湿地是自然界最富生物多样性的生态系统和人类最重要的生存环境之一, 蕴藏着丰富的自然资源, 具有调节水文、净化污染和维护生物多样性等生态功能, 与森林、海洋并列称为全球三大生态系统^{[1, 2]}.近年来, 改变湿地用途所产生的环境效应一直是退化生态系统研究的热点问题之一^[3].充分证据表明, 不合理的开发利用湿地是造成湿地面积缩小、生物多样性丧失和改变湿地土壤正常发育过程的主要原因^{[4, 5]}, 如何协调资源开发与生态保护的关系是维护沿江湿地生态平衡和促进当地经济可持续发展的关键问题^[6].土壤微生物是生态系统中的分解者, 对维持生态系统平衡具有不可替代的作用^[7].土壤微生物在地下生活着巨大多样性对塑造整体生物多样性和生态系统功能有着重要的影响, 尤其与维持包括养分循环在内的多个生态系统功能密切相关^[8].它们具有复杂的微生物网络关系, 在复杂性更高的生态系统中, 土壤微生物群落多样性对生态系统功能的贡献更高^[9].深入研究土壤微生物群落多样性以及对环境变化的响应有助于科学管理湿地资源和促进湿地健康发展.

松花江下游是我国三江平原湿地的集中分布区和粮食生产基地, 在维护区域生态平衡和保障国家粮食安全等方面发挥着重要的作用^[10].自20世纪50年代末, 松花江流域进入大规模开发时期, 垦殖、采砂和筑渠等人类活动使沿江湿地的土地利用方式发生改变, 湿地面积减少一半以上^[11].近20年来, 湿地的保护与恢复得到了国家和地方政府的重视, 生境状况逐年好转, 但与60~70年代相比, 仍然面临湿地植被覆盖率低、水土流失严重以及生物多样性下降等生态系统退化问题^[12].解决湿地生态系统退化问题关键在于保护和发展生物多样性、提高生境质量, 并使其具有较好的可自我持续性^[13].土壤细菌是土壤微生物中数量最多、分布最广和群落关系与功能最复杂多样的生物, 土壤环境微小变化可使土壤细菌群落结构和功能发生显著变化, 同时这种变化能够反作用于无机环境并传递给整个生态系统^[14].因此, 土壤细菌不仅能够为土壤提供一种天然的保护作用促进退化生态系统的恢复, 其多样性及异质性还常常用于表征土壤肥力和预测生态环境风险^[15].土地利用变化可以使土壤理化性质发生改变而导致土壤细菌群落结构发生变异, 但土壤细菌群落的结构与功能的变化趋势以及如何影响湿地生态系统仍不明确^[16].因此, 本研究通过分析不同土地利用方式下的土壤细菌群落多样性和功能的差异, 揭示不同土地利用方式对松花江下游沿江湿地土壤生态系统带来的影响, 以期为制定退化湿地修复方法、合理利用和科学管理湿地资源提供理论依据和基础数据.

研究区域属于小兴安岭山地与三江平原生态过渡带, 位于我国松花江下游的黑龙江省黑鱼泡自然保护区内(46°57′55″~47°14′7″N, 130°24′51″~130°57′38″E), 温带大陆性季风气候, 海拔65~81 m, 多年平均降雨量为548 mm, 多年平均蒸发量为1 155 mm, 多年平均无霜期130 d左右.全年有5个月平均气温在0℃以下, 多年平均气温2.1℃, 最高气温出现在7月份, 平均气温21.2℃, 最低气温出现在1月, 平均气温-19.4℃.冻融期从10月中旬至次年的5月中旬, 冰封期150 d, 湿地冻层深80~125 mm.保护区内植被以湿生草本和灌木植被为主, 间有人工林分布.主要植被有卷边柳(Salix siuzevii)、松江柳(Salix sungkianica)、蒿柳(Salix viminalis)、鼓囊苔草(Carex lehmanii)、菖蒲(Acorus calamus Linn)和小叶章(Deyeuxia angustifolia)等.

2017年6月, 在坡度较小(5°)和坡向一致且包含多种土地利用类型的沿江湿地中, 选择天然湿地(natural wetland, NW)、水稻田(paddy field, PF)、玉米田(corn field, CF)、采沙迹地(sand mining slash, SMS)和人工恢复湿地(restoration wetland, RW)这5种土地利用类型开展实验研究, 共设置15块实验样地.其中, 农田于2011年始开荒耕种至今, 采砂迹地于2017年5月停止采砂, 恢复湿地于2017年6月通过平整废弃采砂场低洼地, 人工移栽小叶章和鼓囊苔草形成.样地具体信息如表 1.

