2020, Vol. 41
2. 中国科学院南京土壤研究所, 土壤与农业可持续发展国家重点实验室, 南京 210008;
3. 中国科学院东北地理与农业生态研究所, 黑土区农业生态重点实验室, 哈尔滨 150081
2. State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China;
3. Key Laboratory of Mollisols Agroecology, Northeast Institute of Geography and Agroecology, Chinese Academy of Sciences, Harbin 150081, China
土壤有机质的平衡与稳定是维持土壤生态功能和可持续生产力的基础.土壤有机碳储存是由微生物代谢活动和植物碳输入之间的平衡决定的[1].Lange等[2]和Tardy等[3]的研究发现, 较高水平的植物残体输入量, 可以改变土壤微生物的生长, 从而增加新鲜碳的储存.微生物既可以通过矿化作用减少土壤有机碳含量, 也可以通过微生物残体积累增加有机碳的形成[4~6].真菌是土壤微生物的重要组成部分, 在调节土壤碳稳定中起着关键作用.一方面, 腐生真菌具有降解纤维素、木质素和几丁质的能力[7].菌根真菌虽然不直接参与有机质分解过程, 但Cheng等[8]的研究表明CO2升高后, 丛枝菌根真菌可能通过刺激腐生真菌, 加速土壤有机碳的分解过程, 导致土壤碳库的流失.另一方面, 难降解有机碳库的来源主要是真菌[9].Liang等[6]提出“微生物碳泵”理论, 强调了细菌和真菌的合成代谢对碳储存的重要性.Schweigert等[9]利用13 C标记外生菌根的培养实验表明, 63.5%的外生菌根真菌转化为有机质, 36.5%被矿化.需要进一步从土壤碳库分子结构特征出发, 揭示不同有机质含量土壤真菌群落与有机碳官能团变化的关系.
由于不同的含碳官能团结构对分解的抗性不同, 其在环境中的稳定性存在极大差异, 因此, 土壤碳库的稳定性很大程度上取决于有机碳官能团结构组成特征[10].固态13 C核磁共振技术(13 C-NMR)基于化学位移理论, 可以获得有机质化学结构波谱, 在研究土壤有机碳官能团分布特征中应用广泛.Kelleher等[11]和Masoom等[12]利用13 C-NMR发现土壤腐殖质中大部分官能团结构都与植物和微生物的生物聚合物结构相对应, 表明土壤有机质主要是由植物源大分子碳输入和微生物残体组成.
网络分析方法已被广泛用于研究微生物之间潜在的相互作用[13], 并基于生物互作网络揭示生态系统碳转化过程[14]和多功能性变化[15].网络分析不仅能直观地展示复杂的微生物群落之间可能的互作关系, 而且可以用来预测生态系统的稳定性[16].Xiao等[17]的研究发现与细菌群落相比, 土壤真菌群落具有较小的扩散限制、较强的环境选择性和潜在的更紧密的网络互作, 因而在土壤碳周转中起着更为重要的作用.可以进一步利用网络分析方法探索真菌群落互作及其对环境变化的响应.
为了研究有机碳官能团结构变化与真菌互作的关系, 本文以东北5种不同有机质含量(2% ~9%)农田黑土为研究对象, 利用13 C-NMR分析梯度有机质含量黑土的碳结构变化, 分别构建了低有机质和高有机质黑土分子生态网络, 目标如下:①明晰梯度有机质含量黑土中真菌的群落结构以及有机碳官能团结构的变化; ②建立土壤有机碳官能团和真菌群落结构之间的联系; ③探索影响不同有机质含量真菌互作的关键环境因素.
1 材料与方法 1.1 实验设计及采样分析在东北典型黑土带上, 按黑土有机质由高到低, 采集5个基础土壤有机质差异较大的农田黑土(表 1).每个样区设计3个1 m×1 m样方, 每个样方内通过多点法在0~25 cm的耕层采集新鲜土壤, 并混合均匀.土壤样品一部分风干用于测定土壤的基本理化性质(表 2).另一部分新鲜土壤样品保存在-80℃冰箱用于土壤微生物测序分析.
