 6 反硝化性能的相关性分析 Fig. 6 Correlation analysis for denitrification |
4个工艺中A、C和D为缺氧/好氧工艺, 出水TP浓度虽略有下降, 但其厌氧条件较差或不存在, 因此抑制生物除磷过程的发生, 更多表现为生物同化作用, 几乎没有生物除磷效果; B工艺进行工艺改造, 运行方式由缺氧-好氧交替运行变为缺氧-厌氧-好氧交替运行, 其生物除磷功能逐渐出现并最终稳定.对工艺中聚磷功能种群(PAOs)进行了定量分析(图 7)：作为传统除磷菌的Candidatus_Accumulibacter在4个工艺中仅占较小的比例(0.004% ~0.2%)[35], 而丝状除磷菌Tetrasphaera则广泛地分布于4个工艺中, 且具有较高丰度(0.7% ~3.4%)[36].在具有最好生物除磷效果的B3样品中, Tetrasphaera(3.4%)和Candidatus_Accumulibacter(0.2%)具有最高丰度, 而生物除磷主要由Tetrasphaera承担.值得注意的是在长期缺氧/好氧交替环境中, Candidatus_Accumulibacter(厌氧/好氧交替才能维持代谢)几乎不能生存[37], 而Tetrasphaera可以在有氧、缺氧、厌氧条件下吸收亲水性物质和如长链脂肪酸类的疏水性物质长期存活[38]但不具有除磷功能; 当适合条件(厌氧/好氧交替)出现时, Tetrasphaera在低水温条件下也可以迅速发挥生物除磷功能.这也解释了为何B工艺可以在冬季实现迅速生物除磷并保持稳定的原因.
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图 7 聚磷菌相对丰度 Fig. 7 Abundance of polyphosphate accumulating organisms |
低温条件下易诱发丝状菌的过量生长而导致污泥膨胀现象的产生.在9个样品中共发现了25个种属与丝状菌相关(图 8), 主要的优势种属为Candidatus Microthrix; 同时按形态学分类的Nostocoida Limicola Ⅰ(Trichococcus)和Nostocoida Limicola Ⅱ(Tetrasphaera)也具有较高丰度; 作为污泥骨架存在的丝状菌Type 0092(Roseiflexus)稳定出现在所有样品中.这与SVI数据较为一致, 4个工艺处于丝状菌导致的污泥膨胀状态.前期研究中指出由于污泥膨胀为复杂过程, 沉降性能及工艺性能的判断不能仅仅依靠丝状菌丰度数据, 还需耦合优势丝状菌在污泥中的生长位置来进行准确判定[11].镜检结果显示, 显微镜下A、B和C工艺优势丝状菌为Type 0092及Type 0041, 存在部分微丝菌(Microthrix parvicella)在菌胶团内生长; 而D工艺优势丝状菌为微丝菌且具有破团生长趋势.因此尽管微丝菌在所有样品中具有较高丰度, 但只有D工艺为微丝菌导致的污泥膨胀, 其余工艺的污泥膨胀是多类丝状菌优势生长的复合结果, 对出水水质未产生较大影响.
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图 8 丝状菌相对丰度 Fig. 8 Abundance of the filamentous |
从核心种群的分析结果不难看出, 与常温数据相比, 低温降低了工艺中硝化种属的数量, 并对硝化速率形成了影响[6]; 但对核心功能种群的反硝化种属丰度影响不明显, 工艺的反硝化效率则受回流比影响更为显著.在除磷功能种群中, Tetrasphaera是广泛存在且承担主要除磷作用的功能菌.这些有关微生物信息的数据, 为未来低温下我国城市污水生物处理工艺有效调控策略的建立提供了坚实的基础, 而Tetrasphaera所特有的生理生化特性(非厌氧/好氧广泛存活, 厌氧/好氧下快速恢复高效稳定除磷)为我国未来污水生物处理工艺的生物除磷优化提供了可行途径.
3 结论(1) 在良好稳定运行的状态下, 4个工艺的活性污泥均有较好的种群丰富度, 相比于常温, 低温下放线菌门(Actinobacteria)优势地位提升.
(2) 低温对硝化种属Nitrosomonas丰度具有一定影响并降低了系统硝化速率; 作为核心功能种群的反硝化种属由于种群分布广泛、多样性高且结构稳定, 因此整体丰度在低温下并未发生明显变化, 工艺的总氮去除率与工艺参数(回流比)具有相关性.
(3) Tetrasphaera在工艺中广泛存在并在厌氧/好氧交替条件下承担主要除磷作用的聚磷菌.
(4) 低温状态下4个工艺普遍存在丝状菌诱发污泥膨胀现象, 但丝状菌多样性高且对水质影响较小.
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