表 1 (Table 1)

表 1 样地的具体信息 Table 1 Location of the sampling sites 土地利用类型 样地编号 当前植被 水文连通性 海拔高度/m NW NW-1、NW-2和NW-3 鼓囊苔草(Carex lehmanii)和小叶章(Deyeuxia angustifolia) 好 68 PF PF-1、PF-2和PF-3 水稻(Oryza sativa) 差 70 CF CF-1、CF-2和CF-3 玉米(Zea mays) 差 71 SMS SMS-1、SMS-2和SMS-3 无 一般 70 RW RW-1、RW-2和RW-3 小叶章(Deyeuxia angustifolia)和鼓囊苔草(Carex lehmanii) 好 69

表 1 样地的具体信息 Table 1 Location of the sampling sites

于2018年7月进行土壤样品采集, 每块实验样地内随机布设1个2 m×2 m的小样方, 使用土钻按照5点采样法在样方内取表层约0~10 cm深度的土壤样品, 更换样地取样时用去离子水对土钻进行深度清洗.每个取样点中取2份土壤样品, 1份约重0.5 kg, 装入自封袋中并置于4℃电子恒温箱中.另1份约重0.05 kg, 将来自同一样方的5份土样充分混合, 去除杂草与石块后装入无菌自封袋中, 储存于-80℃的干冰保温箱中, 用于提取土壤细菌基因组DNA.共获取15个土样用于测定土壤细菌和75份土样用于测定土壤化学性质^[17].

土壤pH值采用土:水=1:2.5浸提法, 使用pH分析仪测定(HQ30d, HACH, U.S); 土壤水分含量(Moisture content, MC)采用重量分析法; 总碳(Total carbon, TC)和总氮(Total nitrogen, TN)使用碳氮自动分析仪(ElementarVarioMaxCN, Elementar, 德国)测定; 全磷采用碱熔-钼锑抗分光光度法; 总有机碳(total organic carbon, TOC)采用总有机碳分析仪(TOC-CPH, SHIMADZU, 日本)测定^[18]; 碱解氮(Available nitrogen, AN)含量采用碱解蒸馏法测定; 碳氮比为土壤全碳与全氮的比值.

使用E.Z.N.A.^ⓇSoil DNA提取试剂盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S)抽提基因组DNA, 采用通用引物(338F/806R)对细菌16S rDNA的V4-V5区域进行PCR扩增^[19].PCR实验采用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase, 20 μL反应体系:4 μL FastPfu缓冲液循环5次, 2.5 mmol ·L^-1 dNTPs 2 μL, 5 μmol ·L^-1的上游引物0.8 μL, 5 μmol ·L^-1的下游引物0.8 μL, FastPfu聚合酶0.4 μL, BSA 0.2 μL, Template DNA 10 ng, 补双蒸水至20 μL.PCR仪:ABI GeneAmp^Ⓡ 9700型.细菌的PCR反应参数:① 95℃持续3 min; ② 27次循环(加热温度为95℃持续30 s; 退火温度为55℃持续30 s; 72℃持续45 s); ③ 72℃持续10 min, 然后控制在10℃直到机器停止^[20].全部样本严格按照正式实验条件进行, 每个样本3个重复, 将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测, 使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司)切胶回收PCR产物.等量混合纯化扩增产物, 使用Illumina MiSeq平台构建MiSeq文库测序.

在美吉公司的I-Sanger生物云平台上使用QIIME (vesion 1.17, http://qiime.org)软件对测序数据进行数据分析, 在相似水平为97%条件下划分运算分类单位(operational taxonomic units, OTU), 使用Usearch软件(vssion 7.1)去除嵌合体, 采用RDP (ribosomal database project) classifier贝叶斯算法对OTU代表序列进行分类学分析, 置信度阈值为0.7, 比对数据库(Silva 132/16s bacteria).按照最小样品序列数进行抽平, 计算α多样性指数(Ace、Chao1、Shannon和Simpson), 采用Mothur软件(version v.1.30.1)稀释性分析, 利用R语言工具制作曲线图和文氏图, 采用主坐标分析(PCoA)计算beta多样性距离矩阵, 使用非参数因子克鲁斯卡尔-沃利斯秩和检验检测显著差异的优势物种^[21].土壤细菌功能预测是基于Silva数据库的16S分类谱系转化为京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)数据库中原核生物的分类谱系, 对16S rRNA基因序列进行功能注释^[22].使用SPSS软件(IBM SPSS Statistics 22 for Windows)进行单因素方差分析的Duncan多重比较和置换检验统计分析.