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表 1 梯度有机质含量黑土采样地点 Table 1 Sampling information of arable mollisols with gradient soil organic matter (SOM) contents |
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表 2 黑土基本理化性质1) Table 2 Basic physicochemical properties of arable mollisols |
1.2 固态13 C核磁共振分析
分别对5种梯度有机质含量的黑土样本进行固态13 C-NMR分析.为了去除土壤中Fe3+和Mn2+离子的干扰, 首先对样品进行氢氟酸预处理[18].预处理过的土壤样品进行固态魔角旋转-核磁共振测定(AVANCEⅡ 300 MH).本实验采用7 mm CPMAS探头, 观测频率为100.5 MHz, MAS旋转频率为5 000 Hz, 接触时间为2 s, 循环延迟时间为2.5 s.化学位移的外标物为六甲基苯(hexameth-ylbenzene, HMB, 甲基17.33 mg ·kg-1).土壤有机碳的主要13 C信号的化学位移对应的碳结构如下[19]: Alkyl C(烷基碳, 0~45 ppm)、Methoxy C(N-烷基和甲氧基, 45~60 ppm)、O-Alkyl C(O-烷基, 60~112 ppm)、Aromatic C(烯烃和烷基芳香族或芳香族, 112~142 ppm)、O-aromatic C(氧取代的芳香族或酚类, 142~160 ppm)和Carbonyl C(酮和醛或羧基, 160~220 ppm).利用MestReNova 12.0软件对上述化学位移区域的信号强度进行区域积分, 确定了13 C强度分布.各碳化学组分的绝对含量用土壤总有机碳含量与其相对百分比的乘积表示.
1.3 土壤微生物DNA提取及土壤真菌高通量测序称取2 g土壤样品, 经过液氮冷冻研磨后, 采用Power Soil DNA isolation kit(MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, U.S.A)试剂盒提取土壤总DNA.采用Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, U.S.A)测定DNA浓度和纯度.对样本DNA进行ITS2区的PCR扩增, 设置3个重复实验, 以标准的真菌基因组DNA Mix作为阳性对照.利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的产物, 通过核酸纯化磁珠对扩增产物进行纯化, 得到一个样本的原始文库.然后, 对文库进行定量混合以及质量检测.本研究采用MiSeq平台, 2×250 bp的双端测序策略对文库进行测序.使用TrimGalore、FLASH2、Mothur和Usearch软件对原始下机数据进行质量控制和过滤.按照97%的相似性对序列进行OTU聚类分析.使用Mothur软件的classify.seqs命令以及UNITE比对据库, 找出与OTU序列相似度最高且可信度达80%以上的物种信息完成OTU的分类学注释.
1.4 数据分析方差分析(ANOVA)在SPSS 22.0完成.真菌群落的典范对应分析(CCA)使用R软件(Version 3.5.2)中的“vegan”数据包.通过使用Cytoscape(3.7.1)软件中CoNet插件构建微生物生态网络来研究土壤真菌群落间的相互作用以及真菌群落与土壤有机碳官能团结构的联系.参考顾静馨[20]的分析步骤和网络参数的选择.网络分析中, 选择5种相关分析方法, 即Pearson correlation、Spearman correlation、Mutual information、Bray-Curtis dissimilarity和Kullback-Leibler dissimilarity, 设置起始连接数为1 000.然后, 采用Benjamini-Hochberg方法进行标准化处理相关系数, 即对原有假设检验得到的显著性P值(P-value)进行校正, 并最终采用校正后的P值, 保留P＜0.05的相关OTU构建关联网络.同时, 网络拓扑参数(网络节点数、连接数、聚集系数、网络直径、特征路径长度和网络密度等)的计算利用NetworkAnalyzer插件.本研究将所有真菌按纲分类, 利用Cytoscape(3.7.1)将同一纲类的OTU合并, 对网络结构进行可视化.连线的粗细代表真菌纲类与纲类之间相互作用的连线数或者真菌纲类与有机碳官能团结构以及其它土壤理化因子的连线数.随机森林是以决策树为基础, 对数据进行分类和回归的新工具[21].随机森林的分析方法是通过对数据的每一个解释变量分别随机置换以得出每个解释变量对被解释变量的贡献程度, 以均方误差表示.本研究利用随机森林模型(random forest analysis)的方法, 探究有机质官能团结构以及其他土壤理化因子对土壤真菌网络参数的贡献程度.利用R软件中“randomForest”数据包进行随机森林模型的预测; 利用“rfUtilities”数据包对模型整体的检验; 利用“rfPermute”数据包对随机森林中每个变量对模型贡献程度的显著性检验.最后, 使用Sigmaplot14.0软件进行科学绘图.