由表 2可见, 沿江湿地不同土地利用类型的土壤理化性质差异显著(P < 0.05).垦殖或开采矿砂均造成土壤pH的显著升高(P < 0.05), 且采砂迹地的土壤pH显著高于农田.天然湿地的含水量显著高于恢复湿地(P < 0.05), 灌溉造成稻田土壤含水量显著高于湿地(P < 0.05), 采砂迹地的土壤含水量和保水能力最低.天然湿地的总碳、有机碳、总氮和总磷等土壤养分指标含量最高, 采砂迹地的养分含量最低, 农田土壤养分含量介于湿地与采砂迹地之间.稻田土壤的碱解氮含量最高, 分别是NW、CF、SMS、RW的1.80、1.09、49.96、7.03倍.采砂迹地和湿地的土壤碳氮比较高, 而农田和恢复湿地相对较低.

表 2 (Table 2)

表 2 沿江湿地不同土地利用类型的土壤理化性质比较1) Table 2 Comparison of soil physicochemical properties in different land use types of riparian wetlands 土地利用类型 pH 含水量(MC) /% 总碳(TC) /g·kg-1 有机碳(TOC) /g·kg-1 总氮(TN) /g·kg-1 碱解氮(AN) /mg·kg-1 总磷(TP) /mg·kg-1 碳氮比 (C/N) NW 5.52±0.06e 38.72±2.65b 53.17±8.50a 44.24±5.17a 4.18±0.30a 46.05±4.55c 29.76±2.80a 12.68±1.46b PF 5.77±0.07d 45.15±2.31a 21.00±2.02b 19.83±1.74b 2.51±0.23b 82.97±2.97a 15.66±2.23b 8.42±1.00c CF 6.21±0.09c 20.67±5.20d 19.89±2.97b 15.88±1.07c 2.12±0.21c 76.35±3.34b 12.04±1.11c 9.44±1.62c SMS 6.80±0.07a 10.01±3.28e 1.56±0.80d 1.22±0.60e 0.10±0.02e 1.73±0.93e 4.09±1.92d 15.78±6.71a RW 6.70±0.08b 28.56±1.66c 8.29±1.77c 5.79±1.45d 0.97±0.21d 11.81±3.89d 12.38±1.10c 8.57±0.98c 1)不同小写字母表示不同土地利用类型间差异显著(P≤0.05), 最大的平均数标记为a, 表中数据为平均值±标准差(n=15)

表 2 沿江湿地不同土地利用类型的土壤理化性质比较1) Table 2 Comparison of soil physicochemical properties in different land use types of riparian wetlands

由表 3可见, 通过MiSeq高通量测序过滤低质量测序后, 5种土地利用类型的15个土壤样品共获得654 849条修剪序列, 总碱基数为286 515 241 bp, 平均碱基长度为437.53 bp.

表 3 (Table 3)

表 3 测序数据统计 Table 3 Sequencing data statistics 样地编号 序列数/条 碱基数/bp 平均长度/bp 短序列长度/bp 长序列长度/bp NW-1 44 851 19 584 966 436.67 300 496 NW-2 45 652 19 999 757 438.09 272 496 NW-3 32 518 14 210 814 437.01 272 489 PF-1 49 515 21 638 350 437.01 305 469 PF-2 47 622 20 860 423 438.04 268 547 PF-3 42 207 18 466 177 437.51 267 490 CF-1 40 779 17 769 733 435.76 340 487 CF-2 40 795 17 695 249 433.76 318 556 CF-3 47 933 21 015 651 438.44 267 511 SMS-1 39 191 17 182 756 438.44 298 491 SMS-2 45 032 19 803 762 439.77 280 491 SMS-3 40 504 17 750 009 438.23 342 539 RW-1 48 334 21 136 065 437.29 312 487 RW-2 44 285 19 443 834 439.06 278 485 RW-3 45 631 19 957 695 437.37 298 535 平均值 43 657 19 101 016 437.53 294 505

表 3 测序数据统计 Table 3 Sequencing data statistics

采用样本抽样序列数与它们所代表的OTU数目构建稀释性曲线可以看出[图 1(a)], 15个土壤样品的稀释性曲线均趋于平坦, 更多的测序数据对发现新的OTU数目贡献较小, 表明测序数据合理.全部样地的土壤细菌OTU分布数目为4290个[图 1(b)], 其中, 各类型样地共有的OTU分布数目为987个, 约占23.0%.恢复湿地独有的土壤细菌OTU分布数目273个, 约占全部的6.4%.天然湿地独有的土壤细菌OTU分布数目最少, 分别在占全部2.1%.水稻田、玉米田和采沙场土壤独有的土壤细菌OTU分布数目居中, 分别占全部的3.0%、2.6%和2.2%.各类型样地土壤细菌OTU分布数目由多到少依次为:RW、NW、SMS、PF和CF [图 1(c)].

图 1

Fig. 1

(a)稀释性曲线; (b)OTU分布; (c)各土地类型的OTU数量 图 1 不同土地利用类型样地抽样序列数和所代表土壤细菌的OTUs数量比较 Fig. 1 Comparison of sampling sequence number and number of OTUs in different land use types

比较不同土地利用类型土壤样品细菌群落α多样性的结果表明(表 4), 自然湿地、恢复湿地和玉米田三者之间的Ace指数和Chao1指数差异显著(P < 0.05), 水稻田、采砂迹地与恢复湿地之间的Ace指数和Chao指数差异显著(P < 0.05), 恢复湿地与玉米田、采砂迹地的Shannon指数差异显著(P < 0.05), 玉米田与自然湿地、恢复湿地、水稻田的Shannon指数差异显著(P < 0.05), 玉米田与自然湿地、水稻田的Simpson指数差异显著(P < 0.05).

表 4 (Table 4)

表 4 不同土地利用类型样地的土壤细菌α多样性指数1) Table 4 Soil bacterial α-diversity indexes in different land use types 土地利用类型 Ace指数 Chao1指数 Shannon指数 Simpson指数 NW 2 394.60±222.92b 2 411.25±217.27b 6.45±0.22ab 0.005 6±0.004 4b PF 2 147.68±201.78bc 2 186.52±236.16bc 6.37±0.06ab 0.005 5±0.000 2b CF 1 582.56±325.67c 1 599.35±334.46c 5.69±0.19c 0.012 2±0.003 6a SMS 1 984.38±555.40bc 1 992.53±574.02bc 5.99±0.50bc 0.007 1±0.003 3ab RW 3 197.72±73.75a 3 227.05±48.98a 6.62±0.10a 0.007 2±0.003 4ab 1)不同小写字母表示不同土地利用类型间差异显著(P≤0.05), 最大的平均数标记为a, 表中数据为平均值±标准差(n=3)

表 4 不同土地利用类型样地的土壤细菌α多样性指数1) Table 4 Soil bacterial α-diversity indexes in different land use types

对OTU的代表序列在细菌门划分水平上进行分类学分析.结果表明, 15个土壤样品中检测出的土壤细菌可划分为40门、105纲、258目、421科、802属和1673种.由图 2(a)可以看出, 变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)为各样地共有的主要菌门(相对丰度>1%), 蓝菌门(Cyanobacteria)是稻田土壤中的主要菌门, Patescibacteria是稻田、玉米田和恢复湿地土壤中的主要菌门, 硝化螺旋菌门(Nitrospirae)是天然湿地、稻田和采砂迹地土壤中的主要菌门, 己科河菌门(Rokubacteria)是天然湿地和采砂迹地土壤中的主要菌门, 在各样地相对丰度 < 1%的菌门合为其它菌门.采用皮尔森距离算法的主坐标分析比较不同利用类型样地土壤细菌群落的相似性和差异关系.如图 2(b)所示, 水稻田和玉米田的土壤细菌群落位于PC1轴的负半轴, 采砂迹地、天然湿地和恢复湿地的土壤细菌群落位于PC1轴的正半轴.水稻田与天然湿地的土壤细菌群落位于PC2轴的正半轴, 采砂迹地、玉米田和恢复湿地的土壤细菌群落位于PC1轴的负半轴.ANOSIM组间差异检验表明[图 2(c)], 恢复湿地与采砂迹地的土壤细菌群落结构相似, 它们与其它样地土壤细菌的群落结构差异显著(P < 0.05).

图 2

Fig. 2

(a)分类组成; (b)门水平上的主坐标分析; (c)ANOSIM组间差异检验 图 2 不同土地利用类型样地中土壤细菌群落的结构柱状图和主坐标分析 Fig. 2 Structure histogram and principal coordinate analysis of bacterial communities in different land use types

利用非参数因子克鲁斯卡尔-沃利斯秩和检验分析不同土地利用类型土壤细菌各分类水平的显著差异特征(LDA阈值4.0), 并构建群落进化分枝图(图 3)^[22].结果表明, 在门分类水平上, 水稻田中拟杆菌门、玉米田中变形菌门和芽单胞菌门以及采砂迹地中放线菌门相比较其它土地类型具有显著优势.在纲分类水平上, 稻田中的厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、玉米田的变形菌纲(α-Proteobacteria)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)、芽孢杆菌纲(Bacilli)和采砂迹地中的放线菌纲(Actinobacteria)为各土地类型显著优势纲.在目分类水平上, 水稻田的厌氧绳菌目(Anaerolineales)、β-Proteobacteriales、拟杆菌目(Bacteroidales)、玉米田的黄色单胞菌目(Xanthomonadales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、芽单胞菌目(Gemmatimonadales)、芽孢杆菌目(Bacillales)和采砂迹地中的Pyrinomonadales、Solirubrobacterales、Gaiellales、Rokubacteriales为各土地类型的显著优势目.在科分类水平上, 恢复湿地中的微球菌科(Micrococcaceae)、玉米田中的罗丹诺杆菌科(Rhodanobacteraceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)、水稻田中厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)和采砂迹地中的Pyrinomonadaceae、Gaiellaceae为各土地类型的显著优势科.在属分类水平上, 恢复湿地的Pseudarthrobacter、玉米田的Rhodanobacter 、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和采砂迹地的Gaiella为各土地类型的显著优势属.