2 结果与分析 2.1 梯度有机质含量黑土中有机碳官能团结构分析梯度有机质含量(2%、3%、5%、7%和9%)黑土中有机碳的13 C-NMR图谱及6种碳官能团相对含量见图 1.其中O-Alkyl C所占比例最大, 且随着有机质含量的升高增加(25.8% ~35.9%, P < 0.05).Alkyl C占比次之, 随着有机质含量的升高减小(29.3% ~17.2%, P < 0.05).烷基碳及芳香碳是顽固性高、难分解的有机碳组分, 而烷氧碳和羰基碳等是最易分解、最不稳定的有机碳组分[22~24].本文将Methoxy C、O-Alkyl C和Carbonyl C划为易分解碳组分(labile organic carbon, LOC), Alkyl C、Aromatic C和O-aromatic C划为难分解碳组分(recalcitrant organic carbon, ROC).由图 1(b)可以看出, 随着黑土的有机质含量的升高, LOC占总有机碳的比例从46.0%增至57.2%.通常用Alkyl C/O-Alkyl C比值(A/A-O)来评价土壤有机碳分解程度的敏感程度, 其比值越小说明有机质的分解程度越低[25].图 1(b)表明, 黑土有机质含量越高, A/A-O越低, 即土壤有机碳的分解程度越低.
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图 1 有机质梯度黑土中有机碳官能团结构的谱图和相对丰度 Fig. 1 Spectra and relative abundance of the carbon functional groups in arable mollisols with different SOM gradients |
不同有机质含量黑土的真菌群落在纲水平的组成如图 2(a)所示, 其中粪壳菌纲(Sordariomycetes和Ascomycota, 14.33% ~28.17%)、被孢毛霉纲(Mortierellomycotina和Zygomycota, 7.32% ~23.14%)和座囊菌纲(Dothideomycetes和Ascomycota, 8.79% ~27.91%)为主要的优势类群.粪壳菌纲和被孢毛霉纲均随着土壤有机质含量的升高而显著增加(P < 0.05).通过典范对应分析(CCA)发现[图 2(b)], SOC和TN是影响梯度有机质含量土壤真菌群落结构变化的主要因素.进一步对有机碳官能团和真菌群落的CCA分析表明[图 2(c)], 有机碳结构官能团均对真菌群落结构变化产生显著影响.另外, SOM2、SOM3和SOM5的土壤真菌群落与SOM7和SOM9的真菌群落结构差异显著(P < 0.05), 因此将样品分成高有机质土壤(SOM7、SOM9)和低有机质土壤(SOM2、SOM3和SOM5), 并进行网络分析.
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图 2 梯度有机质含量黑土真菌群落组成及土壤性质与真菌群落结构的关系 Fig. 2 Composition of fungi and relationship between fungal community structure and soil geochemical attributes under SOM gradient in arable mollisols |
为了进一步探究不同有机质土壤真菌群落互作以及生态网络中真菌与土壤有机碳官能团结构的关系, 基于显著相关性的方法分别构建了低有机质和高有机质土壤有机碳官能团与真菌群落的分子生态网络(图 3), 并计算了网络的拓扑性质(表 3).结果表明, 与高有机质土壤相比, 低有机质土壤生态网络的结构较简单, 节点数、连接数和平均聚类系数均减少.低有机质土壤生态网络中粪壳菌纲(Sordariomycetes)和被孢毛霉纲(Mortierellomycotina)与其他纲类的连接数明显比高有机质土壤生态网络少.在低有机质土壤生态网络中, 真菌与有机碳官能团的联系更紧密.与高有机质土壤生态网络相比, 低有机质土壤生态网络中真菌与有机碳官能团的连接数较多, 尤其是与LOC的连线较多(表 3).另外, 低有机质土壤生态网络中真菌与碳官能团出现负连接.