图 3

Fig. 3

图 3 不同土地利用类型样品中土壤细菌的进化分枝(LAD阈值4.0) Fig. 3 Cladogram of soil bacterial community for different land use types (LAD score=4.0)

不同土样中的OTUs在KEGG一级功能代谢通路的注释信息及各功能丰度信息见表 5, 土壤细菌群落包括6类一级代谢通路, 样本中各功能基因的相对丰度从高到低依次为:新陈代谢(metabolism)、环境信息处理(environmental information processing)、遗传信息处理(genetic information processing)、细胞过程(cellular processes)、人类疾病(human diseases)和有机系统(organismal systems).其中, 水稻田的遗传信息处理功能显著高于其它样地(P < 0.05), 采砂迹地的环境信息处理功能显著高于其它样地(P < 0.05), 采砂迹地的遗传信息处理和人类疾病功能显著低于其它样地(P < 0.05).玉米田与采砂迹地之间的有机系统功能差异显著(P < 0.05), 表现为:CF>SMS.

表 5 (Table 5)

表 5 土壤细菌群落的一级功能代谢通路在不同样地中的相对丰度信息1) Table 5 Relative abundance information of first-level functional metabolic pathways of soil bacterial community in different land use types 土地利用类型 新陈代谢 遗传信息处理 环境信息处理 细胞过程 有机系统 人类疾病 NW 0.631 0±0.012 5a 0.112 2±0.002 8b 0.184 0±0.005 1b 0.043 1±0.004 8a 0.010 8±0.000 3ab 0.017 5±0.001 0a PF 0.616 6±0.000 9a 0.121 2±0.001 9a 0.184 6±0.003 2b 0.048 2±0.000 3a 0.010 8±0.000 5ab 0.017 4±0.000 3a CF 0.628 8±0.006 8a 0.115 9±0.002 2b 0.180 7±0.007 9b 0.043 9±0.002 1a 0.011 3±0.000 8a 0.017 7±0.000 6a SMS 0.618 9±0.005 3a 0.105 5±0.003 5c 0.204 1±0.006 4a 0.044 2±0.001 8a 0.010 1±0.000 6b 0.015 8±0.000 6b RW 0.621 2±0.008 4a 0.115 1±0.002 6b 0.188 1±0.005 2b 0.046 0±0.003 1a 0.010 8±0.000 4ab 0.017 4±0.000 6a 1)不同小写字母表示不同土地利用类型间差异显著(P≤0.05), 最大的平均数标记为a, 表中数据为平均值±标准差(n=3)

表 5 土壤细菌群落的一级功能代谢通路在不同样地中的相对丰度信息1) Table 5 Relative abundance information of first-level functional metabolic pathways of soil bacterial community in different land use types

不同样地土壤细菌群落包括46类二级代谢通路, 其中主要的二级代谢通路(功能基因序列相对丰度>1%)包括19类(表 6).稻田与玉米田之间的碳水化合物代谢功能和次生代谢物合成功能差异显著(P < 0.05), 表现为:PF>CF.稻田和玉米田的核苷酸代谢功能显著高于其它样地(P < 0.05).稻田中的能量代谢、细胞生长与死亡功能显著高于其它样地(P < 0.05).稻田的脂肪代谢功能显著低于其它样地(P < 0.05).采砂迹地的复制和修复、辅酶和维生素代谢功能显著低于其它样地(P < 0.05).玉米田和采砂迹地中的氨基酸代谢功能显著高于天然湿地和恢复湿地, 且天然湿地和恢复湿地的相对丰度氨基酸代谢功能显著高于稻田(P < 0.05).天然湿地中的萜类和聚酮化合物代谢功能显著高于其它样地(P < 0.05).稻田中的外源生物降解与代谢及其他氨基酸代谢功能相对丰度显著低于天然湿地、玉米田和采砂迹地(P < 0.05).稻田中的聚糖生物合成与代谢功能显著高于天然湿地、玉米田和采砂迹地(P < 0.05).稻田中的转化、折叠、分类和降解功能显著高于天然湿地、恢复湿地和玉米田, 且该功能在天然湿地、恢复湿地和玉米田中显著高于采砂迹地(P < 0.05).采砂迹地中的膜传输功能显著高于其它样地(P < 0.05).稻田与恢复湿地中的细菌性传染病显著高于采砂迹地(P < 0.05).

表 6 (Table 6)

表 6 土壤细菌群落的二级功能在不同样地中的相对丰度信息1) Table 6 Relative abundance information of Secondary functional metabolic pathways of soil bacterial community in different land use types 二级功能类型 天然湿地 (NW) 稻田 (PF) 玉米田 (CP) 采砂迹地 (SMS) 恢复湿地 (RW) 碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism) 0.126 6±0.003 3ab 0.129 3±0.002 0a 0.124 0±0.003 0b 0.125 4±0.002 2ab 0.126 2±0.001 4ab 脂肪代谢(lipid metabolism) 0.039 2±0.002 8a 0.033 7±0.000 1b 0.038 4±0.000 6a 0.037 9±0.001 0a 0.037 4±0.001 7a 辅酶和维生素的代谢(metabolism of cofactors and vitamins) 0.070 1±0.001 0a 0.071 6±0.002 2a 0.070 8±0.000 5a 0.066 2±0.001 4b 0.070 5±0.000 6a 能量代谢(energy metabolism) 0.074 9±0.004 7b 0.082 3±0.002 9a 0.070 2±0.000 3b 0.070 5±0.001 1b 0.075 0±0.002 7b 核苷酸代谢(nucleotide metabolism) 0.049 2±0.000 1b 0.052 0±0.000 2a 0.051 4±0.000 8a 0.047 3±0.000 8c 0.049 7±0.001 0b 次生代谢物合成(biosynthesis of other secondary metabolites) 0.010 6±0.000 6ab 0.009 7±0.000 6a 0.011 7±0.001 0b 0.010 7±0.000 5ab 0.010 4±0.000 7ab 氨基酸代谢(amino acid metabolism) 0.122 3±0.004 2b 0.114 6±0.001 4c 0.129 9±0.003 2a 0.128 8±0.002 0a 0.122 3±0.003 6b 萜类和聚酮化合物代谢(metabolism of terpenoids and polyketides) 0.042 3±0.002 1a 0.035 0±0.009b 0.036 9±0.002 8b 0.036 2±0.001 1b 0.036 9±0.001 3b 外源生物降解与代谢(xenobiotics biodegradation and metabolism) 0.047 4±0.004 4a 0.039 6±0.000 6b 0.045 5±0.001 1a 0.047 2±0.002 2a 0.044 0±0.002 8ab 其他氨基酸代谢(metabolism of other amino acids) 0.024 8±0.001 8a 0.022 8±0.006b 0.025 7±0.000 2a 0.025 5±0.000 6a 0.024 4±0.001 1ab 聚糖生物合成与代谢(glycan biosynthesis and metabolism) 0.023 6±0.001 0b 0.026 0±0.000 7a 0.024 3±0.000 4b 0.023 3±0.000 9b 0.024 5±0.000 9ab 转化(translation) 0.043 4±0.000 8b 0.048 2±0.007a 0.045 0±0.000 5b 0.041 3±0.001 2c 0.045 0±0.001 0b 膜传输(membrane transport) 0.105 8±0.006 7b 0.097 7±0.003 9b 0.103 6±0.007 0b 0.125 7±0.008 6a 0.104 7±0.004 2b 信号传导(signal transduction) 0.078 2±0.010 8a 0.086 9±0.000 9a 0.077 0±0.002 5a 0.078 4±0.004 5a 0.083 4±0.007 0a 细胞运动(cell motility) 0.020 3±0.003 5a 0.023 1±0.000 5a 0.021 1±0.001 5a 0.021 7±0.001 1a 0.022 8±0.002 4a 折叠、分类和降解(folding, sorting and degradation) 0.023 3±0.001 0b 0.025 3±0.000 4a 0.023 3±0.003b 0.021 5±0.000 8c 0.023 5±0.000 8b 复制和修复(replication and repair) 0.043 5±0.001 1a 0.045 7±0.001 0a 0.045 6±0.001 5a 0.040 8±0.001 5b 0.044 3±0.001 1a 细胞生长与死亡(cell growth and death) 0.016 2±0.001 4b 0.018 8±0.000 5a 0.016 5±0.000 7b 0.015 9±0.000 6b 0.016 6±0.000 7b 细菌性传染病(bacterial infectious disease) 0.011 3±0.000 9ab 0.011 7±0.000 3a 0.011 3±0.000 7ab 0.010 1±0.000 6b 0.011 5±0.000 6a 1)不同小写字母表示不同土地利用类型间差异显著(P≤0.05), 最大的平均数标记为a, 表中数据为平均值±标准差(n=3)

表 6 土壤细菌群落的二级功能在不同样地中的相对丰度信息1) Table 6 Relative abundance information of Secondary functional metabolic pathways of soil bacterial community in different land use types

土壤细菌α多样性与土壤理化性质的相关性分析表明(表 7), 土壤含水量与Shannon指数显著正相关(P < 0.05), 土壤碱解氮与Ace指数和Chao1指数显著负相关(P < 0.05).这表明土壤碱解氮对土壤细菌物种数量有显著抑制作用, 土壤含水量对土壤细菌群落丰富度和均匀度均有显著促进作用.