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灰色实线表示强烈的相互作用关系(|r|>0.8);线宽与两节点间连接数成比例; A:Dothideomycetes; B:Eurotiomycetes; C:Leotiomycetes; D:Pezizomycotina; E:Saccharomycetes; F:Sordariomycetes; G:Agaricomycetes; H:Agaricostilbomycetes; I:Cystobasidiomycetes; J:Exobasidiomycetes; K:Microbotryomycetes; L:Tremellomycetes; M:Ustilaginomycetes; N:Chytridiomycetes; O:Glomeromycota; P:Mortierellomycotina; L1:Methoxy C; L2:Alkyl C; L3:Carbonyl C; R1:Alkyl C; R2:Aromatic C; R3:O-aromatic C; 土壤理化因子:TN、DOC、pH、NH4+-N和NO3--N 图 3 低有机质含量黑土和高有机质含量黑土真菌群落与有机碳官能团的分子生态网络 Fig. 3 Molecular ecological network of fungi and organic carbon functional groups in arable mollisols with low SOM and high SOM |
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表 3 分子生态网络的拓扑性质 Table 3 Topological properties of molecular ecological networks |
在真菌群落纲水平统计了不同类群与有机碳官能团结构之间的连接数(图 4).低有机质土壤生态网络中, 粪壳菌纲(Sordariomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、锤舍菌纲(Leotiomycetes)、盘菌纲(Pezizomycotina)和被孢毛霉纲(Mortierellomycotina)与有机碳结构呈显著相关关系(P < 0.05), 其中盘菌纲和散囊菌纲与有机碳官能团结构显著负相关(P < 0.05).在高有机质土壤生态网络中, 只有粪壳菌纲(Sordariomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)和被孢毛霉纲(Mortierellomycotina)与有机碳结构呈显著正相关关系(P < 0.05).与高有机质土壤相比, 低有机质土壤生态网络中, 真菌与LOC连线数比ROC多, 主要是粪壳菌纲和散囊菌纲与LOC的连线数增加.
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图 4 低有机质含量黑土和高有机质含量黑土生态网络中有机碳结构与真菌群落(纲类水平)之间的连接关系 Fig. 4 Connections between organic carbon functional groups and fungal community (at class level) in low and high SOM arable mollisols ecological networks |
利用随机森林模型的方法, 基于土壤理化性质、LOC和ROC等因子对低有机质和高有机质黑土的真菌网络参数的变化进行预测(图 5).模型均通过显著性检验(P=0.001), 且对低有机质网络参数的解释量为73%, 对高有机质土壤生态网络参数的解释量为77.5%.随机森林模型的结果表明LOC、ROC和TN均对低有机质土壤生态网络参数变化有显著的影响, 其中LOC对低有机质网络参数变化解释量最高(10%), 其次是ROC(9.4%).ROC对高有机质土壤真菌互作关系的贡献最高, 为8.1%, LOC解释量为7.4%.因此, 有机碳分子结构对低有机质土壤生态网络参数变化的解释量均高于高有机质土壤生态网络.
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*表示0.05水平下变量对模型贡献显著, **表示0.01水平下变量对模型贡献显著 图 5 低有机质含量黑土和高有机质含量黑土基于随机森林模型的土壤性质对真菌群落互作的影响 Fig. 5 Influence of soil geochemical attributes on fungal interactions in arable mollisols with low and high SOM based on random forest models |
通过比较2% ~9%有机质含量黑土碳官能团特征可知:土壤有机质含量越高, 其LOC占总有机碳比例越高.李娜等[26]通过研究土壤有机质化学官能团比例与土壤有机质含量的相关性发现, 土壤有机碳含量与烷氧碳比例有显著的正相关性, 与芳香碳和羰基碳呈显著负相关关系, 与本文研究结果一致.一方面, 植物残体是土壤中LOC组分的重要来源[27].LOC组分的含量直接或间接受到地上残留物化学成分的影响[28].因此有机质含量高的土壤中LOC占SOC比例较大的原因可能是植物残体等新鲜有机碳的输入量差异.植物残体和土壤中的烷氧碳也存在较好的相关性, 这也是烷氧碳占比最高的原因[22~24].另一方面, 本研究还发现A/A-O随着黑土有机质含量的增高而降低, 这说明土壤有机质含量越低, 土壤有机质分解程度越高.通常微生物会消耗有机质中容易降解的部分, 微生物将易降解碳一部分用于分解代谢, 另一部分用于合成代谢.相同环境条件下, 农田黑土有机质含量不同可能影响土壤微生物群落的代谢功能[29].低有机质土壤的分解程度高, 可能是微生物对易分解碳的分解代谢增加, 因此低有机质土壤的易分解碳含量占比更低.
3.2 梯度有机质含量黑土真菌群落生态网络的变化一般来说, 随着生态系统中可用的资源的增多, 生态系统的网络结构也会变得更为复杂[30].本研究中, 相比低有机质土壤生态网络, 高有机质土壤生态网络中真菌的互作关系更紧密(图 3和表 3), 尤其是Sordariomycetes和Mortierellomycotina两个纲类与其他纲类的连接数明显增多.为更好地适应环境变化, 微生物优势功能类群的转变会带来更加紧密的互作关系[31].从真菌群落在纲类水平的组成上来看(图 2), Sordariomycetes和Mortierellomycotina两个纲类的相对丰度随着黑土有机质含量的减少而显著降低(P < 0.05), 这表明优势群落发生了变化.Schimel等[32]的研究认为, 环境胁迫导致的资源可利用性的降低既会直接导致微生物群落组成的变化, 又改变了微生物的协作与竞争关系.土壤有机质含量差异可能导致真菌生存策略发生变化, Sordariomycetes和Mortierellomycotina纲下的类群可能在有机碳含量更高的土壤竞争能力更强.有研究发现[33], Mortierella在可分解碳含量高的土壤中占优势地位.然而, 生态网络分析技术是一种基于数学模型分析生态系统中潜在作用关系的方法, 存在一定的局限性, 进一步的实验验证是很有必要的[34].
本文进一步研究发现与高有机质土壤生态网络相比, 低有机质土壤生态网络中真菌与有机碳官能团结构的联系更紧密.低有机质土壤生态网络中盘菌纲等物种与有机碳官能团显著负相关, 尤其与LOC的相关性更强.Yu等[35]的研究表明, 有机质含量较低的落叶阔叶森林中与不稳定碳(例如淀粉、果胶、半纤维素和纤维素)降解相关的真菌功能基因的相对丰度显著高于有机质含量高的常绿阔叶森林, 并且参与碳循环的功能基因相对丰度显著与土壤不稳定有机碳呈负相关.在分子生态网络中, 与碳结构分子相关的OTU均属于粪囊菌纲、盘菌纲、被孢毛霉纲和座囊菌纲等.其中盘菌纲是木材腐朽菌, 它能全部或部分降解木材中的木质素、纤维素和半纤维素[36].Mortierellomycotina是腐生真菌, 它可以将各种碳源转化为脂质, 并积累大量脂肪酸[33].网络中与有机碳结构显著相关的真菌类群可能在不同有机质含量土壤碳的周转中发挥重要作用.然而, 这些类群具体通过何种转换形式影响着有机碳官能团结构的变化, 还需要进一步的实验研究.
3.3 有机质梯度黑土中有机碳官能团结构变化对真菌群落的影响CCA分析表明SOC和TN显著影响了有机质梯度黑土真菌群落变化.Lauber等[37]的研究发现真菌群落结构与土壤养分状况显著相关.研究表明土壤有机碳是微生物群落构建的关键驱动因子[34, 38, 39].本文基于随机森林模型分析发现, 有机碳含量及其结构变化是影响真菌网络最重要的土壤理化因子.胡晓婧等[40]对不同纬度的农田黑土真菌网络参数和环境变量进行相关性分析, 发现pH和TN是影响3个地区土壤真菌网络结构的重要因子.这可能是不同施肥处理改变了微生物的功能结构, 加速了土壤养分周转[41], 削弱了土壤有机质含量差异而导致的真菌群落对碳资源限制的响应.随机森林模型分析还表明LOC对低有机质土壤真菌互作关系的贡献更大.Li等[42]的研究发现施肥管理后的人工林土壤有机质含量约为2% ~3%, 其有机质结构变化解释了表层土壤中真菌群落变化的63.2%, 其中O-Alkyl C含量变化显著影响纤维素降解真菌群落功能的变化.因此, 低有机质土壤中LOC含量的变化对真菌群落的结构与功能可能产生更大的影响.
4 结论本研究针对我国东北5种梯度有机质含量的农田黑土, 利用ITS高通量测序和13 C-NMR技术, 分析了不同有机质梯度黑土真菌的相互作用及其与有机碳官能团结构的关系.研究表明有机质含量越低, 土壤中烷氧碳等易分解有机碳组分所占比例越小, 有机质分解程度越高.高有机质含量黑土真菌互作更紧密, 低有机质含量黑土真菌与LOC有机碳结构联系更紧密.土壤有机碳官能团变化是影响真菌群落互作的主要因素, 其中LOC对低有机质含量黑土真菌互作贡献更高.因此, 在全球土壤碳损失日益严重的背景下, 碳资源的限制, 特别是LOC的减少, 可能会降低土壤真菌群落的稳定性和多功能性.由于该结果是基于网络分析得到的, 未来需要进一步通过实验进行验证.
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