表 7 (Table 7)

表 7 土壤细菌α多样性指数与土壤理化性质的相关分析1) Table 7 Correlation coefficients between soil bacterial α-diversity indices and soil physicochemical properties 多样性指数 pH 含水量 (MC) 总碳 (TC) 有机碳 (SOC) 总氮 (TN) 碱解氮 (AN) 总磷 (TP) 碳氮比 (C/N) Ace 0.224 0.251 0.046 -0.059 -0.074 -0.555* 0.216 -0.345 Chao1 0.216 0.264 0.044 -0.057 -0.069 -0.540* 0.216 -0.365 Shannon -0.140 0.527* 0.228 0.217 0.199 -0.220 0.395 -0.342 Simpson 0.200 -0.354 -0.236 -0.214 -0.166 0.159 -0.218 0.059 1)*表示P < 0.05

表 7 土壤细菌α多样性指数与土壤理化性质的相关分析1) Table 7 Correlation coefficients between soil bacterial α-diversity indices and soil physicochemical properties

土壤细菌群落结构与土壤理化性质的冗余分析见图 4, 结果表明, 第一轴和第二轴累积解释变异量达到61.34%, 两个轴能够反映土壤环境因子对土壤细菌群落结构的影响.置换检验的结果显示, 不同土地利用类型土壤pH (r²=0.528, P=0.011)、含水量(MC, r²=0.474, P=0.026)、碱解氮(AN, r²=0.453, P=0.038)和碳氮比(C/N, r²=0.386, P=0.042)为主要影响细菌群落变化的环境因子.

图 4

Fig. 4

图 4 环境因子与土壤细菌群落之间的冗余分析 Fig. 4 RDA of soil bacterial community and environmental factors

沿江湿地土壤受季节性水淹影响而特有泥沙交替沉积的结构特征, 在河水的浸泡和冲刷下易侵蚀和剥离.湿地植被对土壤的固定和保护作用与河流侵蚀达成了动态平衡, 形成相对稳定的沿江湿地生境^[23].当沿江湿地的土地利用方式发生变化时, 覆被和土壤理化性状随之发生改变, 进而对土壤微生物多样性产生重要影响.贾远航等比较了会仙岩溶湿地、稻田与旱地土壤细菌多样性, 认为土壤理化性质的改变是造成稻田的土壤细菌多样性指数显著高于天然湿地的主要原因^[24].笔者前期研究垦殖对三江平原沼泽湿地土壤细菌群落多样性的影响同样发现, 垦殖能够显著提高沼泽湿地土壤细菌多样性指数^[25].但本研究表明, 沿江湿地开垦为玉米田造成土壤细菌的α多样性显著降低, 开垦成稻田或开采矿砂使土壤细菌的α多样性降低但不显著.研究结果的差异是由于沿江湿地具有良好的土壤养分条件为土壤细菌创造了适宜的生境, 较高的水文连通性促进上游生境的土壤细菌向湿地快速和长距离的传播, 使沿江湿地的土壤细菌群落Shannon多样性指数高达6.45, 显著高于水文相对闭塞的会仙岩溶天然湿地和三江平原沼泽湿地.不同类型湿地开垦为农田后, 化肥和农药的施用及水文连通性的降低均对土壤细菌产生影响, 使土壤细菌α多样性指数趋同发展.地表水灌溉可能是稻田与沿江湿地土壤细菌α多样性差异不显著的另一原因.采砂迹地的土壤养分条件、含水量等理化指标最低, 与天然湿地的差异显著, 但其土壤细菌α多样性与沿江湿地差异并不显著, 这进一步验证了水文连通性对土壤细菌多样性的关键作用.采砂迹地仿湿地恢复一年显著提高了土壤细菌的丰富度, 但均匀度没有显著变化, 湿地修复过程能够引入了新的菌群为其提供适宜的生境条件, 通常土壤细菌丰富度会显著提升.环境改变与当地土壤细菌群落产生新的互动不断重建原位土壤细菌群落, 抑制了均匀度的显著提高, 湿地修复材料铺设的覆盖度可能是均匀度低的次要影响因素.

目前, 土壤细菌群落的产生和维持机制尚不完全清楚, 但土壤细菌群落组分差异能解释环境变化对原位土壤细菌群落重建产生的影响, 环境条件而非迁入土壤微生物的组成决定了重建土壤微生物群落结构^[26].本研究可看出, 稻田、玉米田、天然湿地与采砂迹地的土壤细菌群落结构差异显著, 表明土地利用方式通过改变环境因子对土壤细菌群落产生了重要的影响.采砂迹地的短期仿湿地恢复没有显著改变土壤细菌群落结构, 且采砂迹地与恢复湿地的优势菌群相似度较高, 表明恢复湿地的土壤细菌群落建立起了与来自采砂迹地土壤相似的细菌群落.尽管土地利用方式发生改变, 土壤细菌α多样性具有显著差异, 但它们还是从相同的群落中进化而来.王娜等^[27]的研究认为, 不同土地利用方式对湿地土壤细菌群落结构具有重要影响, 变形菌门、放线菌门和酸杆菌门均为湿地土壤环境中的优势菌门.李冰等^[28]的研究发现, 酸杆菌门、厚壁菌门和变形菌门中的部分菌群在土壤细菌群落中起着重要的连接作用.这与本研究有许多相似之处, 变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、疣微菌门和厚壁菌门都是湿地土壤环境中的优势菌门, 并且水稻田中拟杆菌门土壤细菌的相对丰度显著高于其它土地类型, 变形菌门和芽单胞菌门的土壤细菌偏向选择较干燥的玉米田土壤环境, 放线菌门的土壤细菌在采砂迹地中的相对丰度具有显著优势.恢复湿地的Pseudarthrobacter、玉米田的Rhodanobacter 、鞘氨醇单胞菌属和采砂迹地的Gaiella对不同土地利用类型湿地具有一定的指示作用.

目前有关湿地土壤细菌群落生态功能的研究鲜见报道.为此本研究通过探明不同土地利用方式对湿地土壤细菌功能的影响, 将土壤细菌16S基因组测序结果进行了PICRUSt功能预测分析.结果表明, 松花江下游沿江湿地不同的土地利用方式使土壤细菌群落结构发生改变, 同时土壤细菌的代谢通路也发生了相应地变化.湿地土壤细菌利用新陈代谢、环境信息处理、遗传信息处理、细胞过程、人类疾病和有机系统这6类生态功能维系生态系统的稳定^[29].其中, 新陈代谢功能基因各类型样地中均占比最大, 表明代谢通路是土壤细菌的核心功能, 这与杨盼等^[30]的研究结果一致.土地利用类型对湿地土壤细菌的环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病和有机系统的功能通路具有一定的影响, 这些功能基因的相对丰度仅在某一生境中发生显著变化, 表明不同的土壤细菌群落可能具有多类一级代谢通路, 土壤细菌的一级代谢通路与土壤细菌群落组成的相关性低.

二级功能层中氨基酸代谢、碳水化合物代谢、膜传输的功能基因相对丰度最高, 合计超过了30%, 表明湿地土壤环境中, 土壤细菌主要参与氨基酸和碳水化合物的代谢及物质传输等活动.氨基酸代谢主要通过脱氨作用、联合脱氨、脱羧作用或转氨作用分解成胺类、α-酮酸及二氧化碳, 与植株氮素的循环息息相关, 碳水化合物代谢与植物体内氮、磷密切相关, 氮、磷的循环与植株碳水化合物的合成与代谢正相关, 这间接说明土壤细菌的丰富度越高越有利于氮磷等物质的迁移和转化^{[31, 32]}.沿江湿地开垦为玉米田时, 土壤细菌的多样性指数显著下降, 表明玉米田的土壤细菌功能群减弱, 但氨基酸的代谢功能基因的相对丰度在玉米田和采砂迹地中显著提高, 碳水化合物代谢功能在水稻田中显著提高, 这一现象可能与生态系统的自我调节机制有关, 物质循环总是在不间断地进行着, 生态系统总是朝着种类多样化、结构复杂化和功能完善化的方向发展, 直到使生态系统达到成熟的最稳定状态为止, 环境遭到持续干扰时, 生态系统很难达到最稳定状态.该研究初步分析了沿江湿地不同土地利用方式土壤细菌功能的差异, 但PICRUSt功能预测也存在其自身数据库的局限性^[33].建议深入研究沿江湿地土壤细菌的功能可结合宏基因组测序等分析手段.

改变沿江湿地的土地利用方式导致了土壤理化性质发生显著变化, 并造成各土地利用类型生境的土壤细菌群落多样性存在显著差异.不同土地利用类型生境具有各自特有的显著优势菌群, 湿地土壤细菌群落变异主要受土壤pH、含水量、碱解氮和碳氮比显著影响, 水文连通性是农田和采砂迹地土壤细菌α多样性维持较高水平的关键因素.各土地利用类型生境土壤细菌的生态功能保持稳定, 在新陈代谢、环境信息处理和遗传信息处理方面功能表现活跃, 使退化生境仍然具有良好的自然恢复潜力.